Genomická knihovna

Genomická knihovna je sbírka DNA z celého genomu jednoho organismu. Tato DNA je uložena v populaci identických vektorů , z nichž každý obsahuje jiný inzert DNA.

Vytvoření genomické knihovny

Pro vybudování genomové knihovny je DNA extrahována z buněk a poté štěpena restrikčním enzymem , aby se DNA rozřezala na fragmenty určité velikosti [1] [2] . Fragmenty jsou poté vloženy do vektoru pomocí enzymu DNA ligázy . Dále může být DNA vektor vložen do hostitelského organismu - obvykle v populaci Escherichia coli ( E. coli ) nebo kvasinkách , kde každá buňka obsahuje kopie vektoru s jedním unikátním insertem.

Úložiště a aplikace

Použití hostitelské buňky k uložení vektoru umožňuje snadnou amplifikaci a identifikaci specifických klonů z knihovny pro analýzu. Genomická knihovna může být uložena po dlouhou dobu (zmražena). V případě potřeby se izolují a množí ( klonují ) jednotlivé bakteriální nebo kvasinkové klony obsahující fragmenty DNA s požadovanými geny nebo jinými prvky genomu . Takto klonované části genomu se izolují z buněk a používají se k řešení různých teoretických i praktických problémů genetiky , medicíny (včetně diagnostiky dědičných chorob ) a biotechnologií a také k mapování genomů [3] [4] [5 ] .

Screening (zanglického screening) knihovny, tedy hledání konkrétního fragmentu DNA mezi stovkami a tisíci dalších sekvencí, probíhá metodouDNA hybridizacepomocíDNA sond [3] . Pokud výzkumník zná alespoň malou sekvencinukleotidůz požadovaného místa, umělesyntetizuje komplementárnísekvenci (primerdlouhý asi 20 nukleotidů) a označí ji buďradioaktivním izotopemnebofluorescenčníznačkou. ZPetriho miskyskoloniemivyrobíreplikablotovánímnitrocelulózovánebo jiná membrána, na které zůstane otisk všech kolonií. Poté se provádí destrukce bakteriálních buněk na otisku, uvolnění DNA zproteinůvalkalickémmédiu a denaturace DNA na jednovláknovou molekulu. Poté jsou všechny kolonie ošetřeny sondou a sledují se, ke kterým z kolonií se sonda připojila podle principu komplementarity. Tato kolonie bude obsahovat požadovaný fragment DNA.

Někdy výzkumník nezná sekvenci DNA, kterou hledá, ale má aminokyselinovou sekvenci studovaného proteinu. Protože každé aminokyselině může odpovídat několik tripletů nukleotidů (od jednoho do šesti) , pravděpodobné kódující DNA mohou být různé. Pak je připravena směs sond, která dokáže rozpoznat domnělou sekvenci.

Moderní high-tech metody screeningu genomických knihoven (zejména těch vytvořených pomocí LHC - vektorů ) jsou založeny na použití robotické (automatizované) produkce v libovolném požadovaném počtu kopií, mikrodestičky pro uchovávání kolonií (klonů), stejně jako nitrocelulózové a nylonové membrány (filtry) používané přímo pro hybridizaci s DNA sondami. Dalšího zvýšení účinnosti screeningu je dosaženo použitím tzv. overgos sond (z anglického  over lapping oli gos  - „překrývající se oligonukleotidy “) jako DNA sond [3] [6] . Pro screening knihoven je také možné použít PCR .

Dalším typem genomové knihovny je mikrosatelitní knihovna, jejíž klony obsahují tandemové repetice . Jejich sekvenování umožňuje získat polymorfní DNA markery (mikrosatelitní lokusy ) pro různé genetické a genomické aplikace [7] .

Viz také

Poznámky

  1. ↑ Lee M.-K., Ren CW, Yan B., Cox B., Zhang H.-B., Romanov MN, Sizemore FG, Suchyta SP, Peters E., Dodgson JB Konstrukce a charakterizace tří knihoven BAC pro analýzu of the chicken genom  (angl.)  // Animal Genetics  : journal. - Oxford , Velká Británie : International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd , 2003. Vol. 34, č. 2 . - S. 151-152. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1046/j.1365-2052.2003.00965_5.x . — PMID 12648103 . Archivováno z originálu 22. února 2015.  (Přístup: 22. února 2015)
  2. ↑ Sazanov A. A., Romanov M. N., Smirnov A. F. Knihovny rozšířených genomových klonů jako nástroj pro molekulární cytogenetickou analýzu ptačího genomu  // Genetics  : journal. - M .: Nauka , 2005. -T. 41 , č. 5 . - S. 581-589 . — ISSN 0016-6758 . — PMID 15977807 . Archivováno z originálu 17. března 2015.  (Přístup: 17. března 2015)
  3. ↑ 1 2 3 Song B.-K., Nadarajah K., Romanov MN Ratnam W. Screening knihovny mezidruhových bakteriálních umělých chromozomů (BAC) prostřednictvím hybridizace založené na overgo a mapování BAC-contig kvantitativního lokusu pro zvýšení výnosu (QTL ) yld1.1 v malajské divoké rýži Oryza rufipogon  (anglicky)  // Cellular & Molecular Biology Letters : journal. — Wrocław , Polsko ; Berlin , Heidelberg , Německo : Cellular & Molecular Biology Letters, University of Wrocław , Ministerstvo vědy a vysokého školství, Polsko ; Springer Science+Business Media , 2005. Vol. 10, č. 3 . - S. 425-437. — ISSN 1425-8153 . — PMID 16217554 . Archivováno z originálu 15. března 2015.  (Přístup: 15. března 2015)
  4. ↑ Romanov MN, Koriabine M., Nefedov M., de Jong PJ, Ryder OA Konstrukce knihovny kalifornských kondorů BAC a první generace srovnávací fyzické mapy kuře–kondor jako  zdroj genomiky pro ochranu ohrožených druhů //  Genomics  : log . - Amsterdam , Nizozemsko : Academic Press Inc , Elsevier Science BV , 2006. - Sv. 88, č.p. 6 . - S. 711-718. — ISSN 0888-7543 . - doi : 10.1016/j.ygeno.2006.06.005 . — PMID 16884891 . Archivováno z originálu 18. února 2015.  (Přístup: 18. února 2015)
  5. ↑ Romanov MN, Dodgson JB, Gonser RA, Tuttle EM Komparativní mapování založené na BAC u vrabce bělohlavého, nový behaviorální genomický model využívající mezidruhovou overgo hybridizaci  // BMC Research Notes  : journal  . - London , UK: BioMed Central Ltd , 2011. - Vol. 4. - S. 211. - ISSN 1756-0500 . - doi : 10.1186/1756-0500-4-211 . — PMID 21693052 . Archivováno z originálu 2. března 2015.  (Přístup: 2. března 2015)
  6. ↑ Romanov MN , Dodgson JB Mezidruhová hybridizace a srovnávací fyzikální mapování v ptačích genomech  //  Animal Genetics: journal. — Oxford, Spojené království: International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd, 2006. - Sv. 37, č.p. 4 . - S. 397-399. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1111/j.1365-2052.2006.01463.x . — PMID 16879356 . Archivováno z originálu 15. února 2015.  (Přístup: 15. února 2015)
  7. ↑ Romanov MN , Jones KC , Chemnick LG , Stremel-Mork E. , Otten C. , Da Y. , Akhunov ED , Ryder OA (2009-01-10). Kalifornská knihovna obohacená o mikrosatelity kondorů jako nástroj pro genetické a genomické studie u ohrožených druhů . Mezinárodní konference o genomu rostlin a zvířat XVII, San Diego, 10.–14. ledna 2009 . San Diego , CA , USA : Scherago International. p. 107 Abstrakt P517 . Získáno 2009-01-10 . Archivováno 23. ledna 2012 na Wayback Machine 

Literatura