Fluorescence chlorofylu

Fluorescence chlorofylu je jev luminiscence chlorofylu , když absorbuje světlo, nastává v důsledku návratu molekuly z excitovaného stavu do základního stavu. Je široce používán jako indikátor přeměny fotosyntetické energie u vyšších rostlin , řas a bakterií . Vybuzený chlorofyl ztrácí absorbovanou světelnou energii, plýtvá ji na fotosyntézu (fotochemická přeměna energie nebo fotochemické zhášení), přeměňuje ji na teplo v důsledku nefotochemického zhášení nebo ji emituje ve formě fluorescence. Protože si všechny tyto procesy navzájem konkurují, lze analýzou fluorescence chlorofylu získat představu o intenzitě fotosyntézy a zdravotním stavu rostliny [1] .

Kautského efekt

Po osvícení tmavě adaptovaných listů lze pozorovat rychlý nárůst fluorescence fotosystému II (PSII) následovaný pomalým poklesem. Tento jev poprvé popsali H. Kautsky a A. Hirsch v roce 1931. Efekt byl po svém objeviteli nazván Kautského efekt.

Nárůst fluorescence je způsoben tím, že reakční centra fotosystému II (PSII) přecházejí do „uzavřeného“ stavu. O reakčním centru se říká, že je „uzavřené“, když již není schopno přenášet elektrony. K tomu dochází, když byl předřazený elektronový nosič obnoven a ještě nepřevedl své elektrony na další akceptor elektronů. Uzavření reakčních center snižuje celkovou účinnost fotochemických reakcí (kP), a proto zvyšuje hladinu fluorescence (kF). Náhlý přechod listu z tmavého stavu do světla zvyšuje podíl uzavřených PSII reakčních center a vede ke zvýšení fluorescence během prvních 1-2 sekund. Později fluorescence pomalu slábne, tento proces může trvat několik minut. Pokles je způsoben aktivací „fotochemického zhášení“ a přenosem elektronů z PSII přes ETC chloroplastů do NADP a cyklu fixace uhlíku, stejně jako zahrnutím nefotochemických zhášecích mechanismů , které přeměňují excitační energii na teplo. .

Měření fluorescence

Měření začíná stanovením úrovně fluorescence pozadí , která se měří tak, že se list vystaví krátkému záblesku světla o nízké intenzitě (pro zařízení PAM), nedostatečnému k vyvolání fotochemické reakce (všechna reakční centra jsou otevřená), a proto zcela vede k fluorescence [2] . $F_{0}$

Aby bylo možné použít měření fluorescence chlorofylu k analýze fotosyntézy, musí výzkumníci rozlišovat mezi fotochemickým zhášením a nefotochemickým zhášením (generací tepla). Toho je dosaženo zastavením fotochemických reakcí, což umožňuje výzkumníkům měřit fluorescenci v přítomnosti samotného nefotochemického zhášení. K tomu je rostlina ostře osvětlena silným zábleskem světla nebo po adaptaci na tmu vyvedena na světlo. Dochází k dočasnému uzavření všech reakčních center PSII a energie se nepřenáší podél řetězce nosičů elektronů. Nefotochemické zhášení nemá žádný účinek, pokud je záblesk dostatečně krátký. Při záblesku (nebo po náhlém vystavení rostliny světlu ze tmy) dochází k nasycení reakčních center světlem s přechodem do uzavřeného stavu. Za takových podmínek, kdy nedochází k žádnému fotochemickému zhášení a není-li fotochemické zhášení zanedbatelně malé, dosáhne fluorescence své maximální úrovně, označované jako maximum fluorescence [2] . $F_{m}$

Účinnost fotochemického zhášení, které určuje účinnost PSII, lze posoudit porovnáním se stacionární úrovní fluorescence ve světle a úrovní fluorescence pozadí v nepřítomnosti světla vhodnou pro fotosyntézu. Účinnost nefotochemického kalení se liší v závislosti na různých vnitřních a vnějších faktorech. Jeho zesílení vede ke zvýšení výdeje tepla a snížení . Protože je nemožné úplně zastavit rozptyl tepelné energie, je nemožné měřit fluorescenci chlorofylu při úplné absenci nefotochemického zhášení. Proto vědci používají tmavý adaptační bod ( ), se kterým porovnávají vypočtenou hodnotu nefotochemického zhášení [2] . $F_{m}$ $F_t$ $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{m}^{0))$

Obecné parametry fluorescence

$F_{0}$ : Minimální fluorescence (v relativních jednotkách). Úroveň fluorescence za podmínek, kdy se předpokládá, že všechna reakční centra jsou otevřená (adaptace na tmu).

$F_{m}$ : Maximální fluorescence (v relativních jednotkách). Úroveň fluorescence při záblescích vysoké intenzity. Všechna reakční centra jsou považována za uzavřená.

${F_{0))'$ : Minimální fluorescence (v relativních jednotkách) za podmínek adaptace na světlo. Úroveň fluorescence ozářeného vzorku, která je oproti přítomnosti nefotochemického zhášení snížena. $F_{0}$

${F_{m))'$ : Maximální fluorescence (v relativních jednotkách) za podmínek adaptace na světlo. Úroveň fluorescence vzorku ozářeného saturačními světelnými pulzy, které dočasně pokrývají všechna reakční centra PSII.

${\displaystyle F_{tr))$ : Koncová fluorescence (v relativních jednotkách). Zhášení fluorescence ke konci testu.

$T_{{1/}}$ : Polovina doby náběhu od do . $F_{0}$ $F_{m}$

Parametry návrhu

${\displaystyle F_{v))$ : Proměnná fluorescence. Vypočteno jako = - [3] . ${\displaystyle F_{v))$ $F_{m}$ $F_{0}$

${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ : Poměr proměnné fluorescence a maximální fluorescence. Vypočteno jako . [4] . Jde o měřítko maximální účinnosti PSII (pokud by byla otevřena všechna centra). lze použít k posouzení potenciální účinnosti PSII, když jsou vzorky měřeny za podmínek adaptace na tmu. ${\displaystyle {\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m))))$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

$qP$ : Fotochemické kalení. tento parametr poskytuje hrubý odhad podílu otevřených reakčních míst PSII. Vypočteno jako [5] . ${\frac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ : Účinnost fotochemických reakcí fotosystému II. Vypočteno jako = [6] . Tento parametr udává podíl světla absorbovaného PSII, které bylo použito při fotochemických reakcích. Jako takový může poskytnout míru rychlosti lineárního transportu elektronů, a proto charakterizuje celou fotosyntézu jako celek. $Y_{(II)}$ ${\tfrac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ poskytuje odhad účinnosti fotosyntézy a říká nám , které procesy účinnost ovlivňují. Uzavření reakčních center v důsledku vysoké intenzity světla změní hodnotu . Změny v účinnosti nefotochemického zhášení změní poměr . $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

Praktické použití

Účinnost fotosystému II jako měřítko fotosyntézy

Fluorescence chlorofylu se používá k měření úrovně fotosyntézy, ale v jádru je to přílišné zjednodušení. K měření účinnosti fotochemie PSII lze použít fluorescenci, kterou lze použít k odhadu rychlosti lineárního transportu elektronů vynásobením intenzitou světla. Když však vědci říkají „fotosyntéza“, obvykle mají na mysli fixaci uhlíku . Transport elektronů a fixace CO 2 mají poměrně dobrou korelaci, ale to nemusí být v terénu pozorováno kvůli konkurenčním procesům, jako je fotorespirace , metabolismus dusíku a Mehlerova reakce .

Vztah mezi transportem elektronů a fixací oxidu uhličitého

Současné měření fluorescence chlorofylu a výměny plynů , abychom získali úplný obrázek o tom, jak rostliny reagují na své prostředí, vyžaduje seriózní a sofistikovanou výzkumnou techniku. Jednou z metod je současné měření fixace CO 2 a fotochemických reakcí PSII při různých intenzitách světla za podmínek, které potlačují fotorespiraci . Grafy fixace CO 2 a fotochemických reakcí PSII umožňují vypočítat počet elektronů potřebných pro asimilaci jedné molekuly CO 2 . Na základě tohoto hodnocení je možné odhadnout úroveň fotorespirace . Tato metoda se používá ke zkoumání významu fotorespirace jako fotoprotektivního mechanismu během sucha.

Sobradu (2008) [7] studoval výměnu plynů a fluorescenci chlorofylu v reakci na vysokou intenzitu světla u pionýrských a lesních druhů. V poledne byla měřena výměna plynů listů s měřením celkové úrovně fotosyntézy a mezibuněčné koncentrace CO 2 ( ). Ve stejných listech byly měřeny parametry fluorescence chlorofylu (pozadí ; maximum ; a proměnná, ). Výsledky ukázaly, že navzdory skutečnosti, že pionýrské a lesní druhy pocházejí z různých stanovišť, oba vykazovaly podobnou náchylnost k polední fotoinhibici . $C_{i}$ $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{v))$

Měření úrovně stresu a odolnosti

Fluorescence chlorofylu umožňuje měřit úroveň stresu rostlin. Podle jeho úrovně lze posuzovat míru vystavení abiotickým stresům, protože extrémní teploty, nadměrné osvětlení a sucho negativně ovlivňují metabolismus rostlin. To následně vede k nerovnováze mezi absorpcí světelné energie chlorofylem a využitím této energie v procesu fotosyntézy [8] .

Favaretto a kol. (2010) [9] studovali adaptaci na vysoké světlo u pionýrských a pozdních následných druhů pěstovaných za podmínek 100 % (slunce) a 10 % (stín) normálního světla. Bylo zjištěno, že pokles plného světla je větší u pozdních následných druhů než u pionýrských druhů. Celkově tyto výsledky naznačují, že pionýrské druhy rostou lépe v plném světle než pozdní následné druhy, což naznačuje, že mají vysokou toleranci vůči fotooxidačnímu poškození. ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$
Neocleous a Vasilakakis (2009) [3] zkoumali reakci malin na stres z bóru a soli . Pomocí fluorometru změřili , a . Fluorescence listového chlorofylu významně nezávisela na koncentraci NaCl, když byla koncentrace boru nízká. Když se koncentrace boru zvýšila, fluorescence chlorofylu listů se za stejných podmínek slanosti snížila. Lze konstatovat, že kombinovaný účinek bóru a NaCl na maliny způsobuje toxický účinek ovlivňující fotochemické parametry. $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{v))$

Index dusíkové bilance

Vzhledem ke vztahu mezi obsahem chlorofylu a obsahem dusíku v listech lze obsah chlorofylu použít k detekci nedostatku dusíku v rostlinách. K tomu existuje několik různých metod.

Ukázalo se, že metabolismus dusíku rostlin je možné posuzovat podle hladiny polyfenolů . Pokud je rostlina v optimálních podmínkách, podporuje normální metabolismus a syntézu bílkovin (hlavní forma biologického dusíku), chlorofylu a malého množství flavonoidů (sekundárních metabolitů). Na druhou stranu při nedostatku dusíku dochází ke zvýšené produkci flavonoidů [10] .

Index dusíkové bilance umožňuje vyhodnotit obsah dusíku v přírodních podmínkách výpočtem poměru mezi chlorofylem a flavonoidy.

Měření obsahu chlorofylu

Gitelson (1999) předpokládal: „Vztah mezi fluorescencí chlorofylu při 735 nm a v rozsahu vlnových délek od 700 nm do 710 nm je lineárně úměrný obsahu chlorofylu (s determinačním koeficientem r2 větším než 0,95) a lze jej tedy použít jako přesný indikátor obsahu chlorofylu v listech rostlin. [jedenáct]

Fluorometry

Vývoj fluorometrů učinil z měření fluorescence chlorofylu běžnou metodu ve fyziologii rostlin. Revoluci v analýze fluorescence chlorofylu způsobil vynález techniky pulzní amplitudové modulace (PAM) [ 12 ] [ 13] a objevení se prvního komerčního pulzního fluorimetru nebo PAM-fluorimetru PAM-101 (Walz, Německo ). Modulací amplitudy měřícího světelného paprsku (rozsah mikrosekundových pulzů) a paralelní detekcí excitované fluorescence je možné stanovit relativní výtěžek fluorescence (Ft) v přítomnosti rozptýleného světla. V zásadě to znamená, že fluorescenci chlorofylu lze měřit v terénu i za přímého slunečního záření [2] .

Některé zábleskové fluorimetry mohou určovat jak světelné parametry, tak parametry adaptace na tmu ( Fo , Fm , Fo ', Fm' , Fv / Fm , Y , Ft , Foq ) a mohou vypočítat koeficienty fotochemického zhášení. -fotochemické zhášení (qP, qL, qN, Y(NO), Y(NPQ) a NPQ). Některé fluorometry jsou zcela přenosné a ovládají se jednou rukou.

Vývoj zobrazovacího systému usnadnil stanovení prostorových nehomogenit ve fotosynteticky aktivních vzorcích. Tyto heterogenity se vyskytují v listech rostlin, například v důsledku výrůstků, různých environmentálních stresů nebo infekčního agens. Znalost nehomogenit vzorků je nezbytná pro správnou interpretaci měření fotosyntetické produktivity vzorků. Vysoká kvalita obrazu umožňuje analyzovat jednu buňku nebo dokonce jeden chloroplast, stejně jako oblasti pokrývající celé listy nebo rostliny.

Alternativní přístupy

LIF senzory

Metody založené na Kautského jevu nevyčerpávají celou škálu metod měření fluorescence chlorofylu. Zejména nedávné pokroky v laserem indukované fluorescenci (LIF) poskytují příležitost vyvinout dostatečně kompaktní a účinné senzory pro stanovení fotofyziologického stavu a hodnocení biomasy. Namísto měření celkového fluorescenčního toku takové senzory zaznamenávají optickou hustotu tohoto toku excitovaného silnými nanosekundovými laserovými pulzy. Tato metoda nevyžaduje 15–20 min adaptace na tmu (jako je tomu u metod založených na Kautského jevu [14] ) a umožňuje excitovat vzorek na značnou vzdálenost. Senzory LIF mohou poskytnout rychlé a poměrně dlouhé vyhodnocení.

Viz také

Nefotochemické kalení

Poznámky

↑ Lu Congming, Zhang Jianhua. Účinky vodního stresu na fotochemii fotosystému II a jeho termostabilita v rostlinách pšenice // Oxford Journals: journal. - 1999. - Červenec. Archivováno z originálu 16. června 2016.
↑ 1 2 3 4 Fluorescence chlorofylu – praktický průvodce . jxb.oxfordjournals.org (1. dubna 2000). Datum přístupu: 28. března 2011. Archivováno z originálu 23. dubna 2012.
↑ 1 2 Účinky bóru a slanosti na červené maliny ve Vitro - International Journal of Fruit Science . Informaworld.com (3. prosince 2008). Staženo: 28. března 2011.
↑ Kitajima M., Butler WL Zhášení fluorescence chlorofylu a primární fotochemie v chloroplastech pomocí dibromthymochinonu // Biochim Biophys Acta : deník. - 1975. - Sv. 376 . - str. 105-115 . - doi : 10.1016/0005-2728(75)90209-1 .
↑ Schreiber U., Schliwa U., Bilger W. Kontinuální záznam fotochemického a nefotochemického zhášení fluorescence chlorofylu pomocí nového typu modulačního fluorometru // Photosynth Res : journal. — Sv. 10 . - str. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 .
↑ Genty B., Briantais JM, Baker NR Vztah mezi kvantovým výtěžkem fotosyntetického elektronového transportu a zhášením fluorescence chlorofylu // Biochem Biophys Acta : deník. - 1989. - Sv. 990 . - str. 87-92 . - doi : 10.1016/s0304-4165(89)80016-9 .
↑ Sobrado. Charakteristika listů a denní variace fluorescence chlorofylu v listech vegetace „bana“ v oblasti Amazonie (anglicky) (PDF). (nedostupný odkaz)
↑ Stresová biologie rostlin . personalpages.manchester.ac.uk. Získáno 6. ledna 2017. Archivováno z originálu dne 27. července 2017.
↑ Favaretto a kol. Diferenciální odezvy antioxidačních enzymů u průkopnických a pozdně následných tropických dřevin pěstovaných na slunci a ve stínu : časopis . - 2011. Archivováno 19. září 2012.
↑ A. Cartelat, ZG Cerovic, Y. Goulas, S. Meyer, C. Lelarge, J.-L. Prioul, A. Barbottin, M.-H. Jeuffroy, P. Gate, G. Agati, I. Moya. Opticky hodnocené obsahy listových polyfenolů a chlorofylu jako indikátory nedostatku dusíku v pšenici (Triticum aestivum L. ) : časopis. — Field Crops Research Volume 91, Issue 1, pages 35-49, 2005. Z originálu archivováno 24. září 2015.
↑ Gitelson Anatoly A; Buschmann Claus; Lichtenthaler Hartmut K. Fluorescenční poměr chlorofylu F735/F700 jako přesné měření obsahu chlorofylu v rostlinách // Remote Sensing of Environment: journal. - 1999. - Sv. 69 , č. 3 . - str. 296-302 . - doi : 10.1016/S0034-4257(99)00023-1 .
↑ Schreiber U., Bilger W. a Schliwa U. Kontinuální záznam fotochemického a nefotochemického zhášení fluorescence chloropyllu pomocí nového typu modulačního fluorometru // Drugs : deník. - Adis International , 1986. - Sv. 10 . - str. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 . Archivováno z originálu 21. července 2017.
↑ Schreiber Ulrich. Detekce rychlé indukční kinetiky pomocí nového typu vysokofrekvenčně modulovaného chloropyhll fluorometru // Léky : deník. - Adis International , 1986. - Sv. 9 . - str. 261-272 . - doi : 10.1007/bf00029749 . Archivováno z originálu 3. června 2018.
↑ Praktický PEA : Analyzátor účinnosti zařízení s kontinuálním buzením . - Norfolk: Hansatech Instruments, 2012. - S. 2. Archivováno 7. dubna 2016 ve Wayback Machine Archived copy (odkaz není k dispozici) . Získáno 26. března 2016. Archivováno z originálu 7. dubna 2016. (neurčitý)

Literatura

Lazar. Indukce chlorofylu a fluorescence // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetika : deník. - 1999. - Sv. 1412 . - str. 1-28 . - doi : 10.1016/s0005-2728(99)00047-x .
Lazar. Nárůst fluorescence polyfázového chlorofylu měřený při vysoké intenzitě vzrušujícího světla // Functional Plant Biology : journal . - 2006. - Sv. 33 . - S. 9-30 . - doi : 10.1071/fp05095 .
Lazar. Parametry dělení fotosyntetické energie (anglicky) // Plant Physiology : journal. - Americká společnost rostlinných biologů , 2015. - Sv. 175 . - str. 131-147 . - doi : 10.1016/j.jplph.2014.10.021 .
Kalaji a kol. Experimentální měření světelné emise v rostlinách in vivo: perspektiva věnovaná Davidu Walkerovi // Drugs : deník. - Adis International , 2012. - Vol. 114 . - str. 69-96 . - doi : 10.1007/s11120-012-9780-3 .
Maxwell, K.; Johnson, GN Fluorescence chlorofylu – praktický průvodce (anglicky) // Journal of Experimental Botany : journal. - Oxford University Press , 2000. - Sv. 51 , č. 345 . - S. 659-668 . doi : 10.1093 / jexbot/51.345.659 . — PMID 10938857 .
Murchie a Lawson. Fluorescenční analýza chlorofylu: průvodce osvědčenými postupy a porozumění některým novým aplikacím // Journal of Experimental Botany : journal. - Oxford University Press , 2013. - Vol. 64 , č. 13 . - str. 3983-3998 . - doi : 10.1093/jxb/ert208 .
Heinz Walz GmbH. Chloropylový fluorometr .