| Fosfoenolpyruvátkarboxyláza | |
|---|---|
| Monomer karboxylázy PEP z Flaveria trinervia . | |
| Identifikátory | |
| Kód KF | 4.1.1.31 |
| Číslo CAS | 9067-77-0 |
| Enzymové databáze | |
| IntEnz | pohled IntEnz |
| BRENDA | Vstup BRENDA |
| ExPASy | NiceZyme pohled |
| MetaCyc | metabolická dráha |
| KEGG | Vstup do KEGG |
| PRIAM | profil |
| Struktury PNR | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsoučet |
| Genová ontologie | AmiGO • EGO |
| Vyhledávání | |
| PMC | články |
| PubMed | články |
| NCBI | NCBI proteiny |
| CAS | 9067-77-0 |
Fosfoenolpyruvátkarboxyláza ( PEP-karboxyláza ) je enzym z rodiny karboxyláz , který se vyskytuje v rostlinách a některých bakteriích . Katalyzuje adici bikarbonátu (HCO 3 - ) na fosfoenolpyruvát (PEP) za vzniku čtyřuhlíkaté sloučeniny oxaloacetátu a anorganického fosfátu [1] :
PEP + HCO 3 − → oxalacetát + F nJedná se o první reakci fixace uhlíku v rostlinách CAM ( metabolismus kyseliny crassulacean ) a C4 a také o jednu z anaplerotických reakcí cyklu trikarboxylových kyselin u bakterií a rostlin. Struktura enzymu, stejně jako jeho dvoustupňový katalytický mechanismus, jsou dobře studovány. Aktivita karboxylázy PEP je přísně kontrolována a regulována jak fosforylací , tak alostericky.
PEP karboxyláza je přítomna v rostlinách a některých bakteriálních druzích, ale chybí u hub nebo zvířat (včetně lidí) [2] . Nukleotidová sekvence genu pro tento enzym se mezi organismy liší, ale aktivní místo enzymu a alosterická vazebná místa nezbytná pro jeho regulaci jsou vždy zachována . Jeho terciární struktura také zůstává konzervativní [3] .
Krystalová struktura PEP karboxylázy byla stanovena pro několik organismů, včetně Zea maysa (kukuřice) a Escherichia coli [3] . Enzym existuje jako dimer dimerů: dvě totožné podjednotky se vážou za vzniku dimeru prostřednictvím solných můstků mezi argininem (R438 – přesná poloha se může lišit v závislosti na původu genu) a kyselinou glutamovou (E433) [4] . Tento dimer se zase váže na jiný dimer a dohromady tvoří komplex čtyř podjednotek. Každá podjednotka se skládá převážně z alfa helixů (65 %) [1] , má hmotnost 106 kDa [5] a skládá se z přibližně 966 aminokyselin [6] .
Aktivní místo enzymu nebylo plně charakterizováno. Zahrnuje konzervované zbytky kyseliny asparagové (D564) a glutamové (E566), které nekovalentně vážou divalentní kationt prostřednictvím svých karboxylových skupin [1] . V závislosti na organismu to může být iont hořčíku , manganu nebo kobaltu [1] [2] , jehož úlohou je koordinovat molekulu fosfoenolpyruvátu (PEP) a reakční meziprodukty. Předpokládá se, že histidinový zbytek (H138) v aktivním místě slouží k přenosu protonu při katalýze [1] [4] .
Mechanismus katalýzy karboxylázou PEP je poměrně dobře znám. Reakce za vzniku oxaloacetátu je vysoce exotermická a proto nevratná; změna Gibbsovy energie pro tento proces (△G°') je -30 kJ/mol [1] . Substrát a kofaktor se váží v následujícím pořadí: kovový ion (Co 2+ , Mg 2+ nebo Mn 2+ ), FEP a hydrogenuhličitan (HCO 3 − ) [1] [2] . Reakce probíhá ve dvou hlavních krocích, jak je popsáno níže a znázorněno na diagramu:
1. Bikarbonát působí jako nukleofil a napadá fosfátovou skupinu PEP. To má za následek rozklad PEP na karboxyfosfát (aktivovaná forma CO 2 ) a vysoce reaktivní enol formu pyruvátu .
2. Proton se přenese na karboxyfosfát. Tento proces zahrnuje histidinový zbytek (H138), který nejprve odštěpí proton od karboxylové skupiny a poté jej jako kyselina přenese na fosfát [1] . Poté se karboxyfosforečnan rozkládá na oxid uhličitý a anorganický fosforečnan za uvolnění energie, což činí reakci nevratnou. Nakonec je oxid uhličitý napaden enolátem, což má za následek tvorbu oxaloacetátu [1] [2] [7] .
Dvojmocný kation koordinuje enolát a oxid uhličitý během reakce; molekula CO 2 se ztrácí pouze ve 3 % případů [2] . Aktivní místo enzymu je hydrofobní a nepropustné pro vodu , protože karboxyfosfát se poměrně snadno hydrolyzuje [1] .
PEP karboxyláza plní tři hlavní funkce:
Hlavní mechanismus asimilace oxidu uhličitého rostlinami se děje prostřednictvím enzymu ribulóza-1,5-difosfátkarboxyláza oxygenáza ( Rubisco ), který přidává CO2 k ribulóza-1,5-difosfátu ( pětiuhlíkový cukr) za vzniku dvou molekul 3. - fosfoglycerát . Při vysokých teplotách a nízké koncentraci CO 2 však Rubisco přidává kyslík místo oxidu uhličitého, což vede k tvorbě metabolicky inertního glykolátového produktu , který je recyklován v procesu fotorespirace . Aby se zabránilo tomuto zbytečnému procesu, mohou rostliny zvýšit místní koncentraci CO 2 prostřednictvím fotosyntézy C 4 [3] [8] . PEP karboxyláza hraje klíčovou roli při fixaci CO 2 jako bikarbonátového aniontu , kdy jej kombinuje s PEP za vzniku oxaloacetátu v mezofylové tkáni . Oxalacetát je poté přeměněn zpět na pyruvát (přes malát ), aby se uvolnil CO2 v hlubší vrstvě pláště vodivého svazku , kde je oxid uhličitý fixován Rubisco v Calvinově cyklu. Pyruvát je přeměněn zpět na PEP v mezofylových buňkách a cyklus začíná znovu. Existuje tedy aktivní koncentrace CO 2 [2] [9] [10] .
Druhou důležitou a velmi podobnou funkcí PEP karboxylázy je účast na CAM fotosyntéze. Tato metabolická cesta je běžná u rostlin žijících v suchých stanovištích. Rostliny nemohou dovolit, aby se jejich průduchy během dne otevřely a absorbovaly CO2 , protože příliš mnoho vody se ztrácí transpirací . Místo toho se průduchy otevírají v noci, kdy je odpařování vody minimální, CO 2 je vázán fixací PEP karboxylázou ve formě oxaloacetátu . Oxalacetát je poté enzymem malátdehydrogenázou přeměněn na malát a ukládán ve vakuole , poté používán během dne, kdy světelné reakce generují dostatek energie (hlavně ve formě ATP ) a redukčních ekvivalentů ( NADPH ) pro provoz Calvinova cyklu [2] [3] [10] .
Třetí funkce karboxylázy PEP není spojena s fotosyntézou. Podobně jako pyruvátkarboxyláza doplňuje PEP karboxyláza zásobu oxaloacetátu v cyklu trikarboxylové kyseliny. PEP vzniklý během glykolýzy se přemění na pyruvát , který se přemění na acetyl-CoA a vstupuje do TCA, kde interaguje s oxaloacetátem za vzniku citrátu . Pro zvýšení toku hmoty cyklem je část PEP přeměněna na oxalacetát pomocí karboxylázy PEP, čímž se doplňuje oxalacetát, který je čerpán z cyklu pro syntézu buněčných biomolekul. TCA je centrální metabolická dráha, takže zvýšení toku látek, které jí procházejí, je důležité pro biosyntézu mnoha molekul, jako jsou aminokyseliny [11] .
PEP karboxyláza je regulována dvěma způsoby: fosforylací a alostericky. Obrázek na straně ukazuje schéma regulačního mechanismu.
Fosforylace fosfoenolpyruvátkarboxylázy kinázy aktivuje enzym, zatímco PEP karboxylázová fosfatáza snižuje její aktivitu . Jak kináza, tak fosfatáza jsou regulovány na úrovni transkripce . Existuje také názor, že malát poskytuje zpětnou vazbu v tomto procesu, snižuje úroveň exprese kinázy a zvyšuje expresi fosfatázy [12] . Oxalacetát v organismech CAM a C 4 se přeměňuje na malát, jehož vysoké koncentrace aktivují expresi fosfatázy, která defosforyluje a deaktivuje PEP karboxylázu, což vede ke snížení akumulace oxaloacetátu, a tedy malátu [1] [12] .
Hlavními alosterickými inhibitory karboxylázy PEP jsou karboxylové kyseliny jako malát a aspartát [5] [12] . Vzhledem k tomu, že malát vzniká v dalším kroku cyklů CAM a C 4 , ihned poté, co karboxyláza PEP katalyzuje kondenzaci CO 2 a PEP na oxaloacetát, vzniká zpětná vazba. Jak aspartát, tak oxalacetát jsou snadno přeměněny na sebe transaminačním mechanismem ; vysoké koncentrace aspartátu zpětně inhibují PEP karboxylázu.
Hlavními alosterickými aktivátory PEP karboxylázy jsou acetyl-CoA (pouze u bakterií) [13] , fruktóza-1,6-difosfát [1] [13] a triózafosfáty (pouze u rostlin) [14] . Tyto molekuly jsou indikátory aktivní glykolýzy a signalizují potřebu produkce oxaloacetátu ke zvýšení průtoku hmoty cyklem kyseliny citrónové . Zvýšení glykolýzy navíc znamená zvýšený přísun PEP a tím i větší akceptor pro fixaci CO 2 a transport do Calvinova cyklu. Je také pozoruhodné, že negativní efektorový aspartát soutěží s pozitivním efektorem acetyl-CoA , což naznačuje, že sdílejí společné vazebné místo [15] .
Studie ukázaly, že energetické ekvivalenty jako AMP , ADP a ATP nemají žádný významný vliv na karboxylázu PEP [16] .
Velikost alosterického vlivu těchto různých molekul na aktivitu karboxylázy PEP závisí na konkrétním organismu [17] .