V biochemii a molekulární biologii je vazebné místo (vazebné místo) oblast makromolekuly, jako je protein, která se specificky váže na jinou molekulu [1] . Vazebný partner makromolekuly je často označován jako ligand [2] . Ligandy mohou zahrnovat další proteiny (vedoucí k interakci protein-protein ) [3] [4] , enzymové substráty [5] , druhé posly , hormony nebo alosterické modulátory [6] . Vazebná událost je často, ale ne vždy, doprovázena konformační změnou , která mění funkci proteinu [7] . Vazba na vazebná místa proteinů je nejčastěji reverzibilní (přechodná a nekovalentní), ale může být i kovalentně reverzibilní [8] nebo ireverzibilní [9] .
Vazba ligandu na vazebné místo na proteinu často způsobuje konformační změnu v proteinu a vede ke změně buněčné funkce. Vazebná místa na proteinu jsou proto kritickými částmi signálních transdukčních drah [10] . Typy ligandů zahrnují neurotransmitery , toxiny , neuropeptidy a steroidní hormony [11] . Vazebná místa podléhají funkčním změnám v mnoha kontextech, včetně enzymatické katalýzy, signalizace molekulární dráhy, homeostatické regulace a fyziologické funkce. Elektrický náboj , sterický tvar a geometrie místa selektivně umožňují vazbu vysoce specifických ligandů, čímž se aktivuje určitá kaskáda buněčných interakcí, za které je protein zodpovědný [12] [13] .
Enzymy způsobují katalýzu, vážou se silněji na přechodové stavy než substráty a produkty. Na substrát v místě katalytické vazby může působit několik různých interakcí. Pohybují se od elektrokatalýzy, kyselé a bazické katalýzy až po kovalentní katalýzu a katalýzu kovovými ionty [11] . Tyto interakce snižují aktivační energii chemické reakce a poskytují příznivé interakce pro stabilizaci molekuly s vysokou energií. Vazba enzymů poskytuje bližší umístění a vyloučení látek, které nejsou pro reakci relevantní. Tato specifická vazba také zabraňuje vedlejším reakcím [14] [11] .
Mezi typy enzymů, které mohou provádět tyto akce, patří oxidoreduktázy, transferázy, hydrolázy, lyázy, izomerázy a ligázy [15] .
Hexokináza transferáza například katalyzuje fosforylaci glukózy za vzniku glukóza-6-fosfátu . Zbytky aktivního místa hexokinasy umožňují stabilizovat molekulu glukózy v aktivním místě a stimulují zahájení alternativní dráhy příznivých interakcí, snižujících aktivační energii [16] .
Inhibice proteinu vazbou inhibitoru může způsobit dysregulaci dráhy, homeostatickou regulaci a fyziologickou funkci.
Kompetitivní inhibitory soutěží se substrátem o vazbu k volným enzymům na aktivních místech a zabraňují tak tvorbě komplexu enzym-substrát po navázání. Například otrava oxidem uhelnatým je způsobena kompetitivní vazbou oxidu uhelnatého na rozdíl od kyslíku v hemoglobinu.
Alternativně se nekompetitivní inhibitory vážou současně na substrát v aktivních místech. Po navázání na komplex enzymového substrátu (ES) se vytvoří komplex inhibitoru enzymového substrátu (ESI). Stejně jako konkurenční inhibitory se také snižuje rychlost tvorby produktu [5] .
Konečně, smíšené inhibitory jsou schopné vázat se jak na volný enzym, tak na komplex enzym-substrát. Na rozdíl od kompetitivních a nekompetitivních inhibitorů se však smíšené inhibitory vážou na alosterické místo. Allosterická vazba způsobuje konformační změny, které mohou zvýšit afinitu proteinu k substrátu. Tento jev se nazývá pozitivní modulace. Naopak alosterická vazba, která snižuje afinitu proteinu k substrátu, je negativní modulací [17] .
V aktivním místě se substrát naváže na enzym, čímž dojde k chemické reakci [18] [19] . Substráty, přechodové stavy a produkty se mohou vázat na aktivní místo, stejně jako jakékoli konkurenční inhibitory [18] . Například v souvislosti s funkcí proteinů může vazba vápníku na troponin ve svalových buňkách způsobit konformační změny troponinu. To umožňuje tropomyosinu otevřít vazebné místo aktinu a myosinu, na které se myosinová hlava váže, aby vytvořila křížový můstek a vyvolala svalovou kontrakci [20] .
V kontextu krve je příkladem kompetitivní vazby oxid uhelnatý, který soutěží s kyslíkem o aktivní místo hemu . Vysoká afinita oxidu uhelnatého může překonat kyslík v přítomnosti nízké koncentrace kyslíku. Za těchto okolností vazba oxidu uhelnatého způsobuje konformační změnu, která brání hemu ve vazbě na kyslík, což má za následek otravu oxidem uhelnatým [5] .
V regulačním místě může vazba ligandu způsobit zesílení nebo inhibici funkce proteinu [5] [21] . Vazba ligandu na alosterické místo multimerního enzymu často vyvolává pozitivní kooperativitu, tj. vazba jednoho substrátu vyvolává příznivou změnu konformace a zvyšuje pravděpodobnost vazby enzymu na druhý substrát [22] . Ligandy regulačních míst mohou zahrnovat homotropní a heterotropní ligandy, ve kterých jeden nebo více typů molekul ovlivňuje aktivitu enzymu [23] .
Regulované enzymy často hrají důležitou roli v metabolických drahách. Například fosfofruktokináza (PFC), která fosforyluje fruktózu během glykolýzy , je silně regulována ATP. Jeho regulace v glykolýze je nezbytná, protože je to rychlost omezující krok v metabolismu. FFK také řídí množství glukózy určené pro tvorbu ATP prostřednictvím katabolické dráhy. Proto je při dostatečné hladině ATP PFK alostericky inhibován ATP. Tato regulace účinně šetří zásoby glukózy, které mohou vyžadovat jiné cesty. Citrát, meziprodukt v cyklu kyseliny citrónové, také funguje jako alosterický regulátor PPA [23] [24] .
Vazebná místa mohou být také charakterizována jejich strukturními znaky. Jednovláknová místa ("monodesmické" ligandy, μόνος: jeden, δεσμός: vazba) jsou tvořena jedním proteinovým řetězcem, zatímco víceřetězcová místa ("polydesmické" ligandy, πολοί: mnoho) [25] se často nacházejí v proteinových komplexech. a jsou tvořeny ligandy, které vážou více než jeden proteinový řetězec, obvykle na rozhraní proteinů nebo v jejich blízkosti. Nedávné studie ukazují, že struktura vazebného místa má silné důsledky pro biologii proteinových komplexů (evoluce funkce, alosterie) [26] [27] .
Skrytá vazebná místa jsou vazebná místa, která se dočasně tvoří ve formě "apo" nebo jsou indukována vazbou ligandu. Zohlednění skrytých vazebných míst zvyšuje velikost lidského proteomu potenciálně reagujícího na lék z ~40 % na ~78 % proteinů spojených s onemocněním [28] . Vazebná místa byla zkoumána pomocí: podpůrného vektorového stroje aplikovaného na datovou sadu CryptoSite [28] , rozšíření datové sady CryptoSite [29] , dlouhodobých simulací molekulární dynamiky pomocí Markovova státního modelu a biofyzikálních experimentů [30] a index skrytých míst založený na relativní dostupné ploše [31] .
Vazebné křivky popisují proces vazby ligandu na protein. Křivky lze charakterizovat svým tvarem, esovitým nebo hyperbolickým, který odráží, zda protein vykazuje kooperativní nebo nespolupracující vazebné chování [32] . Typicky osa x popisuje koncentraci ligandu a osa y popisuje frakční nasycení ligandů spojených se všemi dostupnými vazebnými místy [5] . Při určování tvaru křivky se běžně používá rovnice Michaelise Mentena. Rovnice Michaelise Mentena je odvozena na základě stacionárních podmínek a bere v úvahu enzymatické reakce probíhající v roztoku. Když však k reakci dojde, když je enzym navázán na substrát, kinetika se vyvíjí odlišně [33] .
Modelování pomocí vazebných křivek je užitečné při hodnocení vazebné afinity kyslíku k hemoglobinu a myoglobinu v krvi. Hemoglobin, který má čtyři hemové skupiny, vykazuje kooperativní vazbu . To znamená, že vazba kyslíku na hemovou skupinu na hemoglobinu způsobuje příznivou změnu konformace, která umožňuje zvýšit příznivou vazbu kyslíku pro následující hemové skupiny. Za těchto okolností bude vazebná křivka hemoglobinu sigmoidální díky své zvýšené schopnosti vázat se na kyslík. Protože má myoglobin pouze jednu hemovou skupinu, vykazuje nespolupracující vazbu, která je ve vazebné křivce hyperbolická [34] .
Biochemické rozdíly mezi různými organismy a lidmi jsou užitečné pro vývoj léků. Například penicilin inhibuje bakteriální DD-transpeptidázové enzymy , narušuje syntézu bakteriální buněčné stěny a způsobuje buněčnou smrt. Studium vazebných míst je tedy relevantní pro mnoho oblastí výzkumu, včetně mechanismů rakoviny [7] , lékových forem [35] a fyziologické regulace [36] . Vývoj inhibitorů k potlačení funkce proteinů je běžnou formou farmaceutické terapie [37] .
V oblasti léčby rakoviny se k potlačení růstu nádoru používají ligandy, které jsou upraveny tak, aby měly vzhled podobný přirozenému ligandu. Například chemoterapeutikum metotrexát působí jako kompetitivní inhibitor aktivního místa dihydrofolátreduktázy [38] . Tato interakce inhibuje syntézu tetrahydrofolátu a zastavuje produkci DNA, RNA a proteinů [38] . Inhibice této funkce inhibuje růst nádoru a zlepšuje těžkou psoriázu a revmatoidní artritidu u dospělých [37] .
U kardiovaskulárních onemocnění se k léčbě pacientů s hypertenzí používají léky, jako jsou beta-blokátory. Beta-blokátory (β-blokátory) jsou antihypertenziva, která blokují vazbu hormonů epinefrinu a norepinefrinu na β1 a β2 receptory v srdci a cévách. Tyto receptory typicky zprostředkovávají sympatickou odpověď bojuj nebo utíkej tím, že způsobují vazokonstrikci [39] .
Komerčně dostupné jsou také kompetitivní inhibitory. Botulotoxin , komerčně známý jako Botox, je neurotoxin, který způsobuje ochablou paralýzu ve svalech vazbou na nervy závislé na acetylcholinu. Tato interakce potlačuje svalové kontrakce a vytváří vzhled hladkého svalstva [40] .
Pro predikci umístění vazebných míst na proteinech byla vyvinuta řada výpočetních nástrojů [21] [41] [42] . Mohou být široce klasifikovány na základě sekvence nebo struktury [42] . Metody založené na sekvencích jsou založeny na předpokladu, že sekvence funkčně konzervovaných částí proteinů, jako je vazebné místo, jsou konzervované. Metody založené na struktuře vyžadují trojrozměrnou strukturu proteinu. Tyto metody lze dále rozdělit na šablonové a „kapesní“ metody [42] . Metody založené na šablonách hledají 3D podobnost mezi cílovým proteinem a proteiny se známými vazebnými místy. Kapesní metody hledají konkávní povrchy nebo skryté kapsy v cílovém proteinu, které mají vlastnosti, jako je hydrofobnost a schopnost vázat vodík, což by jim umožnilo vázat ligandy s vysokou afinitou [42] . Ačkoli se zde používá termín „kapsa“, podobné metody lze použít k predikci vazebných míst používaných při interakcích protein-protein, která jsou obvykle spíše plošší než „kapsy“ [43] .
| Enzymy | |
|---|---|
| Aktivita | |
| Nařízení | |
| Klasifikace | |
| Typy |
|