Southern blot

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 22. února 2022; ověření vyžaduje 1 úpravu .

Southern blot [1] , Southern blot [2] , Southern blot [2] , Southern blot [3] , Southern blot [3] , Southern blot [4] , Southern blot [3] (z angl.  Southern blot ) je metoda používaná v molekulární biologii k identifikaci specifické sekvence DNA ve vzorku. Spočívá v přenesení fragmentů DNA oddělených elektroforézou v agarózovém gelu na membránový filtr a následné detekci známé sekvence z DNA sondy v nich hybridizací s ní. Metoda je pojmenována po vynálezci, anglickém biologovi Edwinu Southernovi [5] .

Jiné technologie přenosu blotu, jako je Western blot , Northern blot , Southwestern blot , používají podobné metody, ale pro detekci RNA nebo proteinu ve vzorku a jsou pojmenovány podle metody vytvořené Southernem.

Metoda

  1. Restrikční endonukleázy (restrikční enzymy) pro štěpení DNA s vysokou molekulovou hmotností na menší fragmenty.
  2. Fragmenty DNA se podrobí elektroforéze na agarózovém gelu pro délkovou separaci.
  3. Pokud existují fragmenty DNA delší než 15 kb . gel se před přenosem ošetří například kyselinou chlorovodíkovou . To způsobí, že fragmenty DNA jsou depurinovány a rozkládány na menší kousky, což usnadňuje následný přenos na membránu.
  4. V případě, že je použita metoda alkalického přenosu, je agarózový gel umístěn do alkalického roztoku, který denaturuje dvoušroubovici DNA a usnadňuje vazbu negativně nabité DNA na kladně nabitou membránu pro další hybridizaci. Současně jsou také zničeny zbytky RNA .
  5. List nitrocelulózové (nebo nylonové ) membrány je umístěn nad nebo pod agarózovým gelem. Tlak se aplikuje přímo na gel nebo přes několik vrstev papíru. Pro úspěšný přenos je nutný těsný kontakt mezi gelem a membránou. Tlumič je přenášen kapilárními silami z oblasti s vysokým vlhkostním potenciálem do oblasti s nízkým vlhkostním potenciálem (membrána). V tomto případě je DNA přenesena z gelu na membránu. Polyaniontová DNA se váže na kladně nabitou membránu silami iontoměničových interakcí.
  6. Pro konečnou fixaci DNA na membráně se tato zahřeje v klasické nebo vakuové peci na teplotu 80 °C po dobu dvou hodin nebo se osvětlí ultrafialovým zářením (v případě nylonových membrán).
  7. Proveďte hybridizaci radioaktivně nebo fluorescenčně značené DNA sondy s předem stanovenou sekvencí DNA s membránou.
  8. Po hybridizaci se přebytečná DNA sonda smyje z membrány a hybridizační obrazec se vizualizuje na rentgenovém filmu autoradiografií ( v případě radioaktivní sondy) nebo se posoudí zbarvení membrány (v případě chromogenního barvení) .

Výsledky

Hybridizace sondy se specifickým fragmentem DNA na filtrační membráně ukazuje, že tento fragment obsahuje sekvenci DNA komplementární k nukleotidové sekvenci sondy.

Aplikace

Southern blotting, který se provádí na genomové DNA ošetřené restrikčními endonukleázami , lze použít ke stanovení počtu kopií genů v genomu. Sonda, která hybridizuje pouze s jediným fragmentem DNA, který nebyl štěpen restrikčními enzymy, vytváří jeden pás na Southern blotu, zatímco více pásů na blotu ukazuje, že sonda hybridizovala s více identickými sekvencemi. Změny hybridizačních podmínek (zvýšení teploty, při které se hybridizace provádí, změna koncentrace soli) vedou ke zvýšení specificity a snížení hybridizace s podobnými, ale ne identickými sekvencemi.

Poznámky

  1. ↑ Hare R. G. , Butvilovsky V. E. , Davydov V. V. , Rachkovskaya I. V. . 7.2.2 Analýza fragmentů DNA  // Lékařská biologie a obecná genetika: učebnice. — 2. vyd., opraveno. - Minsk: Vyšší škola, 2012. - S. 100. - 496 s. - ISBN 978-985-06-2182-5 .
  2. ↑ 1 2 Arefiev V. A. , Lisovenko L. A. . Southern-blotting, Southern-transfer  // anglicko-ruský vysvětlující slovník genetických termínů / vědecký. vyd. L. I. Patrušev. - M. , 1995. - ISBN 5-85382-132-6 .
  3. ↑ 1 2 3 blot of Suzern  // Velký encyklopedický slovník lékařských termínů / ed. prof. E. G. Ulumbeková . - M.  : GEOTAR-Media, 2012. - S. 220. - 2263 s. - 2000 výtisků.  — ISBN 978-5-9704-2010-2 .
  4. ↑ Blot: western, north and southern blot (blot, western, north, southern) // Epidemiologický slovník / ed. JM Last pro Mezinárodní epidemiologickou asociaci; resp. vyd. ruský ed. V.V. Vlasov . - 4. vyd. - M.  : OIZ, 2009. - S. 28, 272. - 316 s.
  5. ↑ Southern, E. M. Detekce specifických sekvencí mezi fragmenty DNA oddělenými gelovou elektroforézou // J Mol Biol.. - 1975. - doi : 10.1016 /S0022-2836(75)80083-0

Viz také