Neuraminidáza ( EC 3.2.1.18 ) je enzym patřící mezi glykosyl hydrolázy . Název nomenklatury je exo-α-sialidáza. Také běžně používané názvy: α-neuraminidáza, N-acylneuraminidát glykohydroláza, sialidáza. Katalyzované reakce: hydrolýza α-2→3-, α-2→6-, α-2→8-ketosidových vazeb koncových zbytků kyseliny sialové v oligosacharidech , glykoproteinech , glykolipidech a syntetických sloučeninách.
|
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Neuraminidáza je v přírodě široce rozšířena, je součástí schránek některých virů . Nachází se v řadě patogenních mikroorganismů (poprvé byl objeven v kultuře patogenů plynové gangrény Clostridium perfringens ), stejně jako u obratlovců a bezobratlých . Neuraminidáza nebyla v rostlinách nalezena.
Enzym je přísně specifický s ohledem na konfiguraci ketosidické vazby a relativně specifický s ohledem na polohu této vazby v molekule. Vibrio cholerae a neuraminidáza plynové gangrény, běžně používané v laboratorní praxi, mohou štěpit α-2→3- a α-2→6-ketosidické vazby. Virové neuraminidázy mají tendenci mít přísnější specificitu pro polohu a-ketosidické vazby. Enzym nevyžaduje kofaktory , ale část neuraminidázy je aktivována ionty Ca2+ .
K dnešnímu dni jsou enzymy s aktivitou sialidázy součástí 3 rodin glykosylhydroláz : GH33, GH34, GH83. [1] Všechny tři rodiny se vyznačují konstrukcí 6listé β-vrtule. Rodina GH33 zahrnuje enzymy nacházející se v bakteriích, různých eukaryotech a virech. Vyznačují se také přítomností transsialidázové aktivity EC 2.4.1.- . [2] Molekuly virového původu patří do rodiny GH34. [3] Rodina GH83 zahrnuje virovou hemaglutinin-neuraminidázu. [čtyři]
Je to jeden ze dvou hlavních povrchových antigenů viru chřipky . Označení typu neuraminidázy se používá v označení podtypu viru: například H5 N1 (písmeno H pro " hemaglutinin ").
Existenci enzymatické aktivity na povrchu virionu chřipkového viru objevil americký virolog George Keble Hirst (3/02/1909-01/22/1994 ) v roce 1942 . Inkuboval erytrocyty s virem, pozoroval hemaglutinační reakci a poznamenal, že aglutinace nebyla stabilní [5] .
Jak je dnes známo, jeden z povrchových glykoproteinů virionu chřipky, hemaglutinin , se váže na polysacharidové řetězce na povrchu erytrocytů obsahujících zbytky kyseliny sialové. Další povrchový glykoprotein, neuraminidáza , specificky odštěpuje zbytek kyseliny sialové (N-acetylneuraminové) z polysacharidů membrány erytrocytů, čímž ničí virové receptory na hostitelských buňkách. Neuraminidáza přerušuje a-keto vazbu mezi terminální N-acetylneuraminovou kyselinou a sousedním sacharidovým zbytkem, obvykle galaktózou . Virový enzym vykazuje určitou „preferenci“ pro vazby α-2→3 [6] .
Úloha enzymu, který ničí receptory pro virus, není zcela jasná. Předpokládá se, že aktivita neuraminidázy pomáhá virovým částicím pronikat slizničními sekrety bohatými na kyselinu sialovou, aby dosáhly cílových buněk epitelu dýchacího traktu [7] . Experimentálně byla potvrzena i úloha enzymu při usnadnění uvolňování nově vzniklých virových částic z povrchu infikovaných buněk, kde mohou agregovat v důsledku interakce virového hemaglutininu s kyselinou sialovou na buněčné membráně [8] .
Stejně jako hemaglutinin je neuraminidáza velmi důležitým povrchovým antigenem viru. Pro virus chřipky typu A byly nalezeny dvě antigenní varianty. Změny v aminokyselinové sekvenci antigenů pokračují v důsledku tlaku na selekci protilátek z imunizované populace . V důsledku genetické rekombinace se objevují viry s antigenní sekvencí, která se významně (až 50 %) liší od sekvence cirkulujících kmenů . K takovým změnám podtypu hemaglutininu i neuraminidázy došlo u lidské chřipky v roce 1957 (kdy se virus H1N1 přeměnil na H2N2), 1968 (H2N2 na H3N2) a 1977 (H3N2 na H1N1, ačkoli virus H3N2 nadále cirkuloval) [9••] . Tyto mutace jsou zodpovědné za nejnovější pandemie . Rozdíly mezi podtypy jsou identifikovány negativní sérovou zkříženou reaktivitou s každým z nich. Virus chřipky typu B takovou změnu antigenní specifity nevykazuje, i když ke změnám ve struktuře antigenů také dochází.
Protilátky proti neuraminidáze snižují závažnost onemocnění [10] , ale neléčí infekci , což je v souladu s úlohou neuraminidázy v životním cyklu viru.
Neuraminidáza je tetramer ukotvený k virové membráně jedinou hydrofobní sekvencí o 29 aminokyselinách umístěnou blízko N-konce proteinu. Ze zničené virové membrány se uvolňuje protein o molekulové hmotnosti 200 kDa obsahující 4 identické glykosylované podjednotky, který má všechny antigenní a enzymatické vlastnosti membránově vázané neuraminidázy [11] . Tento protein byl krystalizován a jeho struktura byla studována pomocí UV difrakce .
Schematicky lze strukturu neuraminidázy znázornit jako 6 4-vláknových antiparalelních β-vrstev uspořádaných jako listy vrtule. [12] Centrální (první) řetězec každé vrstvy je rovnoběžný s osou vrtule, zatímco zbytek je umístěn téměř kolmo k ní. Vnější řetězec první vrstvy je spojen s centrálním řetězcem vrstvy, která za ním následuje. Tato sloučenina se nachází na povrchu molekuly enzymu a nese mnoho antigenně a enzymaticky důležitých aminokyselin. [13] [14] [15]
Čtyři stejné podjednotky jsou uspořádány radiálně. Aktivní místo enzymu se nachází ve středu každé z podjednotek. Je to hluboká kapsa obklopená stěnami, jejíž sekvence aminokyselin je pro všechny známé kmeny viru neměnná. Tyto aminokyseliny aktivního centra lze rozdělit do 2 typů: některé jsou zapojeny do přímého kontaktu se substrátem, zatímco jiné plní pouze funkci udržování struktury. [16]
Pomocí krystalografie byla stanovena přítomnost oligosacharidových řetězců připojených k proteinu a majících formu antén. [9]
Hledání inhibitorů chřipkové neuraminidázy začalo v roce 1966 [17] . Důvodem byl předpoklad, že takové látky budou vykazovat antivirovou aktivitu.
První inhibitor, dien kyseliny α-sialové (Neu5Ac2en), byl syntetizován v roce 1969 [18] . V 70. letech 20. století byla syntetizována řada analogů látky Neu5Ac2en, nejúčinnějším inhibitorem byl trifluoracetylový derivát Neu5Ac2en. Tato látka byla použita ke studiu role neuraminidázy v životním cyklu viru, ale její antivirová aktivita nebyla zjištěna. [19]
Inhibitorem neuraminidázy je známý antivirový lék Oseltamivir .
| Hydrolázy ( EC 3): glykosyl hydrolázy ( EC 3.2.1) | |
|---|---|
| |