Anti-CRISPR ( anglicky Anti-CRISPR ) je proteinový systém , díky kterému bakteriofágy ( bakterie i archaea ) odolávají destruktivnímu působení systémů CRISPR /Cas. Anti-CRISPR systémy byly popsány u mnoha bakteriofágů. Proteiny těchto systémů ve většině případů interferují s procesem rozpoznávání cíle a prací Cas proteinů. Systémy Anti-CRISPR mohou mít biotechnologický význam, protože je lze použít k doladění editace genomu pomocí technologie CRISPR/ Cas9 .
Před objevem anti-CRISPR byl jediným známým způsobem, jak se fágy vyhnout zničení systémem CRISPR/Cas, získání bodových mutací . Prakticky neovlivňují životaschopnost fága, ale narušují komplementaritu párování fágové DNA s vodící RNA , díky čemuž systém CRISPR/Cas nedokáže rozpoznat virový genetický materiál . Mikroorganismy však rychle najdou způsob, jak obejít tuto ochranu vložením nových fragmentů cizí DNA do svého genomu . První anti-CRISPR proteiny byly objeveny v roce 2013 u několika příbuzných fágů, které napadají bakterii Pseudomonas aeruginosa . Teoreticky, pokud se fág integruje do genomu bakterie, která má aktivní systém CRISPR/Cas, bakterie zemře, protože si rozřízne svůj vlastní genom. Inzerce některých fágů do genomu bakterií s aktivním CRISPR/Cas však nevedla k buněčné smrti. Při srovnání genomů fágů, které způsobují smrt bakteriálních buněk, a fágů, které nevedou k buněčné smrti, se ukázalo, že fágy mají speciální lokus obsahující deset zcela odlišných a velmi krátkých genů (150-450 nukleotidů dlouhých ). Ukázalo se, že proteinové produkty pěti z nich (acrF1-acrF5) narušují systém CRISPR/Cas typu IF u P. aeruginosa a čtyři další (acrE1-acrE4) blokují systém typu IE ve stejné bakterii. Geny anti-CRISPR byly identifikovány nejen ve fágech P. aeruginosa , ale také v plazmidech a konjugativních ostrůvcích této bakterie [1] .
Aminokyselinové sekvence anti-CRISPR proteinů se velmi liší a postrádají jakýkoli společný motiv , který by pomohl identifikovat podobné geny v genomech jiných bakteriofágů pomocí standardních bioinformatických metod . Ukázalo se však, že prostředí anti-CRISPR genů je velmi podobné: po samotných anti-CRISPR genech mají všechny gen kódující transkripční faktor Aca1 ( anti-CRISPR spojený 1 ) [1] . Fágům postrádajícím geny anti-CRISPR také chybí gen aca1 . Navíc geny anti- CRISPR a gen aca1 tvoří jeden operon a zdá se, že protein Acal reguluje expresi anti-CRISPR podle stádia cyklu fágové infekce . Protein Aca1 má strukturní motiv helix-turn-helix , který se často nachází mezi transkripčními faktory. Aby se zjistilo, zda studovaná oblast genomu bakteriofága kóduje proteiny anti-CRISPR, vědci zkontrolovali přítomnost genu kódujícího protein s motivem „helix-turn-helix“ bezprostředně za ním. Pomocí tohoto přístupu byly v bakteriofágách různých proteobakterií objeveny proteiny anti-CRISPR, které působí proti systémům typu I. Stejný přístup vedl k objevu systémů typu II narušujících anti-CRISPR [1] [2] .
Nedávno byla vytvořena databáze anti-CRISPR proteinů antiCRISPRdb, ve které může každý najít známé informace o zájmovém anti-CRISPR proteinu [3] .
Dnes je známo 22 rodin anti-CRISPR proteinů . Spojuje je pouze malá velikost (od 50 do 150 aminokyselinových zbytků), nemají žádný společný motiv a žádný z nich se nepodobá žádnému proteinu se známou funkcí. Proto se ukázalo jako nemožné navrhnout mechanismus účinku anti-CRISPR pomocí bioinformatiky. Dosud bylo možné stanovit mechanismus účinku šesti anti-CRISPR proteinů pomocí genetických , biochemických a strukturálních přístupů. Teoreticky mohou proteiny anti-CRISPR ovlivnit fungování CRISPR/Cas v několika fázích [1] . Oni mohou:
V současné době bylo popsáno působení anti-CRISPR proteinů v posledních dvou scénářích. Například proteiny AcrF1 a AcrF2 se připojují ke komplexu proteinů Cas a RNA a brání mu ve vazbě na cizí DNA. Protein AcrF3 interaguje s proteinem Cas3, který má helikázové a nukleázové aktivity, a brání mu ve spojení s komplexem jiných Cas proteinů a RNA, která již navázala cílovou DNA. AcrIIC1 se váže na nukleázovou doménu proteinu Cas9 (jediného proteinu Cas v systémech typu II), čímž mu brání štěpit DNA [1] .
Některé anti-CRISPR proteiny jsou aktivní proti více systémům CRISPR/Cas. Například anti-CRISPR proteiny, které působí proti systémům typu II-A, potlačují funkci homologních Cas9 proteinů, jejichž aminokyselinové sekvence jsou podobné pouze z 53 % [1] [2] .
Nedávné studie ukázaly, že samotné bodové mutace nestačí k tomu, aby bakteriofágy unikli působení CRISPR/Cas. Fág potřebuje mít alespoň jeden gen anti-CRISPR, aby nedošlo k úplnému usmrcení při společné kultivaci s bakteriemi s aktivními systémy CRISPR/Cas. Zdá se, že takto silná selekce přispívá k rozmanitosti aminokyselinových sekvencí a mechanismů účinku anti-CRISPR. Anti-CRISPR proteiny slouží jako důležité faktory v evoluci mikroorganismů. Inzerce mobilních genetických elementů s geny takových proteinů do bakteriálního genomu tedy vede k trvalé inaktivaci systémů CRISPR/Cas díky stabilní expresi anti-CRISPR. Buňka v tomto stavu nemůže odolat vstupu dalších transponovatelných genetických elementů a tedy horizontálnímu přenosu genů . Při dlouhodobé inaktivaci CRISPR/Cas může bakterie zcela ztratit geny cas nebo nahromadit mutace , které je činí nefunkčními. Bioinformatická analýza systémů CRISPR/Cas různých bakterií ukázala, že asi 12 % z nich je nefunkčních v důsledku ztráty genů cas nebo škodlivých mutací v nich. Experimentálně bylo prokázáno, že za podmínek, kdy je získání cizí DNA prospěšné, mohou bakterie zcela ztratit systém CRISPR/Cas [2] .
V současné době jsou známy anti-CRISPR proteiny, které potlačují aktivitu Cas9 bakterie Streptococcus pyogenes (tento enzym se nejčastěji používá pro editaci genomů pomocí systémů CRISPR/Cas). A co víc, dva z nich to dělají v lidských buňkách a blokují úpravy genomu. Proto mohou proteiny anti-CRISPR regulovat editaci genomu pomocí CRISPR/Cas, například ponechat systém aktivní pouze v určitých tkáních a orgánech , pouze v určitých fázích embryonálního vývoje nebo pouze v určitých okamžicích buněčného cyklu . Kromě toho použití anti-CRISPR pomůže snížit frekvenci neplánovaných mutací zavedených Cas9. Obvykle je Cas9 aktivní, dokud buňka nezničí buď enzym, nebo vodící RNA, a příliš dlouhé období aktivity Cas9 často vede k mutacím mimo cílový gen. Mnoho lidských bakteriálních patogenů má aktivní systémy CRISPR/Cas a použití anti-CRISPR proteinů může významně zvýšit účinnost fágové terapie . Proteiny anti-CRISPR tak mohou v budoucnu nalézt široké uplatnění v biotechnologii, genetickém inženýrství a medicíně [1] .