Sestavení Golden Gate , také klonování Golden Gate , je metoda klonování DNA , která umožňuje současně a uspořádaně sestavit několik fragmentů DNA do jednoho pomocí restrikčních endonukleáz typu II a bakteriofágové T4 DNA ligázy [1] [2] . Sestavení molekuly se provádí in vitro . Mezi nejčastěji používané restrikční endonukleázy typu IIs patří Bsal, BsmBI a BbsI.
Na rozdíl od nejběžnějších restriktáz, jako jsou EcoRI a BamHI , jsou restrikční enzymy používané pro Golden Gate schopny štěpit DNA mimo rozpoznávací místo a vytvářet tak nepalindromické lepkavé konce [3] . Díky schopnosti získat kteroukoli z 256 různých variant lepivých konců o délce 4 párů bází je možné sestavit molekulu DNA z velkého počtu fragmentů pomocí kombinací lepivých konců [3] . V praxi to znamená, že sekvence Golden Gate bude prakticky bezproblémová. Navíc, protože sekvence produktu syntézy nenese rozpoznávací místo pro restrikční enzym , jakmile je správně sestavena, nemůže být znovu štěpena restrikčními enzymy . To znamená, že reakce se stává prakticky nevratnou [3] .
Obvyklý protokol cyklovače specifikuje kolísání teploty od 16 °C (optimální pro ligázy) do 37 °C (optimální pro restrikční enzymy) [4] . Tato metoda syntézy může být použita jak pro jednu bezproblémovou inzerci, tak pro sestavení několika fragmentů DNA v jedné zkumavce [5] .
Sekvence obsahující „švy“ (stopy po použití klonovacích systémů) se často tvoří jako výsledek sestavení velkého množství fragmentů. Například ve vícesegmentové metodě sestavování Gateway jsou fragmenty DNA přidány k donorovému fragmentu spolu s dalšími sekvencemi att , které se shodují v sousedních segmentech. To vede k tomu, že v konečném produktu jsou fragmenty DNA odděleny sekvencemi att [6] . V sestavě BioBrick zůstává mezi fragmenty DNA přidanými do plazmidu osminukleotidový „šev“ kódující tyrosin a stop kodon [6] .
Syntéza Golden Gate využívá restrikční enzymy typu II , které štěpí sekvenci DNA mimo její rozpoznávací místo [6] . Stejný restrikční enzym typu II může vytvářet různé lepivé konce pro různé sekvence DNA. Zejména pomocí enzymu BsaI je teoreticky možné získat každou z 256 variant lepivých konců (délka 4 bp) v přítomnosti odpovídajících fragmentů DNA [6] . Při správné syntéze lepivých koncových úseků jsou tyto fragmenty spojeny bez "švy" mezi díly. V některých případech může být konečný produkt podmíněně bezproblémový – na obou stranách multifragmentového inzertu v donorové DNA mohou být ponechána rozpoznávací místa pro restrikční enzymy, aby se v následujících krocích vyřízl celý fragment [6] . Protože další fragmenty DNA mohou být vloženy do vektorů bez "švů" uvnitř otevřeného čtecího rámce , metoda Golden Gate je široce používána v proteinovém inženýrství [6] .
Ačkoli syntéza Golden Gate urychluje sestavení více segmentů, je užitečné použít speciální plasmidové architektury ke zvýšení výtěžku [5] . V každém kroku je metoda Golden Gate schopna sestavit až devět fragmentů DNA. To vyžaduje, aby lepivé konce sousedních fragmentů DNA, které mají být kombinovány, byly vzájemně homologní a místa rozpoznávání restrikčního enzymu by neměla být zahrnuta do vyříznutých fragmentů [5] . Po ligaci fragmentů s bakteriofágovou T4 DNA ligázou nebude produkt obsahovat rozpoznávací místa pro restrikční enzym IIS a nebude v dalším průběhu reakce resekován [5] . Naopak neligovaná místa mohou naopak interagovat s restrikčním enzymem, a tím přidávat další fragmenty do reakční směsi [5] . Při správném nastavení experimentu a volbě fragmentů DNA lze v jednom cyklu získat lineární produkt [5] .
Sestavení sekvence DNA restrikčním enzymem je regulováno různými klonovacími standardy, aby se minimalizovala degradace účinnosti klonování a narušení funkce plazmidu. Takové účinky mohou být způsobeny nesprávným sestavením, například pokud jsou v inzertu nebo vektoru nezamýšlená restrikční místa [7] .
Existují dva kroky pro klonování Golden Gate [7] . V první fázi je monogenní sekvence sestavena z takových prvků, jako je promotor , otevřené čtecí rámce a terminátor [7] . Poté, ve druhé fázi sestavení, se zkombinuje několik monogenních sekvencí získaných v první fázi [7] . K implementaci sestavy Golden Gate, která se skládá ze 2 a více stupňů, se používají standardní systémy MoClo (modulární klonování) a GoldenBraid [7] .
Standard MoClo rozděluje genetické prvky do 4 různých úrovní:
MoClo používá paralelní přístup, ve kterém všechny výsledné moduly úrovně 0 mají restrikční místa Bpil na obou stranách inzertu. Vektor, do kterého budou přidány geny, má dvě invertovaná rozpoznávací místa pro restrikční enzym Bsal a mezi nimi vyříznutý selekční marker. [7] Gen lacZ často funguje jako takový marker , který umožňuje negativní selekci plazmidů, ve kterých byl reportérový gen úspěšně nahrazen sestavenou DNA [7] . Lepivé konce každého modulu úrovně 0 a cílového vektoru musí být komplementární pouze k lepivým koncům sousedního fragmentu, přičemž sekvence kombinací lepivých konců určuje architekturu konečného produktu [7] . Sestavení Golden Gate obvykle začíná moduly úrovně 0 obsahujícími jednotlivé geny [5] . Aby bylo možné identifikovat nezamýšlená restrikční místa, je nutné provést sekvenování modulů úrovně 0 [5] . Pokud jsou však moduly úrovně 0 příliš velké, musí montáž začít se sekvencemi úrovně −1, které je také nutné sekvenovat [5] . Pokud byla sestava zahájena z fragmentů úrovně −1, moduly úrovně 0 není nutné znovu sekvenovat [5] .
Úroveň -1Fragmenty úrovně −1 se používají při sestavování dlouhých modulů úrovně 0 [5] . K získání a vývoji takových fragmentů se obvykle používá ligace sekvencí s tupými konci a následná PCR [5] . Cílový vektor by neměl obsahovat restrikční enzym typu II, který se používá v dalším kroku sestavování [5] .
Úroveň 0Moduly úrovně 0 jsou páteří systému MoClo, protože obsahují kompletní genetické prvky, jako je promotor , 5' nepřeložená oblast (UTR) , sekvence kódující protein a terminátor [5] . Pro úspěšné sestavení Golden Gate nesmí vnitřní sekvence modulů úrovně 0 obsahovat rozpoznávací místa II pro restrikční enzymy Bsal, Bpil a Esp3I, ale musí být lemovány (tj. lemovány) dvěma restrikčními místy Bsal v obrácené orientaci [5] .
Pokud bylo v důsledku sekvenování zjištěno, že modul úrovně 0 obsahuje nežádoucí restrikční místo, pak může dojít k mutaci in silico odstraněním nebo nahrazením jednoho nukleotidu [5] . Zároveň je nutné se ujistit, že vnesená mutace neovlivní vlastnosti produktu syntetizovaného z DNA (obvykle RNA nebo proteinu) [5] . Synonymní mutace se doporučuje zavést do sekvence kódující protein, protože nemění sekvenci syntetizovaného proteinu, a tudíž neovlivňují funkci genu [5] .
Úroveň 1Cílový vektor úrovně 1 určuje umístění a směr vloženého konstruktu [8] . V takovém vektoru je gen selekčního markeru ( lacZ ) lemován dvěma restrikčními místy na každé straně. V tomto případě je vnitřní místo (BsaI) převrácené a vnější místo (BpiI) je umístěno v přímé orientaci. Existuje 14 variant vektoru úrovně 1, které se liší v lepivých koncových sekvencích pro externí místa, ale neliší se v lepivých koncových sekvencích vnitřních míst [8] . Správně sestavenou sadu modulů úrovně 0 lze tedy naklonovat do kteréhokoli z těchto vektorů [8] .
Vektory úrovně 1 se používají pro přechodnou expresi v rostlinách řízených Agrobacterium [8] .
Úroveň 2Cílové vektory úrovně 2 mají 2 invertovaná rozpoznávací místa pro restrikční enzym Bpil pro vložení modulů úrovně 1 [8] . Restrikční místo ve vektoru před místem inzerce musí být komplementární k místu před startem genu v modulu úrovně 1, restrikční místo za místem inzerce je univerzální [8] . Při každém klonování lze do vektoru vložit 2 až 6 genů [8] .
Přidání více genů v jednom kroku je nežádoucí, protože pravděpodobně povede k nesprávnému sestavení v důsledku nesprávných kombinací lepivých konců [8] .
Sestavení konstruktů sestávajících z více než 6 genů tedy musí být provedeno v několika fázích. To vyžaduje koncové sekvence linkeru, které obsahují rozpoznávací místa restrikčního enzymu Bsal nebo BsmBI v obrácené poloze a nový selekční marker (modrý nebo fialový) [8] . V každé fázi je nutné změnit restrikční enzym a marker [8] . Při screeningu kolonie obsahující správně sestavený vektor změní barvu v každém kroku sestavování (modrou až fialovou), ale v posledním kroku, při použití uzavíracího koncového linkeru, bude barva kolonií bílá [8] .
Úroveň MCílové vektory úrovně M jsou podobné vektorům úrovně 2 s výjimkou přítomnosti místa Bsal před párem invertovaných míst Bpil [9] . Když je jeden nebo více genů klonováno do vektoru úrovně M, je přidáno druhé restrikční místo Bsal se specifickou (M) koncovou sekvencí linkeru. Díky tomu může být fragment obsahující všechny sestavené geny vyříznut a použit v další fázi klonování (úroveň P) [8] .
Úroveň PCílové vektory úrovně P jsou podobné vektorům úrovně M, ale místa Bpil jsou nahrazena Bsal a místa Bsal jsou nahrazena Bpil. Více konstruktů M úrovně s kompatibilními lepivými konci může být klonováno do cílového P vektoru v jediném kroku. Teoreticky je možné sestavit až 36 genů do jednoho konstruktu při běhu 6 paralelních reakcí úrovně M (každý 6 genů), ale v praxi se obvykle sestaví méně genů, protože tak velké konstrukty nejsou potřeba. ve většině projektů [8] . Navzdory tomu jsou vektory úrovně M a P navrženy tak, že geny klonované do vektoru úrovně P mohou být dále klonovány do vektoru úrovně M a naopak [8] .
Podle standardního protokolu Golden Gate se restrikční místa použitá v předchozím kroku klonování stanou nedostupnými [10] . Sestavení více než 6 genů vyžaduje jiný restrikční enzym typu II a zavedení jeho odpovídajících rozpoznávacích míst [10] . To lze provést pomocí vektorů úrovně 2 nebo úrovní M a P. GoldenBraid poskytuje variaci na systém úrovní M a P.
Pro klonování podle metody GoldenBraid se používá systém 4 plazmidů schopných vytvořit dvojitou smyčku (tzv. "girlandy" - "cop"). Takový systém umožňuje binární sestavení více struktur najednou [10] .
Metodu sestavování Golden Gate lze také použít k provedení mutageneze (Golden Mutagenesis). Tato technologie se snadno aplikuje díky online nástrojům pro výběr primerů ( webový nástroj GoldenMutagenesis ) a vektorům [11] .