Restrikční modifikační systém je enzymatický systém bakterií , který ničí cizí DNA , která vstoupila do buňky . Jeho hlavní funkcí je chránit buňku před cizím genetickým materiálem, jako jsou bakteriofágy a plazmidy . Složky systému se vyznačují dvěma typy aktivity - methyltransferázou (metylázou) a endonukleázou . Za každou z nich mohou být zodpovědné jak jednotlivé proteiny , tak jeden protein, který kombinuje obě funkce . [jeden]
Restrikční modifikační systém (SR-M) je specifický pro určité sekvence nukleotidů v DNA, nazývané restrikční místa . Pokud některé nukleotidy v sekvenci nejsou methylovány , zavede restrikční endonukleáza do DNA dvouřetězcový zlom (často s posunem několika nukleotidů mezi řetězci), přičemž je narušena biologická role molekuly DNA. V případě, že je methylován pouze jeden z řetězců DNA, nedochází k žádnému štěpení, místo toho methyltransferáza přidává methylové skupiny k nukleotidům druhého řetězce. Tato specifičnost SR-M umožňuje bakteriím selektivně štěpit cizí DNA bez ovlivnění jejich vlastní. Normálně je veškerá DNA v bakteriální buňce buď plně methylována nebo plně methylována pouze na jednom řetězci (ihned po replikaci ). Naproti tomu cizí DNA není methylována a podléhá hydrolýze. [jeden]
Systémy restrikce-modifikace byly objeveny jako výsledek studia molekulárních mechanismů jevu zvaného restrikce řízená hostitelem . Podstata jevu spočívá v tom, že bakteriofágy izolované z buněk jednoho kmene bakterií se velmi špatně množí v jiném. Při infekci virovými částicemi izolovanými z druhého kmene dochází u buněk prvního opět k potlačení reprodukce fágů, zatímco u druhého kmene se množí normálně. U bakterií je tedy pozorován systém potlačení reprodukce bakteriofágů. Viry, které ji ještě dokázaly překonat, se stávají vůči působení tohoto systému odolné. S. Luria a ML Human ve svém článku z roku 1952 [2] napsali:
Při analýze vztahu mezi určitými fágy a určitými mutanty jejich hostitelských bakterií jsme narazili na nový fenomén: genotyp hostitele, ve kterém se virus replikuje , ovlivňuje fenotyp nových virů. Fenotypové změny inhibují schopnost viru replikovat se v určitých kmenech. Jedná se o netrvalou změnu, jeden úspěšný cyklus rozmnožování ve vhodném hostiteli vrací virus do původní formy.
Původní text (anglicky)[ zobrazitskrýt] Při analýze vztahu mezi určitými fágy a určitými mutanty jejich bakteriálních hostitelů jsme narazili na novou situaci: genotyp hostitele, ve kterém se virus reprodukuje, ovlivňuje fenotyp nového viru. Fenotypová změna potlačuje schopnost viru reprodukovat se v určitých hostitelích, ale ne v jiných. Jde o přechodnou změnu v tom smyslu, že jeden cyklus růstu ve vhodném hostiteli vrátí virus do jeho původní formy.Následně bylo prokázáno, že bakteriofágy izolované z různých kmenů mají stejný genotyp, ale odlišný vzor methylace DNA, odpovídající specificitě CP-M tohoto kmene. [3]
V roce 1978 byli Werner Arber , Daniel Nathans a Hamilton Smith oceněni Nobelovou cenou za fyziologii a medicínu „za objev restrikčních enzymů a jejich aplikaci v molekulární genetice“.
Enzymy CP-M jsou pojmenovány podle systému navrženého v roce 1973 Smithem a Nathansem . [4] Název enzymu začíná třípísmennou zkratkou , ve které je první písmeno stejné jako první písmeno rodového jména a zbytek jsou první dvě písmena druhu , ve kterém byl enzym nalezen. . Zkratka je psána kurzívou. Další písmena slouží k označení konkrétního kmene nebo sérotypu . Římské číslice jsou přiřazeny v pořadí, ve kterém se enzymy daného typu nacházejí v konkrétním organismu. Další písmena a čísla nejsou kurzívou. Například:
V tištěných zdrojích jsou značné rozdíly v psaní názvů stejných enzymů (pokud jde o kurzívu a přítomnost mezer). V roce 2003 velká skupina vědců navrhla systematizovat klasifikaci a nomenklaturu restriktáz a methyltransferáz. [5] Zejména se navrhuje upustit od používání kurzívy, celý název by se měl psát bez mezer. Doporučuje se vyhnout se názvům „restrikční enzym“ a „metyláza“ a místo nich používat „restrikční endonukleáza“ a „methyltransferáza“; typ enzymatické aktivity je označen písmeny R (endonukleáza) a M (methyltransferáza) před zkratkou - M.EcoRI a R.EcoRI.
Restrikční endonukleázy zavádějí zlomy v obou řetězcích DNA a rozdělují je na dvě části. V závislosti na specifičnosti řezání DNA se tvoří produkty, které mají různé koncové struktury (viz obrázek).
Restrikční modifikace methyltransferas přidávají methylové skupiny k dusíkatým bázím nukleotidových zbytků DNA. Methylace může probíhat na pozicích N5 a N6 v adeninu , N4 a C5 - v cytosinu . Jediným donorem methylových skupin pro DNA metyltransferázy je S-adenosin-L-methionin . Ve většině případů je methylován pouze druhý řetězec semimethylované DNA, zatímco zcela nemetylovaná DNA je štěpena díky endonukleázové aktivitě CP-M.
Všechny CP-M vyžadují Mg 2+ jako kofaktor. SR-M prvního a třetího typu potřebuje ATP a čtvrtý - v GTP . S-adenosylmethionin může sloužit nejen jako donor methylových skupin, ale také jako alosterický regulátor.
V současné době se na základě podjednotkové struktury, substrátové specifity, požadavku enzymu na kofaktory a charakteru štěpení DNA [1] rozlišují čtyři typy restrikčně-modifikačních systémů. [5] [6]
CRM prvního typu jsou tvořeny pěti podjednotkami, které fungují jako celek. Podjednotky jsou označeny zkratkou Hsd (host specificity determinant) a písmenem odpovídajícím funkci (M - DNA methyltransferáza , R - restrikční endonukleáza , S - rozpoznání substrátu). CP-M prvního typu je komplex dvou HsdM, dvou HsdR a jednoho HsdS. HsdR štěpí fosfodiesterové vazby v DNA a má helikázovou aktivitu. HsdM produkuje methylaci adeninových zbytků v restrikčních místech na šestém atomu dusíku (m6A). HsdS poskytuje rozpoznání určitých oblastí DNA a určuje specifitu SR-M. [7]
Při působení na nemethylovanou DNA převažuje aktivita nukleázy, de novo metylaci lze provádět s extrémně nízkou účinností, což umožňuje bakteriofágům překonat působení CP-M a získat schopnost množit se v novém kmeni (podrobněji viz výše ).
Restrikční místo je asymetrická dvoudílná sekvence: 5' sekvence 3-5 specifických nukleotidů je oddělena 6-8 nukleotidy jakéhokoli typu od 3' specifické sekvence 4-5 párů bází. Po rozpoznání cíle se enzymatický komplex pohybuje po molekule DNA, odvíjí ji ( aktivita helikázy ), dokud nenarazí na překážku (např. jiný protein). Zlom je tedy zaveden ve velké libovolné vzdálenosti (tisíce párů bází) od restrikčního místa. [7] Štěpení DNA CP-M typu I vyžaduje hydrolýzu ATP . To je způsobeno skutečností, že k pohybu podél molekuly DNA a jejímu rozvinutí po rozpoznání místa CP-M je zapotřebí energie. ATP se využívá pomocí tzv. DEAD motor [7] je konzervovaná dvoudoménová struktura charakteristická pro helikázy a některé další proteiny (například molekulární motor Sec translokázy SecA). [osm]
Tento typ je rozdělen do čtyř rodin (IA-D) na základě genetické komplementace, hybridizace DNA a imunitní zkřížené reaktivity (zkřížené reaktivity s protilátkami ). [9]
V restrikčně-modifikačních systémech tohoto typu jsou methyltransferázové a nukleázové aktivity ve většině případů zajišťovány nezávislými proteiny. Endonukleázy štěpí DNA v přesně definovaných polohách uvnitř restrikčního místa nebo v jeho blízkosti, výsledkem je, že konce DNA v místě zlomu mají 3'-hydroxylové skupiny a 5'-fosfátové skupiny. Díky těmto vlastnostem jsou endonukleázy tohoto typu (zejména IIP) široce používány v genetickém inženýrství . SR-M II ke svému fungování nepotřebuje ATP ani jiné zdroje energie. Aktivní nukleázy mohou existovat jako monomer , homodimer nebo homotetramer (pro různé systémy). [5]
Methyltransferázy obvykle fungují jako monomer. Methylace nastává na čtvrté (N) nebo páté (C) poloze v cytosinovém zbytku nebo na šestém (N) - adeninu (pro různé systémy má každý jednotlivý enzym přísnou specificitu). [5]
Existuje několik podskupin SR-M typu II, některé systémy mohou patřit do několika z nich najednou. [5]
Délka rozpoznaného palindromu je ve většině případů 4, 6 nebo 8 nukleotidů. Štěpení nastává ve fixní poloze v restrikčním místě nebo bezprostředně vedle něj. Různé enzymy přitom způsobují tvorbu jak lepivých, tak tupých konců.
SR-M typu III zahrnují dvě podjednotky (Res a Mod), které se spojují do heterotetrameru (Res 2 Mod 2 ) [7] s endonukleázovou a methyltransferázovou aktivitou. Podjednotka Res má helikázovou aktivitu a ke své funkci vyžaduje hydrolýzu ATP . [6] Na rozdíl od CP-M typu 1 vyžaduje hydrolýza DNA interakci dvou enzymových komplexů. Rozpoznají dvě identická restrikční místa v opačných orientacích. Místa mohou být nemethylovaná nebo methylovaná s jedním řetězcem. [7]
Mod podjednotka může fungovat odděleně od Res a působí jako methyltransferáza (m6A). Současně se nukleázová aktivita podjednotky Res projevuje pouze tehdy, když je v komplexu s Mod. [5]
SR-M typu IV štěpí pouze modifikovanou DNA obsahující methylované, hydroxymethylované nebo glykosyl-hydroxymethylované báze. Štěpení DNA vyžaduje hydrolýzu GTP . Endonukleázová aktivita je zajištěna jediným polypeptidem. Aktivita methyltransferázy chybí [10] . Nukleázová aktivita je alostericky aktivována S-adenosylmethioninem . Restrikční místo je asymetrické a skládá se ze dvou oddělených částí. Řezání DNA probíhá poblíž jednoho z míst. [6] [7]