Polymerázová řetězová reakce v reálném čase

Real-time polymerázová řetězová reakce (neboli kvantitativní PCR, qPCR, PCR-RT, angl.  Real-time PCR, qPCR ) je laboratorní metoda založená na metodě polymerázové řetězové reakce , která umožňuje určit nejen přítomnost cílového nukleotidu . sekvence ve vzorku, ale také změřte počet kopií. Množství amplifikované DNA se měří po každém amplifikačním cyklu pomocí fluorescenčních značek: sond nebo interkalátorů . Hodnocení může být kvantitativní (měření počtu kopií templátu) a relativní (měření vzhledem k vnesené DNA nebo dodatečným kalibračním genům ) [1] .

Modifikovaná kvantitativní metoda PCR se nazývá semikvantitativní PCR (semikvantitativní PCR). Často se používá k porovnání exprese více genů. V tomto případě se množství nashromážděného produktu měří pouze v jednom bodě – po zastavení reakce. [2]

Real-time PCR se často kombinuje s dalšími metodami: RT-PCR ( RT-qPCR ) , ChIP - qPCR atd. [3]

Popis metody

Postup qPCR je podobný klasickému postupu PCR , to znamená, že jsou přítomny všechny fáze reakce - tání dvouřetězcové DNA při teplotě 95˚C, nasedání primerů (teplota nasedání závisí na použitých primerech) a prodlužování při teplota 72˚C, pokud se použije Taq polymeráza . Množství produktu PCR se měří v každém cyklu PCR pomocí fluorescenčních značek. Síla signálu tedy indikuje počáteční množství sledované molekuly [4] .

Graf zesílení

Nomenklatura běžně používaná pro qPCR je:

  1. Základní linie jsou cykly PCR, ve kterých je fluorescenční signál pod hodnotou, kterou může přístroj detekovat.
  2. ΔRn je přírůstek fluorescenčního signálu v každém časovém okamžiku.
  3. Prahová čára je libovolná úroveň fluorescence vybraná na základě základní linie. Signál, který je detekován nad prahovou hodnotou, je považován za skutečný signál, který lze použít k určení prahového cyklu (Ct) pro vzorek. Práh lze upravit pro každý experiment tak, aby byl v exponenciální oblasti na všech grafech.
  4. Prahový počet cyklů (Ct) je počet cyklů PCR, při kterých fluorescence překročí prahovou hodnotu.

Graf se skládá ze základní linie, exponenciální fáze a plató [5] .

V počátečních fázích je fluorescence slabá, protože produktu je málo, takže je obtížné jej odlišit od pozadí. Jak se produkt hromadí, signál roste nejprve exponenciálně a poté dosáhne plató. Plató je způsobeno nedostatkem jedné nebo druhé složky reakce - primery , nukleotid trifosfáty , může dojít k vybití fluorescenční značky. Pokud se nahromadilo příliš mnoho reakčního produktu, pak se polymeráza může stát omezujícím faktorem a pak se závislost množství produktu na cyklu stane lineární . Stojí za zmínku, že při standardní reakci PCR v reálném čase se všechny vzorky ustálí a dosáhnou přibližně stejné úrovně signálu. Koncový bod tedy nevypovídá nic o počátečním množství testovaného vzorku. Na druhou stranu v exponenciální fázi lze vysledovat rozdíly v rychlosti růstu množství produktu. Rozdíly v počátečním počtu molekul ovlivňují počet cyklů potřebných ke zvýšení úrovně fluorescence nad úroveň šumu [5] .

Ct je číslo, které lze použít k posouzení množství cílové DNA v roztoku, ale hodnota Ct může záviset na mnoha náhodných faktorech, jako je citlivost detektoru , kvalita filtru atd. Přesné počáteční množství produktu, který nás zajímá, nelze měřit. K vyřešení tohoto problému existují normalizační metody . Změřte poměr množství dvou molekul ve vzorku. Obvykle jsou normalizovány na produkty provozních  genů - genů, jejichž počet v buňce je vždy přibližně stejný (příkladem je gen infA, kódující translační iniciační faktor u bakterií ) . Poměr se určuje podle následujícího vzorce:

kde a  jsou počáteční množství dvou vzorků, Ct B a Ct A  jsou odpovídající Ct hodnoty a  je to účinnost PCR, která se často rovná nebo [5] .

Analýza křivky tání

PCR v reálném čase umožňuje identifikaci specifických amplifikovaných fragmentů DNA pomocí analýzy jejich teploty tání (denaturace), označované také jako hodnota Tm. Metoda používá interkalační barviva, obvykle SYBR Green . Teplota tání DNA je specifická pro amplifikovaný fragment. Výsledky této metody byly získány porovnáním disociačních křivek analyzovaných vzorků DNA. Pro analýzu jsou vyneseny dvě křivky tání. Prvním je závislost fluorescence na čase, druhým je rychlost poklesu fluorescence na čase. Vrchol odráží specifický vzor DNA [5] .

Klasifikace použitých fluoroforů

Nespecifická definice: kvantitativní PCR s barvivy vázajícími dvouvláknovou DNA jako reportéry

V tomto případě je značka chemická sloučenina schopná zabudování do dvoušroubovice DNA . Taková sonda mění svou konformaci po interakci s produkty PCR a stává se fluoroforem . Stanovení produktu lze provést na konci každého cyklu, před krokem denaturace . Příkladem takového nátěru je široce používaný SYBR Green. Nicméně barviva dvouřetězcové DNA (dsDNA) se budou vázat na veškerou dsDNA, včetně nespecifických produktů PCR (jako je dimer primeru ). To může potenciálně interferovat s přesností monitorování cílové sekvence [6] .

Specifická definice: fluorescenční reportérová sonda

Fluorescenční sondy detekují pouze sekvenci obsahující DNA komplementární k sondě; proto použití reportérové ​​sondy značně zvyšuje specificitu a umožňuje přesnější měření v přítomnosti jiné dsDNA . Fluorescenční reportérové ​​sondy však nebrání inhibičnímu účinku primerových dimerů, které mohou potlačit akumulaci cílových reakčních produktů [7] .

Je také možné použít několik sond, jejichž fluorofory mají různá emisní spektra . V tomto případě je možné zaregistrovat signál z různých molekul DNA v jedné zkumavce. Metoda se nazývá multiple PCR (angl. multiplex PCR ) [8] .

Metoda je založena na zavedení DNA sondy komplementární k amplifikačnímu produktu s fluorescenčním reportérem na jednom konci sondy a fluorescenčním zhášečem na opačném konci. Když je zhášeč v těsné blízkosti reportéru, absorbuje signál a reportér nefluoreskuje . Během amplifikace je narušena integrita sondy a reportér může být detekován fluorescencí po laserové excitaci. Zvyšování množství produktu, ke kterému se reportérová sonda váže v každém cyklu PCR, tedy způsobuje proporcionální zvýšení fluorescence . Značky mohou fluoreskovat v elongační fázi nebo ve fázi PCR annealing [4] .

Fluorofor a jeho zhášeč jsou našity na sondu z 5' a 3' konců . Pokud sekvence sondy není příliš dlouhá, pak i ve stavu navázaném na DNA budou vzájemně interagovat a nebude emitována žádná fluorescence. Během elongace DNA polymeráza , která má 5'-3'-exonukleázovou aktivitu (často používaná Taq polymeráza ), disociuje sondu od cílové DNA jeden nukleotid po druhém. V důsledku tohoto procesu se fluorofor i jeho zhášeč dostanou do roztoku, kde pravděpodobnost nalezení těchto látek v blízkosti bude malá a dojde k obnovení fluorescence [4] .

  1. Fluorogenní vlásenka  je malá jednovláknová molekula DNA, která je ve svém volném stavu schopna vytvořit speciální prostorovou strukturu DNA - vlásenku . Na jeden konec řetízku je přišitý fluorofor a na druhý látka, která jej zháší. Sekvence sondy je komplementární k cílové DNA. V tomto případě ty molekuly sondy, které plavou v roztoku, nevydají fluorescenční signál a ty, které jsou navázané na molekuly DNA , projdou konformačními změnami, které povedou k prostorové separaci fluoroforu a jeho zhášeče a obnovení fluorescence. Registraci je vhodné provést po denaturaci [4] .
  2. Štítek založený na metodě FRET . Základem této metody je přítomnost dvou sond, které se vážou na cílovou DNA v krátké vzdálenosti od sebe. Donor fluoroforu a akceptor fluoroforu jsou přišity k 5' konci jedné sondy a 3' konci druhé sondy , v daném pořadí. Když jsou blízko u sebe, donorový fluorofor absorbuje světlo o určité vlnové délce a vyzařuje záři ve spektru delších vlnových délek . Tato vlna je naopak absorbována akceptorovým fluoroforem a emituje registrované světlo. [4] .

Aplikace

Real-time PCR je široce používána pro mnoho výzkumných aplikací v laboratořích. Kromě toho našla tato metoda uplatnění v lékařství (pro diagnostiku nemocí) a v oblasti biotechnologií (pro stanovení obsahu mikroorganismů v potravinách a rostlinných materiálech; pro detekci GMO ). qPCR se také používá pro genotypizaci a kvantifikaci virů a dalších lidských patogenů .

Vědecký výzkum

Kvantifikace genové exprese

qPCR se používá jako jedna z metod pro kvantitativní měření genové transkripce . Tato metoda je široce používána pro hodnocení změn v expresi určitého genu v průběhu času , například v reakci na podání léku nebo změny podmínek prostředí. Kvantifikace genové exprese pomocí tradičních metod detekce DNA je nespolehlivá. Detekce mRNA pomocí Northern blotu , produktů gel-PCR nebo Southern blotu neumožňuje přesnou kvantifikaci. Například během 20–40 cyklů typické PCR dosáhne množství produktu DNA úrovně, která přímo nesouvisí s množstvím cílové DNA v počáteční PCR [9] .

PCR v reálném čase lze použít ke kvantifikaci nukleových kyselin dvěma běžnými metodami: relativní kvantifikací a absolutní kvantifikací [10] . Absolutní kvantifikace poskytuje přesný počet cílových molekul DNA pomocí standardní křivky . Proto je důležité, aby PCR vzorku a standardu měly stejnou účinnost amplifikace . Relativní skórování je založeno na interních referenčních genech ( geny pro údržbu ) k určení násobku rozdílů v expresi cílových genů. Kvantifikace je vyjádřena jako změna v hladinách exprese mRNA interpretované jako komplementární DNA ( cDNA , generovaná reverzní transkripcí mRNA ). Relativní kvantifikace se provádí snadněji, protože nevyžaduje kalibrační křivku, protože množství studovaného genu se porovnává s množstvím kontrolního genu [11] .

qPCR k určení množství malé jaderné RNA (snRNA)

Malé jaderné RNA (snRNA) se svými vlastnostmi liší od mRNA velmi krátkou délkou (asi 22 nukleotidů ), nemají konzervativní sekvenci na koncích, zatímco snRNA jedné populace se mohou lišit o jeden nebo více nukleotidů . K vyřešení těchto problémů se používají přístupy založené na přidání malého kousku DNA (linkeru) k cDNA v reakci reverzní transkripce . Pak se provádí PCR v reálném čase standardními metodami s použitím primerů, (biologie)|komplementárních k linkeru [12] .

Genomické studie pomocí ChIP-qPCR

Chromatinová imunoprecipitace (ChIP) v kombinaci s RT-qPCR je považována za základní metodu v genomovém výzkumu, její komerční dostupnost a vysoká přesnost umožňují rychlou a snadnou analýzu interakcí protein-DNA. ChIP-qPCR se používá ke zkoumání specifických genů a potenciálních regulačních oblastí, jako jsou promotory . Tato metoda se v současnosti používá v různých studiích, včetně diferenciace buněk , umlčování supresorových genů a vlivu modifikací histonů na genovou expresi [13] .

Analýza ChIP zachycuje pouze zlomek možných cílů přítomných v celém genomu kvůli variabilitě účinnosti zesíťování a sterickému omezení dostupnosti protilátek [13] .

Pro provedení ChIP-qPCR je nutné přidat master mix (směs enzymů a nukleotidů ), primery a templátovou DNA. V tomto případě je nutné přesně zvolit koncentraci primerů pro efektivní amplifikaci cílové DNA. Jako templát slouží buď ChIP DNA, nebo v případě negativní kontroly prázdné kuličky bez DNA. Poté je nutné zvolit čas a teplotu cyklů žíhání a spustit PCR. Výsledky jsou analyzovány podobně jako výsledky qPCR s porovnáním prahového počtu cyklů (Ct) pro vstupní templát a templát ChIP DNA [3] .

Lékařská diagnostika

Kvantitativní PCR se používá k rychlé identifikaci genů nebo fragmentů DNA, které jsou markery infekčních onemocnění , genetických abnormalit apod. Zavedení této metody do klinických laboratoří výrazně zlepšilo kvalitu diagnostiky infekčních onemocnění [14] . Kromě toho se qPCR používá jako nástroj pro detekci nově se objevujících onemocnění. Například nové kmeny chřipky [15] .

Použití qPCR také umožňuje kvantitativní měření a genotypizaci (charakterizaci kmenů) virů , jako je virus hepatitidy B [16] . Stupeň infekce , který se měří jako počet kopií virového genomu na jednotku tkáně pacienta, je velmi důležitý. Například pravděpodobnost reaktivace viru herpes simplex typu 1 závisí na počtu infikovaných ganglií [17] .

U pacientů s podezřením na infekci koronavirem je odebrán výtěr z krku, RNA je extrahována a analyzována pomocí RT-qPCR . Cílové geny jsou otevřený čtecí rámec 1ab (ORF1ab) a nukleokapsidový protein (N). Prahová hodnota cyklu (hodnota Ct) menší než 37 je definována jako pozitivní výsledek testu a hodnota Ct 40 nebo více je definována jako negativní výsledek testu. Tato diagnostická kritéria vycházejí z doporučení Národního ústavu pro kontrolu a prevenci virových onemocnění [18] .

Senzitivita testu RT-qPCR je 83,3 %, tento test je náchylný k falešně negativním výsledkům . K diagnostice koronaviru se také používá počítačová tomografie , jejíž citlivost je mnohem vyšší a dosahuje 97,2 % [19] .

Kvantitativní PCR se také široce používá k detekci nádorových buněk u solidních nádorů [20] [21] a dokonce i u některých forem leukémie [22] [23] .

qPCR pomáhá při detekci cirkulujících nádorových buněk . Například rakovina prsu je stále nejčastější příčinou úmrtí mezi pacientkami s rakovinou. Kromě toho je smrt často způsobena metastázami , které se objevily . Metastázy vznikají v důsledku toho, že se buňky schopné proliferace oddělí od nádoru , dostanou se do krevního oběhu a znovu se usadí v některé části těla. Tyto buňky se nazývají cirkulující kmenové buňky (CSC). Přítomnost takových buněk v krvi pacientů s rakovinou prsu je zpravidla spojena se špatnou prognózou výsledku terapie a přežití obecně, proto je velmi důležitým diagnostickým parametrem. Ale kvůli velmi nízkému počtu je identifikace CVT  obtížný úkol.

A k vyřešení tohoto problému lze použít qPCR jako vysoce citlivou metodu. CST jsou epiteliálního původu, a proto exprimují určitý soubor genů , který se liší od krevních buněk , které je obklopují a které jsou mezenchymálního původu. Pro aplikaci této metody je nutné určit soubor genů CST markerů a vyhodnotit úroveň jejich exprese [24] .

V mikrobiologii

Real-time PCR se využívá také pro mikrobiologické práce v oblasti bezpečnosti potravin, pro hodnocení kvality vod (pitných a odpadních vod) a v oblasti veřejného zdraví [25] . Kromě toho se tato metoda používá k identifikaci střevní mikroflóry [26] .

Detekce fytopatogenů

Agroprůmysl produkuje semena a sazenice bez patogenů , aby se předešlo ekonomickým ztrátám a zvýšila se trvanlivost produktů. Proto byly vyvinuty systémy pro detekci malých množství phytophthora ( Phytophthora ramorum ), oomycet a některých dalších patogenů , které zabíjejí duby a další rostlinné druhy smíchané s DNA hostitelské rostliny. Schopnost rozlišit mezi DNA patogena a hostitelskou rostlinou je založena na amplifikaci sekvencí ITS ( vnitřní transkribovaný spacer) , vnitřních transkribovaných oblastí umístěných v kódující oblasti genu ribozomální RNA , které jsou charakteristické pro každý taxon [27 ] .

Identifikace geneticky modifikovaných organismů

qPCR (pomocí reverzní transkripce ) lze použít k detekci geneticky modifikovaných organismů , protože je citlivější než mnoho jiných metod. V tomto případě se k amplifikaci promotorových, terminátorových nebo meziproduktových sekvencí používaných v procesu tvorby vektoru používají specifické primery . Protože proces vytváření transgenní rostliny obvykle vede k vložení více než jedné kopie transgenu , jeho množství se také obvykle odhaduje pomocí qPCR. V tomto případě je rostlina obsahující tento gen v jediné kopii použita jako kontrola [28] [29] .

Poznámky

  1. ↑ VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM Dvacet pět let kvantitativní PCR pro  analýzu genové exprese //  Biotechniques : deník. - 2008. - Sv. 44 . - S. 619-626 . - doi : 10.2144/000112776 . — PMID 18474036 .
  2. ↑ Selma Gouvêa-Barros, Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira. Semikvantitativní PCR pro kvantifikaci hepatotoxických cyanobakterií  // Journal of Environmental Protection. - 2012. - T. 03 , no. 05 . — S. 426–430 . — ISSN 2152-2219 2152-2197, 2152-2219 . - doi : 10.4236/jep.2012.35053 .
  3. ↑ 1 2 Tae Hoon Kim, Job Dekker. ChIP – kvantitativní polymerázová řetězová reakce (ChIP-qPCR)  (anglicky)  // Cold Spring Harbor Protocols. — 2018-05. — Sv. 2018 , iss. 5 . - P.pdb.prot082628 . - ISSN 1559-6095 1940-3402, 1559-6095 . - doi : 10.1101/pdb.prot082628 .
  4. ↑ 1 2 3 4 5 Provenzano M. , Mocellin S. Doplňkové techniky: validace dat genové exprese pomocí kvantitativní PCR v reálném čase.  (anglicky)  // Pokroky v experimentální medicíně a biologii. - 2007. - Sv. 593 . - str. 66-73 . - doi : 10.1007/978-0-387-39978-2_7 . — PMID 17265717 .
  5. ↑ 1 2 3 4 Kubista M. , Andrade JM , Bengtsson M. , Forootan A. , Jonák J. , Lind K. , Sindelka R. , Sjöback R. , Sjögreen B. , Strömbom L. , Ståhlberg A. , Zoric N Polymerázová řetězová reakce v reálném čase.  (anglicky)  // Molecular Aspects Of Medicine. - 2006. - Duben ( roč. 27 , č. 2-3 ). - S. 95-125 . - doi : 10.1016/j.mam.2005.12.007 . — PMID 16460794 .
  6. ↑ Xiujuan Peng, Alex Nguyen, Debadyuti Ghosh. Kvantifikace bakteriofágů M13 a T7 pomocí TaqMan a SYBR green qPCR  (anglicky)  // Journal of Virological Methods. — 2018-02. — Sv. 252 . — S. 100–107 . — ISSN 0166-0934 . - doi : 10.1016/j.jviromet.2017.11.012 .
  7. ↑ E. Navarro, G. Serrano-Heras, M. J. Castaño, J. Solera. Chemie detekce PCR v reálném čase  (anglicky)  // Clinica Chimica Acta. — 2015-01. — Sv. 439 . — S. 231–250 . - doi : 10.1016/j.cca.2014.10.017 . Archivováno 1. května 2020.
  8. ↑ Steve F. C. Hawkins, Paul C. Guest. Multiplexní analýzy využívající kvantitativní PCR v reálném čase  //  Multiplexní biomarkerové techniky. — New York, NY: Springer New York, 29. 11. 2016. — S. 125–133 . - ISBN 978-1-4939-6729-2 , 978-1-4939-6730-8 .
  9. ↑ L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon. Využití PCR s reverzní transkriptázou v reálném čase pro kvantifikaci exprese genu pro cytokiny  // Journal of biomolekulárních technik: JBT. — 2003-03. - T. 14 , č.p. 1 . — s. 33–43 . — ISSN 1524-0215 ​​. Archivováno z originálu 29. dubna 2016.
  10. ↑ S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group. Porovnání různých standardů pro absolutní kvantifikaci založenou na PCR v reálném čase  // Journal of Immunological Methods. — 2010-03-31. - T. 354 , č.p. 1-2 . — s. 34–39 . — ISSN 1872-7905 . - doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . Archivováno z originálu 2. března 2019.
  11. ↑ Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Příručka PCR v reálném čase / Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). — Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). - 2014. - S. 40-43. — 68 s.
  12. ↑ Benes V. , Castoldi M. Profilování exprese mikroRNA pomocí kvantitativní PCR v reálném čase, jak ji používat a co je k dispozici.  (anglicky)  // Metody (San Diego, Kalifornie). - 2010. - Duben ( vol. 50 , č. 4 ). - str. 244-249 . - doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.026 . — PMID 20109550 .
  13. ↑ 12 Patrik Asp. Jak kombinovat ChIP s qPCR  //  Chromatin Immunoprecipitation / Neus Visa, Antonio Jordán-Pla. - New York, NY: Springer New York, 2018. - Sv. 1689 . — S. 29–42 . - ISBN 978-1-4939-7379-8 , 978-1-4939-7380-4 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_3 .
  14. ↑ Sails AD (2009). Aplikace v klinické mikrobiologii. Real-Time PCR: Současná technologie a aplikace . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  15. ↑ FDA povoluje nouzové použití léků proti chřipce, diagnostický test v reakci na vypuknutí prasečí chřipky u lidí. Zprávy FDA, 27. dubna 2009.
  16. ↑ Yeh SH , Tsai CY , Kao JH , Liu CJ , Kuo TJ , Lin MW , Huang WL , Lu SF , Jih J. , Chen DS , Chen PJ Kvantifikace a genotypizace viru hepatitidy B v jediné reakci pomocí PCR v reálném čase a analýza křivky tání.  (anglicky)  // Journal of Hepatology. - 2004. - říjen ( roč. 41 , č. 4 ). - S. 659-666 . - doi : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . — PMID 15464248 .
  17. ↑ Sawtell NM Pravděpodobnost in vivo reaktivace viru herpes simplex typu 1 se zvyšuje s počtem latentně infikovaných neuronů v gangliích.  (anglicky)  // Journal Of Virology. - 1998. - srpen ( roč. 72 , č. 8 ). - S. 6888-6892 . — PMID 9658140 .
  18. ↑ Dawei Wang, Bo Hu, Chang Hu, Fangfang Zhu, Xing Liu. Klinické charakteristiky 138 hospitalizovaných pacientů s novou pneumonií infikovanou koronavirem v roce 2019 ve Wuhan, Čína   // JAMA . — 2020-03-17. — Sv. 323 , iss. 11 . - str. 1061 . — ISSN 0098-7484 . doi : 10.1001 / jama.2020.1585 . Archivováno 1. dubna 2020.
  19. ↑ Chunqin Long, Huaxiang Xu, Qinglin Shen, Xianghai Zhang, Bing Fan. Diagnóza koronavirového onemocnění (COVID-19): rRT-PCR nebo CT?  (anglicky)  // European Journal of Radiology. — 2020-05. — Sv. 126 . — S. 108961 . doi : 10.1016 / j.ejrad.2020.108961 . Archivováno 14. května 2020.
  20. ↑ Cen P. , Ni X. , Yang J. , Graham DY , Li M. Cirkulující nádorové buňky v diagnostice a léčbě rakoviny slinivky břišní.  (anglicky)  // Biochimica Et Biophysica Acta. - 2012. - prosinec ( roč. 1826 , č. 2 ). - S. 350-356 . - doi : 10.1016/j.bbcan.2012.05.007 . — PMID 22683404 .
  21. ↑ Young R. , Pailler E. , Billiot F. , Drusch F. , Barthelemy A. , Oulhen M. , Besse B. , Soria JC , Farace F. , Vielh P. Circulující nádorové buňky u rakoviny plic.  (anglicky)  // Acta Cytologica. - 2012. - Sv. 56 , č. 6 . - S. 655-660 . - doi : 10.1159/000345182 . — PMID 23207444 .
  22. ↑ Brüggemann M. , Gökbuget N. , Kneba M. Akutní lymfoblastická leukémie: sledování minimální reziduální nemoci jako terapeutický princip.  (anglicky)  // Seminars In Oncology. - 2012. - únor ( roč. 39 , č. 1 ). - str. 47-57 . - doi : 10.1053/j.seminoncol.2011.11.009 . — PMID 22289491 .
  23. ↑ DiNardo CD , Luger SM Beyond morphology: minimální reziduální detekce onemocnění u akutní myeloidní leukémie.  (anglicky)  // Aktuální názor v hematologii. - 2012. - březen ( roč. 19 , č. 2 ). - S. 82-88 . - doi : 10.1097/MOH.0b013e3283501325 . — PMID 22314322 .
  24. ↑ Andergassen U. , Kölbl AC , Hutter S. , Friese K. , Jeschke U. Detekce cirkulujících nádorových buněk z krve pacientů s rakovinou prsu prostřednictvím RT-qPCR.  (anglicky)  // Cancers. - 2013. - 25. září ( ročník 5 , č. 4 ). - S. 1212-1220 . - doi : 10.3390/rakovina5041212 . — PMID 24202442 .
  25. ↑ Filion, M (redaktor) (2012). Kvantitativní PCR v reálném čase v aplikované mikrobiologii Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0 .
  26. ↑ Nobre Giselle , S. Miglioranz Lucia Helena. Probiotika: Účinky na lidské zdraví a současné vyhlídky   // Probiotika . - 2012. - 3. října. — ISBN 9789535107767 . - doi : 10.5772/50048 .
  27. ↑ Baldwin BG Fylogenetická užitečnost vnitřních transkribovaných spacerů jaderné ribozomální DNA v rostlinách: příklad z compositae.  (anglicky)  // Molecular Phylogenetics And Evolution. - 1992. - březen ( roč. 1 , č. 1 ). - str. 3-16 . — PMID 1342921 .
  28. ↑ Holst-Jensen A. , Rønning SB , Løvseth A. , Berdal KG Technologie PCR pro screening a kvantifikaci geneticky modifikovaných organismů (GMO).  (anglicky)  // Analytická a bioanalytická chemie. - 2003. - Duben ( roč. 375 , č. 8 ). - str. 985-993 . - doi : 10.1007/s00216-003-1767-7 . — PMID 12733008 .
  29. ↑ Brodmann PD , Ilg EC , Berthoud H. , Herrmann A. Metody kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase pro čtyři geneticky modifikované odrůdy kukuřice a obsah DNA kukuřice v potravinách.  (anglicky)  // Journal Of AOAC International. - 2002. - Květen ( roč. 85 , č. 3 ). - S. 646-653 . — PMID 12083257 .

Literatura

  • Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principy a aplikace. - Moskva: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .