Elektroforéza proteinů v polyakrylamidovém gelu je metoda pro separaci směsí proteinů v polyakrylamidovém gelu podle jejich elektroforetické mobility (funkce délky polypeptidového řetězce nebo molekulové hmotnosti , stejně jako složení molekuly proteinu, posttranslační úpravy a další faktory). Tato metoda frakcionace proteinů a peptidů je široce používána v moderní molekulární biologii , biochemii a genetice .
Pro řešení různých problémů a pro různé proteiny a peptidy bylo vyvinuto velké množství modifikací elektroforézy proteinů v polyakrylamidovém gelu. Nejběžnější variantou je proteinová elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného podle Laemmliho ( SDS PAGE ) .
Elektroforetická mobilita biopolymerů v gelu závisí na řadě parametrů. Rychlost migrace je úměrná náboji molekuly a ve volné kapalině migrují molekuly se stejným specifickým nábojem stejnou rychlostí. V případě separace v médiu s tuhou prostorovou matricí dochází k segregaci v důsledku tření o gel. Třecí síla závisí na prostorové konfiguraci molekuly včetně její velikosti. V případě elektroforetické separace nativních proteinů tedy bude pozorován komplexní vzorec jejich distribuce v závislosti na výše uvedených faktorech.
V roce 1970 Laemmli navrhl metodu elektroforetické separace proteinů v polyakrylamidovém gelu v závislosti na molekulové hmotnosti ke studiu procesu sestavení kapsidy bakteriofága T4 [1] . Za tímto účelem byly vzorky před aplikací na gel povařeny v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS) a 2-merkaptoethanolu. Vlivem 2-merkaptoethanolu dochází k obnově disulfidových vazeb, což zabraňuje vyklouznutí denaturovaných polypeptidů a zvýšení jejich mobility. SDS je silný detergent , jeho molekula se skládá z dvanáctičlenného alifatického přímého řetězce a na něj kovalentně vázaného síranu, který má v roztoku záporný náboj.
Při použití popsané metody platí následující předpoklady:
Za těchto podmínek mají všechny polypeptidy stejný specifický náboj a oddělují se inverzně s logaritmem jejich molekulové hmotnosti. Praxe správnost těchto předpokladů v naprosté většině případů potvrzuje.
Pro provádění denaturační elektroforézy v PAAG se používají různé pufrové systémy. Nejběžnějším výchozím systémem je vyrovnávací systém Laemmli. Naprostá většina prací navíc využívá tzv. disk-elektroforézu (z anglického diskontinuální - nespojitý), to znamená, že používají gel sestávající ze dvou částí. Koncentrační gel má pH 6,8 a koncentraci polyakrylamidu od 2 do 8 %. Separační gel má pH v oblasti 8,5-9 a koncentraci polyakrylamidu od 5 do 20 %. Volba hustoty gelu závisí na molekulových hmotnostech studovaných proteinů. Všechny pufry neobsahují anorganické soli, hlavním současným nosičem je v nich glycin . Při pH 6,8 se celkový náboj molekuly glycinu blíží nule. V důsledku toho se pro přenos určitého náboje (který je určen silou proudu v elektroforetickém článku) musí negativně nabité komplexy polypeptidů s SDS pohybovat vysokou rychlostí. Při pH 8,8 získává glycin negativní náboj, v důsledku čehož dochází k prudké inhibici proteinů na hranici koncentračních a separačních gelů (mnohem více nabitých molekul se nyní podílí na přenosu stejného náboje přes jednotkovou plochu, proto, pohybují se nižší rychlostí). Výsledkem toho je koncentrace proteinů na rozhraní gelů, což značně zvyšuje rozlišení metody.
V separačním gelu proteiny migrují v závislosti na délce polypeptidového řetězce, tedy nepřímo úměrné molekulové hmotnosti.
K vizualizaci výsledků elektroforézy se nejčastěji používá barvení proteinů v gelech barvivem Coomassie nebo stříbrem . Pro Western blotting jsou proteiny přeneseny z gelu na nitrocelulózovou membránu.
Ve většině případů stačí získat výsledky elektroforetické separace vizuálním vyhodnocením gelu. Aby však bylo možné získat spolehlivá data a řádně zdokumentovat výsledky, je gel snímán přenosem pomocí vysoce citlivého denzitometru. Hustoměr je ve skutečnosti skener, který patří ke kontrolním a měřícím přístrojům a podléhá ověřování za účelem zjištění a potvrzení, že vlastnosti měřícího přístroje splňují stanovené požadavky. Takové požadavky na denzitometr umožňují spolehlivě určit nejen polohu proteinů v gelu, ale také optickou hustotu proteinové skvrny. Digitalizovaný obraz gelu je zpracován pomocí specializovaného softwaru, který umožňuje spolehlivě určit takové parametry, jako je elektroforetická mobilita proteinu, jeho čistota, množství proteinu ve spotu atd.
Stanovení molekulové hmotnosti proteinůStanovení molekulové hmotnosti studovaného proteinu vyžaduje kalibraci gelu podle molekulových hmotností. Gel je kalibrován proti molekulovým hmotnostem markerových proteinů, které jsou separovány paralelně s testovaným vzorkem. Směsi markerových proteinů jsou dostupné v různých hmotnostních rozmezích. Kalibrace zahrnuje vynesení závislosti relativní elektroforetické mobility (Rf) každého z markerových proteinů na dekadickém logaritmu jejich molekulové hmotnosti. Typicky má závislost formu esovité křivky. Výpočet molekulové hmotnosti studovaného proteinu vzhledem k jeho Rf se provádí metodou regresní analýzy . Výsledky jsou považovány za spolehlivé, pokud rozsah markerových proteinů je alespoň 80 % délky separačního gelu a závislost jejich Rf na logaritmu molekulové hmotnosti je lineární (R2 > 0,95) . To znamená, že pro výpočty se používá pouze ta část kalibrační křivky, která pokrývá elektroforetickou mobilitu studovaného proteinu.
Citlivost metody SDS-PAGE podle Laemmliho je nepřímo úměrná molekulové hmotnosti proteinu. Například v rozsahu 10-20 kDa je možné oddělit proteiny, které se liší pouze o 0,1 kDa (rozdíl je pouze jeden aminokyselinový zbytek ). K dosažení uspokojivých výsledků je však třeba dodržovat několik jednoduchých metodických doporučení. Vzhledem k tomu, že vysoká elektrická vodivost zkoumaných vzorků může významně narušit elektroforetickou pohyblivost proteinu, měla by být jejich iontová síla co nejnižší a přibližně stejná. Další důležitou podmínkou spolehlivosti stanovení molekulové hmotnosti je optimální naložení proteinu na gel. Při barvení Coomassie Blue R250 by měl být optimální obsah proteinu ve skvrně v rozmezí 0,1-1 µg a alespoň o řád nižší při barvení stříbrem. V opačném případě budou proteiny v gelu tvořit široké skvrny, což znesnadní stanovení jejich elektroforetické mobility. Přes vysokou citlivost a jednoduchost metody se molekulová hmotnost proteinů stanovená pomocí SDS-PAGE často liší od skutečné hodnoty. Rozdíl se může pohybovat od několika kDa pro proteiny s nízkou molekulovou hmotností až po desítky kDa pro proteiny s vysokou molekulovou hmotností.
Kvantifikace proteinůMetoda SDS-PAGE je nepostradatelná, pokud je potřeba kvantifikovat jednotlivý protein ve vzorku, který je složitý nejen složením proteinu. Příkladem takového vzorku mohou být surové extrakty nebo buněčné lyzáty. V tomto případě je metoda vhodná pro studium jak nativních proteinů, tak proteinů, které změnily svou strukturu. Takové proteiny mohou být polymery, agregáty nebo zcela denaturované molekuly. Relativní nenáročnost metody s ohledem na složení vzorku a strukturní stav proteinů v něm příznivě odlišuje SDS-PAGE od jiných metod kvantitativního stanovení, například od vysokoúčinné kapalinové chromatografie nebo enzymové imunoanalýzy.
Kvantifikace proteinu pomocí SDS-PAGE naznačuje potřebu kalibrace gelu ve vztahu k závislosti intenzity barvy proteinové skvrny v gelu na množství proteinu v této skvrně. K tomu je paralelně se studovanými vzorky v gelu separováno několik referenčních vzorků s přesně známými různými množstvími referenčního proteinu. Po vizualizaci proteinů v gelu pomocí denzitometru se změří hustota každé proteinové skvrny referenčních vzorků. Určete závislost této hustoty na množství bílkovin. Kalibrovaný gel se používá k výpočtu množství studovaného proteinu vzhledem k hustotě jeho skvrny pomocí metody regresní analýzy . Za spolehlivé výsledky se považují, pokud je závislost hustoty proteinových skvrn pro referenční protein na množství proteinu ve skvrně lineární (R 2 > 0,95). To znamená, že pro výpočty se používá pouze ta část kalibrační křivky, která pokrývá hustotu skvrny studovaného proteinu. Je třeba poznamenat, že výběr optimální koncentrace proteinu v testovaném vzorku se provádí empiricky.
Při kvantifikaci proteinů pomocí SDS-PAGE je třeba vzít v úvahu jeden významný rys této metody. Takže vzhledem k tomu, že účinnost barvení proteinu v gelu závisí na jeho povaze, například složení aminokyselin, molekulová hmotnost, přítomnost prostetických skupin , referenční protein použitý ke kalibraci gelu a studovaný protein musí být identický. V případě odchylky od tohoto pravidla se rozdíl mezi skutečnou a přijatou částkou může několikanásobně lišit.
Stanovení proteinových nečistotMetoda SDS-PAGE podle Laemmliho umožňuje kvantifikovat obsah pouze těch nečistot, které se svou molekulovou hmotností liší od molekulové hmotnosti studovaného proteinu. K tomu se testovaný vzorek separuje v jednom gelu paralelně s jedním nebo více referenčními vzorky, přičemž množství referenčního proteinu je srovnatelné s očekávaným množstvím nečistot v roztoku testovaného proteinu. Pokud je například koncentrace proteinu v testovaném vzorku 1 mg/ml a očekávané množství nečistot v něm je do 1 %, pak se jako referenční použije alespoň jeden referenční proteinový roztok s koncentrací 10 µg/ml. vzorek. Po vizualizaci proteinů v gelu pomocí denzitometru se změří hustota každé proteinové skvrny pro testovaný vzorek a referenční vzorek.
Metoda SDS-PAGE je vhodná pro stanovení proteinových dimerů a polymerů, které se akumulují v důsledku samovolného uzavírání intermolekulárních disulfidových vazeb , např. při nesprávném skladování léčiva. Za tímto účelem se studovaný protein a referenční protein oddělí v gelu za redukčních a neredukujících podmínek. Nečistoty jsou dimery a polymery, pokud jsou detekovány za redukčních podmínek a nejsou detekovány za neredukujících podmínek. V tomto případě by jejich molekulová hmotnost měla být násobkem molekulové hmotnosti testovaného proteinu. Vyhodnocení čistoty proteinového přípravku pomocí SDS-PAGE za redukčních podmínek tedy umožňuje stanovit pouze nehomologické proteinové nečistoty.
Výsledky stanovení čistoty vzorku mohou být buď semikvantitativní nebo kvantitativní. V případě, že je provedeno srovnání hustoty skvrn kontaminujících proteinů vzhledem k jedné skvrně referenčního proteinu, je získaný výsledek semikvantitativní. Jeho znění může znít například takto: „Obsah bílkovinných nečistot ve zkušebním roztoku nepřesahuje 1 %. Kvantitativní stanovení proteinových nečistot se provádí podle doporučení pro kvantitativní stanovení proteinů metodou SDS-PAGE.
Kromě popsaných přístupů některé laboratoře praktikují metodu pro stanovení homogenity přípravku bez použití referenčních vzorků. V tomto případě je čistota studovaného proteinu určena hustotou skvrny v gelu, která se odhaduje jako procento součtu hustot všech identifikovaných bílkovinných skvrn. Tento přístup neodráží skutečné množství nečistot, ale může sloužit jako kvalitativní hodnocení čistoty drogy. Metodu nelze klasifikovat jako kvantitativní vzhledem k tomu, že počet a hustota detekovaných proteinových skvrn je přímo úměrná množství celkového proteinu v testovaném vzorku a citlivosti metody stanovení proteinů v gelu. Navíc závislost hustoty proteinové skvrny na množství proteinu v ní v rozsahu přesahujícím jeden řád často není lineární.
Pro elektroforézu proteinů v polyakrylamidovém gelu se používají následující pufrové roztoky : Tris - HCl , Tristricin , TBE , TBE s močovinou, Bis-Tris.