ATAC seq

ATAC-seq (z angl.  A ssay for T ransposase - Accessible C chromatin using sekv uencing ) je metoda pro celogenomické hodnocení stupně otevřenosti chromatinu [1] . Metoda se objevila v roce 2013 jako alternativa k MNase-seq ( sekvenování míst přístupných mikrokokové nukleáze ), FAIRE-Seq a DNase-seq [1] . Ve srovnání s DNase-seq a MNase-seq je ATAC-seq rychlejší a citlivější metodou pro analýzu epigenomu [2] [3] [4].

Popis

ATAC-seq detekuje exponované oblasti DNA v chromatinu pomocí hyperaktivní mutantní formy Tn5 transposázy , která vkládá sekvenační adaptéry do exponovaných oblastí genomu [2] [5] . Zatímco transpozázy divokého typu mívají nízkou aktivitu, enzym používaný v ATAC-seq má zvýšenou aktivitu [6] . Během procesu značení zavádí Tn5 transposáza  dvouvláknové zlomy do otevřených oblastí genomu a do těchto zlomů vloží sekvenační adaptéry [7] . Fragmenty DNA obsahující adaptéry jsou poté purifikovány, amplifikovány polymerázovou řetězovou reakcí a sekvenovány pomocí sekvenačních metod nové generace [7] . Na základě odečtů získaných jako výsledek sekvenování je možné identifikovat otevřené chromatinové oblasti, vazebná místa transkripčního faktoru a také polohy nukleozomů [2] . Čím je chromatin otevřenější, tím více čtení připadá na odpovídající oblast genomu a přesnost takového hodnocení dosahuje hodnoty jednoho nukleotidu [2] . Na rozdíl od FAIRE-seq, ATAC-seq nevyžaduje sonikaci nebo extrakci fenolem a chloroformem [8] ; na rozdíl od ChIP-seq tato metoda nevyžaduje použití protilátek [9] ani štěpení DNA speciálními enzymy, jako v případě metod DNase-seq a MNase-seq [10] . Příprava vzorku pro ATAC-seq trvá jen asi tři hodiny [11] .

Aplikace

ATAC-seq se používá ke kvantifikaci otevřených chromatinových oblastí. Nejčastěji se tato metoda používá při experimentech ke stanovení polohy nukleozomů [3] , lze ji však použít k identifikaci vazebných míst pro transkripční faktory [12] a míst metylace DNA [13] . ATAC-seq lze použít k lokalizaci zesilovačů , například ve studiích evoluce zesilovačů [14] nebo k identifikaci specifických zesilovačů, které fungují během diferenciace krevních buněk [15] .

ATAC-seq byl použit pro detekci aktivních oblastí chromatinu v různých lidských rakovinných buňkách v celém genomu [16] . Pomocí této metody bylo prokázáno obecné snížení počtu otevřených oblastí chromatinu u makulární degenerace [17] . ATAC-seq lze použít k identifikaci vazebných míst pro proteiny specifických pro tyto buňky , stejně jako transkripčních faktorů se specifickou aktivitou v různých typech buněk [12] .

Jednotlivé buňky ATAC-seq

Existují modifikace protokolu ATAC-seq určené pro analýzu chromatinu v jednotlivých buňkách. Pomocí mikrohydrodynamických přístupů je možné izolovat jednotlivá buněčná jádra a již na nich produkovat ATAC-seq [11] . V tomto přístupu dochází k izolaci jednotlivých buněk před zavedením adaptérů pro sekvenování do genomu [11] [18] . Jiný přístup, známý jako kombinatorické indexování buněk, nevyžaduje izolaci jednotlivých buněk. Tato metoda používá čárové kódy k posouzení dostupnosti chromatinu v tisících buněk . V jednom takovém experimentu je možné získat epigenomický profil pro 10 000–100 000 buněk [19] . Kombinatorické indexování buněk však vyžaduje další složité vybavení a speciální formu Tn5 transposázy [20] .

Bioinformatická analýza jednobuněčných dat ATAC-seq je založena na konstrukci matice , ve které jsou chromatinové oblasti protikladem k počtu čtení, která na ně připadla. Takové matice mohou být velmi velké a mohou obsahovat stovky tisíc chromatinových oblastí, přičemž nenulový počet čtení představuje ne více než 3 % z nich [21] . Stejně jako standardní ATAC-seq umožňuje jednobuněčný ATAC-seq identifikovat transkripční faktory aktivní v dané buňce, například analýzou počtu čtení na jejich vazebných místech [22] .

Poznámky

  1. ↑ 1 2 Buenrostro JD , Giresi PG , Zaba LC , Chang HY , Greenleaf WJ Transpozice nativního chromatinu pro rychlé a citlivé epigenomické profilování otevřeného chromatinu, DNA-vazebných proteinů a pozice nukleozomu.  (anglicky)  // Nature Methods. - 2013. - prosinec ( roč. 10 , č. 12 ). - S. 1213-1218 . - doi : 10.1038/nmeth.2688 . — PMID 24097267 .
  2. ↑ 1 2 3 4 Buenrostro JD , Wu B. , Chang HY , Greenleaf WJ ATAC-seq: Metoda pro stanovení dostupnosti chromatinu v celém genomu.  (anglicky)  // Aktuální protokoly v molekulární biologii. - 2015. - 5. ledna ( sv. 109 ). - str. 21-29 . - doi : 10.1002/0471142727.mb2129s109 . — PMID 25559105 .
  3. ↑ 1 2 Schep AN , Buenrostro JD , Denny SK , Schwartz K. , Sherlock G. , Greenleaf WJ Strukturované nukleosomové otisky umožňují mapování architektury chromatinu v regulačních oblastech s vysokým rozlišením.  (anglicky)  // Genome Research. - 2015. - Listopad ( roč. 25 , č. 11 ). - S. 1757-1770 . - doi : 10.1101/gr.192294.115 . — PMID 26314830 .
  4. ↑ Song L. , Crawford GE DNase-seq: technika s vysokým rozlišením pro mapování aktivních regulačních prvků genu napříč genomem ze savčích buněk.  (eng.)  // Cold Spring Harbor Protocols. - 2010. - únor ( roč. 2010 , č. 2 ). - S. 5384-5384 . - doi : 10.1101/pdb.prot5384 . — PMID 20150147 .
  5. ↑ Bajic, Marko; Maher, Kelsey A.; Deal, Roger B. Identifikace otevřených chromatinových oblastí v rostlinných genomech pomocí ATAC-Seq // Dynamika chromatinu rostlin  (neurčeno) . - 2018. - T. 1675. - S. 183-201. — (Metody v molekulární biologii). - ISBN 978-1-4939-7317-0 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7318-7_12 .
  6. ↑ Reznikoff WS Transposon Tn5.  (anglicky)  // Annual Review Of Genetics. - 2008. - Sv. 42 . - str. 269-286 . - doi : 10.1146/annurev.genet.42.110807.091656 . — PMID 18680433 .
  7. ↑ 1 2 Picelli S. , Björklund AK , Reinius B. , Sagasser S. , Winberg G. , Sandberg R. Tn5 transposázové a značkovací procedury pro masivně škálované sekvenační projekty.  (anglicky)  // Genome Research. - 2014. - prosinec ( roč. 24 , č. 12 ). - str. 2033-2040 . - doi : 10.1101/gr.177881.114 . — PMID 25079858 .
  8. ↑ Simon JM , Giresi PG , Davis IJ , Lieb JD Použití formaldehydem asistované izolace regulačních prvků (FAIRE) k izolaci aktivní regulační DNA.  (anglicky)  // Nature protocols. - 2012. - Sv. 7, č. 2 . - S. 256-267. - doi : 10.1038/nprot.2011.444 . — PMID 22262007 .
  9. ↑ Savic D. , Partridge EC , Newberry KM , Smith SB , Meadows SK , Roberts BS , Mackiewicz M. , Mendenhall EM , Myers RM CETCh-seq: CRISPR epitope tagging ChIP-seq DNA-binding proteins.  (anglicky)  // Genome Research. - 2015. - říjen ( roč. 25 , č. 10 ). - S. 1581-1589 . - doi : 10.1101/gr.193540.115 . — PMID 26355004 .
  10. ↑ Hoeijmakers, Wieteke Anna Maria; Bartfai, Richard. Charakterizace nukleosomové krajiny pomocí mikrokokového sekvenování nukleázy (MNase-seq) // Imunoprecipitace chromatinu  (neopr.) . - 2018. - T. 1689. - S. 83-101. — (Metody v molekulární biologii). — ISBN 978-1-4939-7379-8 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_8 .
  11. ↑ 1 2 3 Buenrostro JD , Wu B. , Litzenburger UM , Ruff D. , Gonzales ML , Snyder MP , Chang HY , Greenleaf WJ Dostupnost jednobuněčného chromatinu odhaluje principy regulačních variací.  (anglicky)  // Nature. - 2015. - 23. července ( roč. 523 , č. 7561 ). - S. 486-490 . - doi : 10.1038/příroda14590 . — PMID 26083756 .
  12. ↑ 1 2 Li Z. , Schulz MH , Look T. , Begemann M. , Zenke M. , Costa IG Identifikace vazebných míst transkripčního faktoru pomocí ATAC-seq.  (anglicky)  // Genome Biology. - 2019. - 26. února ( vol. 20 , č. 1 ). - str. 45-45 . - doi : 10.1186/s13059-019-1642-2 . — PMID 30808370 .
  13. ↑ Spektor R. , Tippens ND , Mimoso CA , Soloway PD methyl-ATAC-seq měří metylaci DNA na dostupném chromatinu.  (anglicky)  // Genome Research. - 2019. - Červen ( roč. 29 , č. 6 ). - str. 969-977 . - doi : 10.1101/gr.245399.118 . — PMID 31160376 .
  14. ↑ Prescott SL , Srinivasan R. , Marchetto MC , Grishina I. , Narvaiza I. , Selleri L. , Gage FH , Swigut T. , Wysocka J. Zesilovač divergence a cis-regulační evoluce v lidském a šimpanském neurálním hřebenu.  (anglicky)  // Cell. - 2015. - 24. září ( roč. 163 , č. 1 ). - str. 68-83 . - doi : 10.1016/j.cell.2015.08.036 . — PMID 26365491 .
  15. ↑ Lara-Astiaso D. , Weiner A. , Lorenzo-Vivas E. , Zaretsky I. , Jaitin DA , David E. , Keren-Shaul H. , Mildner A. , Winter D. , Jung S. , Friedman N. . Amit I. Imunogenetika. Dynamika stavu chromatinu během krvetvorby.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 2014. - 22. srpna ( roč. 345 , č. 6199 ). - S. 943-949 . - doi : 10.1126/science.1256271 . — PMID 25103404 .
  16. ↑ Corces MR , Granja JM , Shams S. , Louie BH , Seoane JA , Zhou W. , Silva TC , Groeneveld C. , Wong CK , Cho SW , Satpathy AT , Mumbach MR , Hoadley KA , Robertson NC AG , Sheffield I. , Castro MAA , Berman BP , Staudt LM , Zenklusen JC , Laird PW , Curtis C. , Cancer Genome Atlas Analysis Network. , Greenleaf WJ , Chang HY Krajina dostupnosti chromatinu u primárních lidských rakovin.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 2018. - 26. října ( roč. 362 , č. 6413 ). - doi : 10.1126/science.aav1898 . — PMID 30361341 .
  17. ↑ Wang J. , Zibetti C. , Shang P. , Sripathi SR , Zhang P. , Cano M. , Hoang T. , Xia S. , Ji H. , Merbs SL , Zack DJ , Handa JT , Sinha D. , Blackshaw S. , Qian J. Analýza ATAC-Seq odhaluje rozsáhlé snížení dostupnosti chromatinu u věkem podmíněné makulární degenerace.  (anglicky)  // Nature Communications. - 2018. - 10. dubna ( ročník 9 , č. 1 ). - S. 1364-1364 . - doi : 10.1038/s41467-018-03856-y . — PMID 29636475 .
  18. ↑ Mezger A. , Klemm S. , Mann I. , Brower K. , Mir A. , Bostick M. , Farmer A. , Fordyce P. , Linnarsson S. , Greenleaf W. Vysokokapacitní profilování dostupnosti chromatinu na jedné buňce rozlišení.  (anglicky)  // Nature Communications. - 2018. - 7. září ( ročník 9 , č. 1 ). - str. 3647-3647 . - doi : 10.1038/s41467-018-05887-x . — PMID 30194434 .
  19. ↑ Lareau CA , Duarte FM , Chew JG , Kartha VK , Burkett ZD , Kohlway AS , Pokholok D. , Aryee MJ , Steemers FJ , Lebofsky R. , Buenrostro JD Kapkové kombinatorické indexování pro přístupnost jedné buňky v masivním měřítku.  (anglicky)  // Nature Biotechnology. - 2019. - Srpen ( vol. 37 , č. 8 ). - S. 916-924 . - doi : 10.1038/s41587-019-0147-6 . — PMID 31235917 .
  20. ↑ Chen X. , Miragaia RJ , Natarajan KN , Teichmann SA Rychlá a robustní metoda pro profilování dostupnosti jednobuněčného chromatinu.  (anglicky)  // Nature Communications. - 2018. - 17. prosince ( roč. 9 , č. 1 ). - S. 5345-5345 . - doi : 10.1038/s41467-018-07771-0 . — PMID 30559361 .
  21. ↑ Li Zhijian , Kuppe Christoph , Cheng Mingbo , Menzel Sylvia , Zenke Martin , Kramann Rafael , Costa Ivan G. scOpen: chromatin-accessibility estimation of single-cell ATAC  data . - 2019. - 5. prosince. - doi : 10.1101/865931 .
  22. ↑ Schep AN , Wu B. , Buenrostro JD , Greenleaf WJ chromVAR: odvození dostupnosti spojené s transkripčním faktorem z jednobuněčných epigenomických dat.  (anglicky)  // Nature Methods. - 2017. - Říjen ( roč. 14 , č. 10 ). - str. 975-978 . - doi : 10.1038/nmeth.4401 . — PMID 28825706 .