Reaktivní formy kyslíku (ROS, reactive oxygen species, ROS, angl. Reactive oxygen species, ROS ) - zahrnují kyslíkové ionty , volné radikály a peroxidy anorganického i organického původu. Obvykle se jedná o malé molekuly s výjimečnou reaktivitou díky přítomnosti nepárového elektronu na vnější elektronické úrovni.
ROS se neustále tvoří v živé buňce jako produkty normálního metabolismu kyslíku . Působením ionizujícího záření také vznikají reaktivní formy kyslíku . Některé ROS mohou hrát roli mediátorů důležitých intracelulárních signálních drah. Zvýšená produkce ROS však vede k oxidativnímu stresu . Mezi normální funkce ROS patří indukce imunitního systému a mobilizace systémů transportu iontů . Například krevní buňky v místě poranění začnou produkovat ROS, který rekrutuje krevní destičky nezbytné k zahájení procesu hojení ran. ROS také spouští programovanou buněčnou smrt ( apoptózu ).
Asi 98 % celkového kyslíku spotřebovaného buňkou se redukuje v mitochondriích na vodu v procesu oxidativní fosforylace , ale 2 % v důsledku vedlejších reakcí, zejména na začátku nebo uprostřed mitochondriálního dýchacího řetězce , včetně reakcí katalyzovaných cytochrom c oxidáza , jsou přeměněny nejprve na částečně redukovaný superoxid kyslíku a poté na hydroxylový radikál OH•, rovněž související s ROS [1] . Kromě mitochondrií může lipofuscin hromadící se v buňkách vést k tvorbě ROS v důsledku Fentonovy reakce díky své schopnosti slučovat se s určitými přechodnými kovy [2] [3] . Ochranu buněk před ROS zajišťuje několik antioxidačních enzymů ( superoxiddismutáza , kataláza a peroxiredoxiny ) a antioxidanty s nízkou molekulovou hmotností ( vitamín C , glutathion , kyselina močová ). Kromě toho mají polyfenoly (například analogy některých složek červeného vína ) antioxidační vlastnosti .
Vliv ROS na buněčný metabolismus byl vědecky prokázán a podpořen důkazy z různých studií [4] . Podílejí se nejen na apoptóze (programované buněčné smrti), ale také vedou k pozitivním výsledkům, jako je indukce ochranných [5] [6] hostitelských genů a mobilizace iontových transportérů . To naznačuje, že řídí buněčné funkce. Zejména krevní destičky, které se podílejí na hojení ran a homeostáze, uvolňují ROS, aby přitáhly ještě více krevních destiček do místa poranění. Existuje také spojení s adaptivním imunitním systémem přitahováním leukocytů .
Reaktivní formy kyslíku se podílejí na buněčných procesech různých zánětlivých reakcí, včetně onemocnění kardiovaskulárního systému . Kromě toho jsou zodpovědní za ztrátu sluchu v důsledku poškození kochley hlasitými zvuky, v důsledku ototoxicity léků, jako je cisplatina, a vrozené hluchoty u zvířat a lidí. ROS zprostředkovávají proces apoptózy nebo programované buněčné smrti a ischemie. Příkladem je mrtvice a infarkt.
Obecně destruktivní účinek reaktivních forem kyslíku na buňku nejčastěji spočívá v [7] :
Když rostlina rozpozná cizí patogen, nejprve rychle produkuje superoxid nebo peroxid vodíku k posílení buněčné stěny. To zabraňuje šíření patogenu do jiných částí rostliny. Kolem patogenu se vlastně vytvoří síťka, která omezuje jeho pohyb a rozmnožování.
U savčího hostitele ROS zapíná antimikrobiální ochranu [8] . Význam této ochrany lze spatřovat u pacientů s chronickým granulomatózním onemocněním, kteří trpí neadekvátní produkcí ROS. Jsou vysoce náchylné k různým infekcím, včetně infekcí způsobených Salmonella enterica , Staphylococcus aureus , Serratia marcescens a Aspergillus spp .
Studie homeostázy trávicího traktu ovocných mušek (Drosophila melanogaster) ukazují, že produkce ROS působí jako klíčový faktor imunitní odpovědi ve střevech hmyzu. ROS plní baktericidní funkci, poškozuje DNA, RNA a proteiny a působí také jako signální molekuly, které spouštějí mechanismy regenerace epitelu [9] . Uracil , který je vylučován mikroorganismy, iniciuje produkci a následnou aktivitu dvojité oxidázy (Duox), enzymu, který produkuje ROS ve střevě. Aktivita Duox koreluje s koncentrací uracilu ve střevě a za bazálních podmínek je potlačena proteinkinázou MkP3 . Přísná kontrola Duoxu inhibuje nadměrnou produkci ROS a usnadňuje rozpoznání prospěšných a škodlivých mikroorganismů ve střevě [10] .
Způsob, jakým ROS chrání hostitele před škodlivými mikroorganismy, není dosud zcela objasněn. S největší pravděpodobností spočívá v poškození DNA mikrobů. Výzkum Salmonelly ukazuje, že k obraně proti smrtelným útokům ATP potřebovala mechanismy opravy DNA. Role ROS v antivirových obranných mechanismech může být pozorována prostřednictvím Rig-like helikázy-1 a mitochondriálního antivirového signalizačního proteinu. Vysoké hladiny ROS zesilují signály prostřednictvím těchto mitochondriálních antivirových receptorů, aby aktivovaly interferonový regulační faktor (IRF) 3, IRF7 a nukleární faktor kappa B (NF-κB) a neutralizovaly viry [11] . Epiteliální buňky dýchacích cest zapnou mitochondriální ROS v reakci na chřipkovou infekci. Aktivita ROS zahrnuje stimulaci interferonu typu III a neutralizaci virů, což omezuje možnost replikace [12] . ROS se podílejí na obraně hostitele proti mykobakteriím, i když je pravděpodobně přímo nezabíjejí. ROS spíše působí na ROS-dependentní signalizaci, například pro produkci cytokinů, autofagii a tvorbu granulomů [13] [14] .
Reaktivní formy kyslíku se také účastní aktivace, anergie a apoptózy T-lymfocytů [15] .
V aerobních formách života je energie nezbytná pro realizaci biologických funkcí produkována mitochondriemi podél elektronového transportního řetězce . Spolu s energií jsou produkovány reaktivní formy kyslíku (ROS), které mají potenciál poškodit buňky. ROS může poškodit lipidy, DNA, RNA a proteiny, které teoreticky přispívají k fyziologickým změnám během stárnutí.
ROS se vyskytují jako normální produkt buněčného metabolismu . Mezi nimi je hlavním iniciátorem oxidačního poškození peroxid vodíku (H 2 O 2 ), který vzniká ze superoxidu vylučovaného mitochondriemi. Kataláza a superoxiddismutáza zmírňují škodlivé účinky peroxidu vodíku a superoxidu tím, že tyto látky přeměňují na kyslík a peroxid vodíku (který se později mění na vodu) - to znamená, že produkují neškodné molekuly. Tyto transformace však nejsou 100% účinné a v buňkách zůstávají peroxidové zbytky. Přestože jsou ROS produktem normálního fungování buněk, jejich nadbytek vede ke zhoubným následkům [16] .
S věkem se paměť člověka zhoršuje, jak je patrné u degenerativních onemocnění, jako je Alzheimerova choroba , která jsou doprovázena hromaděním oxidativního poškození. Moderní výzkumy ukazují, že akumulace ROS snižuje fyzickou výkonnost těla, protože oxidační poškození přispívá k senilitě. Zejména hromadící se oxidační poškození vede ke kognitivní dysfunkci, jak potvrdila studie na starých krysách, kterým byly podávány mitochondriální metabolity a následně podrobeny kognitivním testům. Na základě výsledků se potkanům lépe dařilo v úkolech po metabolitech, což naznačuje, že metabolity zvrátily oxidační poškození a zlepšily mitochondriální funkci [17] . Akumulace oxidačního poškození může ovlivnit účinnost mitochondrií a urychlit produkci ROS [18] . Nahromaděné oxidační poškození a jeho role v procesu stárnutí závisí na typu poškozené tkáně. Další testování pomohlo určit, že oxidační poškození je zodpovědné za zhoršení mozkových funkcí související s věkem. Staří drápatí pískomilové mají vyšší koncentraci oxidovaných bílkovin než mladí hlodavci. Léčba starých a mladých myší spinovými pastmi měla za následek snížení oxidovaných proteinů u starých pískomilů, ale neměla žádný vliv na mladé. Navíc starší pískomilové měli lepší výsledky v kognitivních testech během léčby, ale měli sníženou funkčnost, když byla léčba ukončena a hladiny oxidovaných proteinů se znovu zvýšily. Na základě těchto výsledků vědci dospěli k závěru, že oxidace buněčných proteinů je potenciálně spojena s fungováním mozku [19] .
Teorie stárnutí volných radikálů uvádí, že oxidační poškození způsobené reaktivními formami kyslíku vyvolává zhoršení funkcí charakteristických pro stárnutí. Výsledky studií na bezobratlých naznačují, že zvířata geneticky predisponovaná k nedostatku určitých antioxidačních enzymů (jako je SOD ( superoxiddismutáza )) mají zkrácenou životnost (jak by se na základě teorie dalo předpokládat), avšak zpětná manipulace za účelem zvýšení antioxidačních enzymů mají trvalý účinek na dlouhověkost (ačkoli některé studie na Drosophila potvrzují, že dlouhověkost může být zvýšena nadměrnou expresí manganu-SOD a enzymů zapojených do biosyntézy glutathionu). Tato teorie je v rozporu se skutečností, že odstranění mitochondriálního SOD2 zvyšuje délku života u Caenorhabditis elegans [20] .
S myšmi je pomíjivý příběh. Odstranění antioxidačních enzymů obecně vede ke zkrácení délky života, ačkoli studie nadměrné exprese (až na několik nedávných výjimek) trvale neprodloužily životnost [21] . Studie předčasného stárnutí u potkanů odhalila zvýšený oxidační stres, sníženou aktivitu antioxidačních enzymů a významné poškození DNA v neokortexu a hipokampu u předčasně stárnoucích modelových zvířat ve srovnání s normálně stárnoucími kontrolními potkany [22] . Marker poškození DNA 8-OHdG ( 8-Oxo-2′-deoxyguanosin ) je produktem interakce ROS s DNA. Četné studie prokázaly, že obsah 8-OHdG se v různých orgánech savců zvyšuje s věkem [23] .
ROS se neustále objevují v biologickém systému, aby vykonávaly regulační funkce, a pak jsou z něj odstraňovány [24] . Za normálních fyziologických podmínek buňky kontrolují hladinu ROS udržováním rovnováhy mezi tvorbou a odstraňováním ROS prostřednictvím purifikačních systémů. Ale v podmínkách oxidačního stresu nadměrná akumulace ROS ničí buněčné proteiny, lipidy a DNA, což způsobuje nevratné fokální léze v buňce, které přispívají ke karcinogenezi.
Rakovinné buňky zažívají větší ROS stres než zdravé buňky, částečně kvůli onkogenní stimulaci, zvýšené metabolické aktivitě a mitochondriálnímu selhání. AFC je dvousečná zbraň. Na jedné straně přispívají k přežití rakovinných buněk, protože progrese buněčného cyklu pod vlivem růstových faktorů a receptorových tyrozinkináz (RTK) vyžaduje pro aktivaci ROS [25] . Chronický zánět, hlavní mediátor rakoviny, je také kontrolován ROS. Na druhé straně zvýšená koncentrace ROS potlačuje růst nádoru prostřednictvím trvalé aktivace inhibitoru buněčného cyklu [26] [27] a zahájení programu buněčné smrti a fyziologického stárnutí v důsledku poškození makromolekul. Většina chemoterapeutických a radioterapeutických látek ve skutečnosti zabíjí rakovinné buňky exacerbací stresu ROS [28] [29] . Schopnost rakovinných buněk rozlišovat mezi signály ROS pro přežití a apoptózu je určena dávkou, trváním, typem a lokalizací produkce ROS. Rakovinné buňky vyžadují k přežití střední koncentraci ROS a příliš vysoká hladina vede k jejich smrti.
Metabolická adaptace nádorové tkáně vyrovnává energetickou potřebu buňky se stejně důležitou potřebou makromolekulárních složek a přísnou kontrolou redoxní rovnováhy. V důsledku toho je produkce NADPH jako redukčního kofaktoru v mnoha enzymatických reakcích makromolekulární biosyntézy značně zvýšena . Zároveň tato sloučenina zachraňuje buňky před přebytkem ROS vznikajícího při rychlé proliferaci. Buňky vyrovnávají škodlivé účinky ROS produkcí antioxidantů, jako je redukovaný glutathion (GSH) a thioredoxin (TRX), které vyžadují redukční schopnost NADPH udržovat aktivitu [30] .
Většina rizikových faktorů rakoviny interaguje s buňkami prostřednictvím ROS. ROS aktivují různé transkripční faktory, jako je univerzální aktivovaný transkripční faktor B-buněk ( NF-κB ), aktivátorový protein-1 (AP-1), hypoxií indukovatelný faktor 1-alfa, převodník signálu a aktivátor transkripce 3 (STAT3), které vede k expresi proteinů, které řídí zánět, buněčnou transformaci, přežití nádorových buněk, proliferaci nádorových buněk, invazi, angiogenezi a metastázy. ROS také řídí expresi různých tumor supresorových genů, jako je p53, retinoblastomový protein (Rb gen), fosfatáza a homolog tenzinu (PTEN) [31] .
Oxidace DNA související s ROS je jednou z hlavních příčin mutací, které vedou k několika typům poškození DNA, včetně modifikací slabých (8-oxoguanin a formamidopyrimidin) a silných (cyklopurinové a ethenoadukty) bází, AP míst, atypických jednořetězcových zlomy, adukty DNA a intra- a intermolekulární příčné vazby [32] . Vědci vypočítali, že endogenní ROS, které se tvoří jako výsledek normálního buněčného metabolismu, modifikují přibližně 20 000 bází DNA denně v jedné buňce. 8-oxoguanin je nejběžnější ze všech různých pozorovaných oxidovaných dusíkatých bází. Během replikace DNA polymeráza nesprávně spáruje 8-oxoguanin s adeninem, což vede k transverzi G→T. Výsledná genomová nestabilita přímo přispívá ke karcinogenezi. Buněčná transformace vede k rozvoji rakoviny a interakce atypické izoformy proteinkinázy C typu zeta ( PKC-ζ) s p47phox řídí produkci a transformaci ROS z nádorových kmenových buněk prostřednictvím nouzového programu „bubble shield“ [33] [34]. .
Nekontrolovaná proliferace je charakteristickým znakem rakovinných buněk. Exogenní a endogenní ROS zvyšují proliferaci rakovinných buněk. Skutečnost, že ROS podporují růst nádoru, dále podporuje další pozorování, že látky s potenciálem inhibovat tvorbu ROS mohou také inhibovat proliferaci rakovinných buněk [31] . Přestože ROS podporují proliferaci nádorových buněk, významný nárůst koncentrace ROS je spojen se snížením proliferace v důsledku zástavy buněčného cyklu v G2/M fázi, zvýšené fosforylace mutantního proteinu u ataxie telangiectasia (ATM), kontrolního bodu kinázy 1 (Chk1 ), Chk 2 a zkrácení cyklu buněčného dělení 25 homolog C (CDC25) [35] .
Smrt rakovinných buněk může nastat třemi způsoby: apoptózou , nekrózou a autofagií . Nadbytek ROS indukuje apoptózu jak vnějšími, tak vnitřními cestami [36] . Ve vnější dráze apoptózy jsou ROS generovány Fas ligandem jako prekurzorem aktivace Fas prostřednictvím fosforylace, která je nezbytná pro následný nábor proteinu domény smrti spojeného s Fas a kaspázy 8, stejně jako pro indukci apoptózy. [31] . Ve vnitřní dráze ROS podporuje uvolňování cytochromu C aktivací proteinů stabilizujících póry (Bcl-2 a Bcl-xL) a blokováním proteinů destabilizujících póry (protein X spojený s Bcl-2, homologní protein antagonista-zabíječ Bcl-2 ) [37] . Vnitřní dráha, označovaná také jako kaspázová kaskáda, začíná poškozením mitochondrií, které spouští uvolňování cytochromu C. Poškození DNA, oxidační stres a ztráta potenciálu mitochondriální membrány vedou k uvolnění výše zmíněných proapoptotických proteinů, které stimulují apoptózu. [38] . Poškození mitochondrií úzce souvisí s apoptózou, a protože mitochondrie jsou snadno ovlivněny, existuje potenciál pro onkoterapii [39] . Cytotoxické vlastnosti ROS působí jako hnací síla pro apoptózu, ale při ještě vyšší koncentraci ROS mohou vést k apoptóze i nekróze – nekontrolované formě buněčné smrti – rakovinných buněk [40] .
Četné studie poukazují na dráhy a asociace hladiny ROS s apoptózou, ale nová linie výzkumu spojuje koncentraci ROS a autofagii [41] . ROS může způsobit buněčnou smrt autofagií, což je nezávislý katabolický proces, který spočívá v sekvestraci cytoplazmatického obsahu (vyčerpané nebo poškozené organely a agregované proteiny) a jeho degradaci lysozomy [42] . Autofagie tedy udržuje zdraví buněk během oxidačního stresu. Úrovně koncentrace ROS mohou vyvolat autofagii v buňce různými způsoby, jak se zbavit škodlivých organel, jako jsou karcinogeny, a zabránit poškození bez spuštění apoptózy [43] . Autofagická buněčná smrt může nastat v důsledku nadměrné exprese autofagie, kdy buňka pohltí příliš mnoho částí sebe sama ve snaze kompenzovat poškození a již není schopna dále žít. U tohoto typu smrti dochází ke zvýšení nebo ztrátě kontroly nad geny, které regulují autofagii [44] . Jakmile tedy výzkumníci hlouběji porozumí procesu autofagické buněčné smrti a jeho vztahu k ROS, může tato forma programované buněčné smrti sloužit jako nová léčba rakoviny. Autofagie a apoptóza jsou různé mechanismy buněčné smrti způsobené vysokými hladinami ROS. Autofagie a apoptóza se však zřídka vyvíjejí přísně nezávislými cestami. Existuje prokázaná souvislost mezi ROS a autofagií a korelace mezi nadbytkem ROS a apoptózou [43] . Depolarizace mitochondriální membrány je další charakteristikou nástupu autofagie. Když poškozené mitochondrie začnou uvolňovat ROS, je zahájena autofagie, aby se zbavili nepotřebných organel. Pokud se lék zaměří na mitochondrie a vytvoří ROS, pak autofagie pomůže zbavit buňku velkého počtu mitochondrií a dalších poškozených organel, které nebyly životaschopné. Nadměrné množství ROS a poškození mitochondrií může také sloužit jako signál apoptózy. Pro přežití buněk je rozhodující rovnováha autofagie v buňce a vzájemné ovlivnění autofagie a apoptózy zprostředkované ROS. Interakce a vztah mezi autofagií a apoptózou se může stát cílem onkoterapie nebo najít uplatnění v metodách kombinované léčby rezistentních nádorů.
Po stimulaci tyrosinkinázami receptoru růstového faktoru (RTKs) může ROS spustit aktivaci signálních drah zapojených do migrace a invaze buněk, například z rodiny mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAPK) - extracelulární signálně regulované kinázy (ERK), c-jun NH-2-terminální kináza a p38 MAPK. ROS podporují migraci zvýšením fosforylace fokální adhezní kinázy (FAK) p130Cas a paxilinu [45] .
Studie in vitro a in vivo odhalily, že ROS indukují transkripční faktory a modulují signální molekuly zapojené do angiogeneze (MMP, VEGF) a metastáz (upregulace AP-1, CXCR4, AKT a suprese PTEN) [31] .
Experimentální a epidemiologické studie v posledních několika letech nalezly úzké souvislosti mezi ROS, chronickým zánětem a rakovinou [31] . ROS vyvolává chronický zánět prostřednictvím indukce COX-2, zánětlivých cytokinů (TNFα, interleukin 1 ((IL-1), IL-6, chemokiny (IL-8, CXCR4) a prozánětlivých transkripčních faktorů ( NF-κB )) [ 31]) Chemokiny a chemokinové receptory zase podporují invazi a metastázy různých typů nádorů.
Existují strategie pro zvýšení a snížení úrovní ROS, ale častěji se dává přednost druhému. Rakovinné buňky s vysokou koncentrací ROS jsou závislé na antioxidačním obranném systému. Léky zvyšující ROS zvyšují oxidační stres, buď přímo generováním ROS (např. motexafin gadolinium a elesclomol), nebo látkami, které vypínají vnitřní antioxidační systém, jako je inhibitor SOD (ATN-224, 2-methoxyestradiol) a inhibitor GSH (PEITC), butioninsulfoximin). V důsledku toho se zvyšuje hladina endogenního ROS, který při překročení prahu tolerance může způsobit buněčnou smrt [46] . Na druhou stranu normální buňky při nízké úrovni stresu jsou schopny se lépe vyrovnat s dodatečnými účinky, které generují ROS, než rakovinné buňky [47] . Zvýšení koncentrace ROS ve všech buňkách lze tedy považovat za způsob selektivního ničení rakovinných buněk.
Radiační terapie je také založena na toxicitě ROS, která ničí nádorové buňky. Radiační terapie využívá rentgenové záření, gama záření a záření z těžkých částic, jako jsou protony a neutrony, k vyvolání buněčné smrti a mitotické katastrofy zprostředkované ROS [31] .
Kvůli dvojí úloze ROS byly vyvinuty jak prooxidační, tak antioxidační protirakovinné látky. Samotnou modulaci signálu ROS však nelze považovat za ideální metodu kvůli adaptaci rakovinných buněk na stres ROS, redundantním drahám pro podporu růstu nádoru a toxicitě protirakovinných léků generujících ROS. K vybudování nejúspěšnější strategie pro zvýšení cytotoxicity rakovinných buněk je nutné kombinovat léky generující ROS s léčivy, která mohou interferovat s redoxní adaptací [31] .
James Watson [48] spolu s kolegy [49] navrhli, že nedostatek intracelulárního ROS v důsledku nedostatku cvičení přispívá k malignitě nádoru, protože pro správné skládání proteinů v endoplazmatickém retikulu je nutná maximální koncentrace ROS. Nízká hladina ROS specificky zabraňuje tvorbě tumor supresorových proteinů [49] . Vzhledem k tomu, že fyzické cvičení způsobuje dočasné nárůsty ROS, vysvětluje to skutečnost, že fyzická aktivita zlepšuje prognózu pacientů s rakovinou. [50] Navíc léky, které silně zvyšují hladiny ROS (např. 2-deoxy-D-glukóza a induktory buněčného stresu na bázi uhlohydrátů), jsou účinnější při indukci smrti rakovinných buněk kvůli chamtivosti rakovinných buněk po cukru [51] .