Western blot (western blot, proteinový imunoblot, angl. Western blot ) je analytická metoda používaná ke stanovení specifických proteinů ve vzorku . První krok využívá proteinovou elektroforézu v polyakrylamidovém gelu k separaci denaturovaných polypeptidů podle délky (obvykle v přítomnosti SDS ) nebo podle trojrozměrné struktury proteinu (v nativním stavu). Dále jsou proteiny přeneseny na nitrocelulózovou nebo PVDF membránu a poté detekovány pomocí protilátek specifických pro daný protein [1] [2] .
Existuje mnoho komerčních společností specializujících se na produkci protilátek ( monoklonálních i polyklonálních ) k desítkám tisíc různých proteinů [3] .
Western blotting se používá v molekulární biologii , biochemii , genetice a dalších přírodních vědních disciplínách.
Jiné podobné metody používají protilátky k detekci proteinů ve tkáních a buňkách pomocí imunobarvení a enzymatické imunoanalýzy ( ELISA ) .
Western blotting byl vyvinut v laboratoři George Starka ve Stanfordu . Název Western Blot dal této technice W. Neal Burnette [4] a jde o slovní hříčku ze jména Southern Blot , techniku detekce DNA dříve vyvinutou Edwinem Southernem . Podobná metoda stanovení RNA se nazývá Northern blotting , detekce posttranslačních modifikací proteinů se nazývá Eastern blotting .
Vzorek lze odebrat z celé tkáně nebo z buněčné kultury. Ve většině případů jsou tvrdé tkáně nejprve rozemlety pomocí mixéru (u velkých objemů vzorků), homogenizátoru (menší objemy) nebo sonikace . Zdrojem bílkovin jsou přitom také bakterie, viry a další složky životního prostředí.
Ke zlepšení buněčné lýzy a rozpouštění proteinů lze použít různé detergenty , soli a pufry . Inhibitory proteázy a fosfatázy se často přidávají, aby se zabránilo štěpení vzorků jejich vlastními enzymy . Příprava tkáně se často provádí při nízkých teplotách, aby se zabránilo denaturaci bílkovin .
K oddělení různých buněčných kompartmentů a organel se používají kombinace biochemických a mechanických frakcionačních technik, včetně různých typů filtrace a centrifugace .
Proteiny jsou separovány pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu. Separace proteinů může být provedena izoelektrickým bodem (pI), molekulovou hmotností , elektrickým nábojem nebo kombinací těchto parametrů.
Nejběžnější metodou pro separaci proteinů je elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného ( SDS ) podle Laemmliho . [5] SDS způsobuje denaturaci proteinů a udržuje je v denaturovaném stavu, k destrukci sekundárních a terciárních struktur proteinů se používají činidla redukující disulfidové vazby, jako je dithiothreitol a merkaptoethanol . Denaturované polypeptidy migrují v elektrickém poli přes akrylamidový gel k anodě , přičemž menší proteiny se pohybují rychleji a tím se oddělují podle molekulové hmotnosti. Koncentrace akrylamidu určuje rozlišení gelu – čím vyšší koncentrace akrylamidu, tím lepší rozlišení proteinů s nízkou molekulovou hmotností. Nízká koncentrace akrylamidu zlepšuje rozlišení pro vysokomolekulární proteiny. Je také možné použít dvourozměrnou elektroforézu (2-D) . V tomto případě se separace proteinů provádí ve dvou směrech - v souladu s jejich izoelektrickým bodem v prvním směru a v souladu s molekulovou hmotností - ve druhém.
Vzorky na gelu se aplikují do kapes. Zpravidla je jedna ze „stop“ ponechána pro markery molekulové hmotnosti (směsi proteinů se známými hmotnostmi). Po přivedení napětí se proteiny pohybují v elektrickém poli různou rychlostí. Rozdíly v rychlosti postupu – elektroforetické pohyblivosti – vedou k separaci proteinů do pásů ( anglicky bands ).
Pro zpřístupnění proteinů pro protilátky a další detekci se přenesou spolu s proužkem gelu na membránu vyrobenou z nitrocelulózy nebo polyvinylidenfluoridu ( PVDF ) . Membrána se nanese na gel a na ni se položí stoh filtračního papíru. Celý stoh je umístěn do přenosového pufru, který působením kapilárního účinku posune papír nahoru a nese s sebou proteiny. Další způsob přenosu proteinů se nazývá elektroblotting a využívá elektrický proud k přenosu proteinů z gelu na membránu. Proteiny se přesouvají z gelu do membrány, přičemž si zachovávají svou polohu. V důsledku tohoto procesu „blotting“ (z anglického blotting ) jsou proteiny zadržovány na tenké povrchové vrstvě detekční membrány. Obě membránové varianty se používají kvůli jejich nespecifickým vlastnostem vázat proteiny. Vazba na protein je založena jak na hydrofobních interakcích , tak na elektrostatických interakcích mezi membránou a proteinem. Nitrocelulózová membrána je levnější než PVDF, ale je mnohem křehčí a méně odolná vůči přeznačení.
Jednotnost a celkovou účinnost přenosu proteinů z gelu na membránu lze zkontrolovat barvením membrány barvivem Coomassie blue nebo Ponceau S . Coomassie je běžnější z těchto dvou, zatímco Ponceau S je citlivější a rozpustný ve vodě, což usnadňuje následné čištění a označování membrány. [6]
Jakmile byla membrána vybrána pro její schopnost vázat proteiny, byly vybrány protilátky a cílový protein, je třeba dbát na to, aby nedošlo k interakci mezi membránou a protilátkou použitou k detekci cílového proteinu (protože samotná protilátka je protein). Blokování nespecifické vazby je dosaženo umístěním membrány do zředěného proteinového roztoku - obvykle hovězího sérového albuminu nebo netučného sušeného mléka (obojí levné), s malým procentem detergentu, jako je Tween 20 nebo Triton X-100 . Protein ze zředěného roztoku je připojen k membráně ve všech místech, kde se nepřichytil cílový protein. Proto, když jsou protilátky přidány, jediné volné místo na membráně, kde se mohou připojit, jsou vazebná místa na specifických cílových proteinech. Tento "šum" na pozadí v konečném western blotu má za následek čisté výsledky a eliminaci falešně pozitivních výsledků.
Během detekčního procesu je membrána "označena" sledovaným proteinem modifikovanou protilátkou, která je navázána na reportérový enzym, který je udržován na vhodném nosiči, což vede ke kolorimetrické reakci a dává barvu. Z různých důvodů se detekce provádí ve dvou krocích, i když pro určité aplikace je nyní k dispozici jednokroková detekční metoda.
Protilátky jsou produkovány vystavením hostitelské třídy nebo kultury imunitních buněk nějakému proteinu (nebo jeho části). To je obvykle součástí imunitní odpovědi, ale zde (v testu) se shromážděné protilátky používají jako specifický a citlivý detekční nástroj, který se váže přímo na protein.
Po zablokování je naředěný primární roztok protilátky (obvykle mezi 0,5 a 5 ug/ml) inkubován s membránou a jemně protřepán. Obvykle se roztok skládá z pufrovaného solného roztoku s malým procentem detergentu, někdy sušeného mléka nebo BSA. Roztok protilátky a membrána mohou být uzavřeny dohromady a inkubovány kdekoli od 30 minut do noci. Mohou být také inkubovány při různých teplotách, při zvýšených teplotách je pozorována lepší vazba - jak specifická (cílového proteinu, "signal1"), tak nespecifická ("šum").
Po opláchnutí membrány za účelem odstranění nenavázaných primárních protilátek je membrána vystavena působení dalších protilátek, které se vážou přímo na oblasti primárních protilátek specifické pro třídu. Ty jsou známé jako sekundární protilátky a podle jejich cílových vlastností se běžně označují jako "anti-myší", "anti-kozí" a tak dále. Protilátky jsou získány ze zvířecího zdroje (nebo zvířecích zdrojů hybridomové kultury ); anti-myší sekundární protilátky se budou vázat na většinu primárních protilátek odvozených od myší. To vytváří určité úspory tím, že umožňuje jednotlivé laboratoři používat jediný zdroj hromadné produkce protilátek a vede k mnohem reprodukovatelnějším výsledkům. Sekundární protilátky jsou obvykle vázány na biotin nebo na reportérový enzym , jako je alkalická fosfatáza nebo křenová peroxidáza . To znamená, že několik sekundárních protilátek se může vázat na jednu primární a zesilovat signál.
Nejběžnější sekundární protilátky související s křenovou peroxidázou se používají k rozštěpení chemiluminiscenčního činidla a reakční produkt produkuje luminiscenční záření v poměru k množství proteinu. List fotosenzitivního fotografického filmu se umístí proti membráně a vystaví se reakčnímu záření, čímž se na blotu vytvoří obraz pruhů protilátek. Levnější, ale méně citlivý přístup využívající 4-chloronaftolové barvivo smíchané s 1% peroxidem vodíku ; reakcí peroxidového radikálu s 4-chloronaftolem vzniká tmavě hnědá barva, která se zaznamenává bez použití speciálního fotografického filmu.
Stejně jako u ELISPOT a ELISA může být enzym opatřen molekulou substrátu, která je enzymem přeměněna na barevný reakční produkt, který bude viditelný na membráně (viz obrázek s modrými pruhy níže).
Další sekundární metoda detekce protilátek využívá protilátky s navázaným fluoroforem, který vyzařuje v blízké infračervené oblasti (NIR). Světlo emitované fluorescenčním barvivem je konstantní a díky němu je fluorescenční detekce přesnější a citlivější způsob měření rozdílu v signálu produkovaném proteiny značenými protilátkami na Western blotu. Proteiny lze kvantifikovat tak, že se signál vypočítá jako rozdíl (záření) ve vztahu ke všem proteinům na membráně, měřeno v klidu, k (záření) chemiluminiscence, která se měří dynamicky. [7]
Třetí alternativní způsob používá radioaktivní značku místo enzymu navázaného na sekundární protilátku, jako je značený protein vázající protilátku typu Staphylococcus Protein A s radioaktivním izotopem jódu. Jiné metody jsou bezpečnější, rychlejší a levnější, proto se radioaktivní detekce používá jen zřídka.
Historicky byl proces značení prováděn ve dvou krocích, protože je relativně snadnější produkovat primární a sekundární protilátky v samostatných procesech. To dává výzkumníkům a společnostem obrovskou výhodu z hlediska flexibility a přidává krok zesílení do procesu detekce. Vzhledem k nástupu vysoce výkonných proteinových testů a nízkých detekčních prahů stále existuje zájem o vývoj jednokrokového systému značení, který umožní procesu běžet rychleji a s nižšími náklady. To (jednostupňový systém) vyžaduje značky protilátek, které by rozpoznaly studovaný protein a současně nesly marker pro detekci - značky nejdostupnější pro známé "proteinové ocasy". Nejprve jsou značky inkubovány s dvoukrokovou membránou s primárními protilátkami a poté jsou připraveny k přímé detekci po sérii promytí.
Po odmytí nenavázaných značek je Western blot připraven k detekci sond navázaných na cílový protein. V praxi ne všechny westerny vykazují proteiny pouze s jedním pásem na membráně. Přibližná velikost se vypočítá porovnáním obarvených pásů s markery molekulové hmotnosti přidanými elektroforézou. Proces se bude opakovat se strukturními proteiny, jako je aktin nebo tubulin , které se mezi experimenty nemění. Množství cílového proteinu závisí na množství kontrolního strukturálního proteinu mezi skupinami. Tato technika poskytuje korekci množství celkového proteinu na membráně v případě chyby nebo neúplného přenosu.
Metoda kolorimetrické detekce je založena na inkubaci Western blotu se substrátem, který reaguje s reportérovým enzymem (jako je křenová peroxidáza ) , „sedí“ na sekundární protilátce . Rozpustné barvivo se změní na nerozpustnou formu jiné barvy, vysráží se vedle enzymu a zabarví membránu. Růst skvrn je omezen smytím rozpustného barviva. Hladina proteinu se posuzuje denzitometricky podle intenzity barvení nebo spektrofotometricky .
Metoda chemiluminiscenční detekce je založena na inkubaci nitrocelulózové membrány se substrátem, který po interakci se sekundárním reportérem protilátky luminiscuje. Světlo je zaznamenáváno fotografickým filmem nebo CCD kamerou, která digitálně snímá Western blot. Obraz je analyzován denzitometricky , odhaduje se relativní množství obarveného proteinu a poskytuje kvantitativní výsledek v jednotkách optické hustoty. Nový software umožňuje další analýzu dat, jako je stanovení molekulové hmotnosti, pokud byl použit vhodný standard.
Radioaktivní značky nevyžadují enzymové substráty, ale umožňují umístění lékařského radiografického filmu před Western blot, což mu (filmu) umožňuje interagovat se značkami a vytvářet tmavé oblasti, které odpovídají pásům studovaného proteinu (v obrázek vpravo). Poptávka po metodách radioaktivní detekce klesá kvůli jejich vysoké ceně, vysokým zdravotním a bezpečnostním rizikům a alternativám poskytovaným společností ECL.
Fluorescenční štítky jsou excitovány světlem a emitují světlo o delší vlnové délce, které je detekováno fotosenzory, jako je CCD kamera vybavená vhodnými emisními filtry. Kamera pořídí digitální snímek western blotu, což umožňuje další analýzu získaných dat, jako je analýza molekulové hmotnosti a kvantitativní analýza western blot.