Optické pinzety ( angl.optic tweezers ), někdy "laserové pinzety" nebo "optická past " - optický nástroj, který umožňuje manipulovat s mikroskopickými předměty pomocí laserového světla (obvykle emitovaného laserovou diodou ). Umožňujesil od femtonewtonů po nanonewtony na dielektrické objekty a lze měřit vzdálenosti od několika nanometrů do mikronů . V posledních letech se v biofyzice ke studiu struktury a fungování proteinů začaly používat optické pinzety [1] .
V roce 2018 byla Nobelova cena za fyziku udělena „za vynález optických pinzet a jejich aplikace v biologických systémech“ Arthuru Ashkinovi , tvůrci optických pinzet [2] .
Již v 17. století německý astronom Johannes Kepler na základě pozorování ohonů komet , když se přibližovaly ke Slunci , navrhl, že světlo může vyvíjet tlak na hmotu. I když se později ukázalo, že to nebyl jediný mechanismus této odchylky, Keplerova myšlenka se ukázala jako plodná pro rozvoj astronomie. Například se ukázalo, že světlo ( tlak záření ) je jedním z nejdůležitějších mechanismů, které jsou zodpovědné za dynamiku částic v mezihvězdném prostoru.
Dvě století po Keplerově zkoumání vypočítal James Maxwell hodnotu tlaku světla pomocí své teorie elektromagnetických jevů . Tento efekt byl experimentálně změřen v roce 1910 ruským fyzikem Pjotrem Lebeděvem , který prokázal, že světlo vyvíjí tlak na těla.
V roce 1970 byl ve vědecké literatuře publikován Arthur Ashkin z Bell Labs [3 ] popis sil spojených s rozptylem a gradienty intenzity světla na částicích o velikosti mikronů .
Mnohem později Ashkin a kolegové oznámili první pozorování toho, čemu se dnes říká optická past, tedy soustředěný paprsek světla schopný udržet mikroskopické částice (10 nm - 10 µm ) nehybné ve třech rozměrech [4] .
Na podobném principu se používá i chlazení laserem , metoda, která umožnila dostat teplotu atomů v optické pasti na nejnižší hodnoty, které jsou jinými prostředky nedostupné. Metoda byla navržena sovětským fyzikem Letochovem v roce 1968 [5] a implementována stejnou Ashkinovou skupinou v roce 1978 [6] . Ve výzkumné práci pokračoval Steven Chu ( dříve Ashkinův spolupracovník), který za tuto práci obdržel v roce 1997 Nobelovu cenu .
V 80. letech 20. století byli Steven Block a Howard Berg průkopníky technologie optické pinzety v biologii , která ji používala k zachycení bakterií za účelem studia bakteriálních bičíků . Již v 90. letech 20. století výzkumníci jako Carlos Bustamante , James Spudich a Stephen Block aplikovali princip spektroskopie optické síly k charakterizaci biologických motorů v molekulárním měřítku . Tyto molekulární motory jsou v biologii všudypřítomné a jsou zodpovědné za pohyb buněk , změnu tvaru a transport uvnitř buňky . Optické pasti to umožnily [ upřesnit ] biofyziků , aby sledovali síly a dynamiku molekulárních motorů na příkladu jediné molekuly. Spektroskopie optické síly poskytla lepší pochopení stochastické (náhodné) povahy těchto molekul přeměňujících energii.[ upřesnit ]
Optické pinzety se osvědčily i v jiných oblastech biologie . Například v roce 2003 byla pro třídění buněk použita metoda optického zadržení . Vytvořením vysoké optické intenzity nad vzorkem lze buňky třídit podle jejich vlastních optických charakteristik [7] [8] . Optická pinzeta se také používá ke studiu proteinů, které tvoří cytoskelet [9] , měření viskozity a elasticity biopolymerů a ke studiu pohybu buněk.
Objekty reprezentované jako malé dielektrické koule interagují s elektrickým polem vytvořeným světelnou vlnou v důsledku dipólového momentu indukovaného na kouli . V důsledku interakce tohoto dipólu s elektrickým polem elektromagnetické vlny se objekt pohybuje po gradientu elektrického pole . Kromě gradientní síly působí na objekt také síla způsobená tlakem ( odrazem ) světla od jeho povrchu. Tato síla tlačí kouli ve směru světelného paprsku. Pokud je však světelný paprsek vysoce zaostřený, může být velikost gradientu intenzity větší než velikost tlaku světla [10] .
Podrobnější analýza je založena na dvou mechanismech navržených Ashkinem v závislosti na velikosti částic. Z teorie rozptylu světla je známo , že mechanismus rozptylu světla částicí závisí na poměru velikosti částice a vlnové délky světla. Pokud je velikost rozptylujících částic mnohem menší než vlnová délka světla, pak dochází k Rayleighově rozptylu . Když je světlo rozptylováno částicemi (prach, kouř, kapky vody), které jsou větší než vlnová délka, jedná se o Mieův rozptyl (podle německého fyzika Gustava Mieho ). Mie rozptyl je zodpovědný za bílou a šedou barvu mraků .
Na základě stejné myšlenky Ashkin navrhl, že k matematické analýze optické mikromanipulace lze použít dvě různé metody, a to fyzikální optický přístup pro částice Mie (když je průměr částice větší než vlnová délka světla d > λ) a aproximaci elektrického dipólu pro Rayleighovy částice ( d <λ).
Při analýze pomocí fyzikální optiky stačí k analýze zatažení do optické pasti zohlednění procesů lomu a odrazu světla od mikrosféry (viz obrázek vpravo).
Nejjednodušší výpočet působících sil v rámci přístupu fyzikální optiky je založen na geometrické optice . Zkoumání paprsku ukazuje na změnu hybnosti světla při odrazu a lomu. Takže tato změna hybnosti ( fotonu jako částice) podle druhého Newtonova zákona způsobí vznik síly.
Pomocí jednoduchého vektorového diagramu paprsků a sil lze ukázat, že na mikrosféru působí dvě různé optické síly v důsledku setrvačnosti dopadajícího a lomeného světla. Jak je patrné z diagramu, výsledná síla tlačí kouli ve směru oblasti nejvyšší intenzity paprsku. Taková síla se nazývá gradientní síla .
Ashkin ve svém prvním experimentu [3] použil miliwattový Gaussův paprsek jednovidového (TEM 00 ) argonového laseru o vlnové délce 514,5 nm, zaostřený do bodu o průměru w 0 = 6,2 μm. Pomocí tohoto paprsku pohyboval latexovými koulemi o průměru 0,51; 1,31 a 2,68 µm ve vodě a vzduchu. U koulí o poloměru r = 1,31 μm umístěných ve vodě a výkonu laseru P = 19 mW dosáhla rychlost koulí 26 μm/s. A z odhadu podle vzorce
kde q je podíl světla účinně odraženého od koule (0,062), c je rychlost světla, η je dynamická viskozita kapaliny (1 mPa s pro vodu), ukázalo se, že je 29 μm / s. A odpovídající síla působící na částici se získá ze Stokesova zákona
a je 730 fN.
Ve vzduchu byla maximální rychlost pro vodní kapky o průměru 5 μm při výkonu laseru 50 mW 0,25 cm/s [3] .
Aby byl zkoumaný objekt nehybný, je nutné kompenzovat sílu způsobenou tlakem světla. Toho lze dosáhnout dvěma kolidujícími paprsky světla, které tlačí kouli v opačných směrech, nebo vysoce zaostřeným Gaussovým paprskem (s vysokou numerickou aperturou , NA > 1,0) pro kompenzaci tlaku světla s vysokou gradientní silou .
Na druhou stranu v Rayleighově režimu nejsou částice tvarově omezeny. Obecně platí, že nejmenší částice potřebují nejmenší přitažlivou sílu. Ve většině případů se model redukovaného dipólu používá k vysvětlení pracovního mechanismu laserové pinzety pro jakýkoli tvar částic. Elektromagnetické záření vyvolá v dielektrické částici dipólový moment neboli polarizaci . Síla interakce tohoto dipólu se světlem vede k gradientní síle přitažlivosti.
Podrobné informace o zařízení optické pasti laboratoře Stephena Blocka jsou k dispozici na webu Stanfordské univerzity [11] .
V případech, kdy je průměr zachycené částice mnohem menší než vlnová délka světla, podmínky splňují podmínku Rayleighova rozptylu a částici lze považovat za bodový dipól v nehomogenním elektromagnetickém poli . Síla působící na nabitou částici v elektromagnetickém poli je známá jako Lorentzova síla :
Síla působící na dipól se vypočítá jako součet sil působících na jednotlivé náboje :
Vzhledem k malé vzdálenosti mezi náboji v dipólu je možné rozšířit elektrické pole v blízkosti prvního náboje:
Všimněte si, že se zmenšuje. Roztažením závorek a nahrazením součinu náboje a vzdálenosti polarizací dipólu získáme
kde druhá rovnice předpokládá, že polarizace částice je lineární funkcí elektrického pole (tj . ).
Pokud nyní použijeme rovnici z vektorové analýzy
a jedna z Maxwellových rovnic ,
pak dostaneme
Druhý člen v poslední rovnosti je časovou derivací hodnoty, která je prostřednictvím konstantního faktoru vztažena k Poyntingově vektoru , který popisuje sílu záření procházející jednotkovou plochou. Za předpokladu, že výkon laseru nezávisí na čase, je derivace tohoto členu nulová a síla je zapsána jako [12]
Druhá mocnina velikosti elektrického pole je rovna intenzitě paprsku jako funkce souřadnic. Výsledek tedy ukazuje, že síla působící na dielektrickou částici v bodové dipólové aproximaci je úměrná gradientu intenzity paprsku. Jinými slovy, zde popsaná síla vede k přitahování částice k oblasti s nejvyšší intenzitou. Ve skutečnosti síla vznikající rozptylem světla závisí lineárně na intenzitě paprsku, průřezu částice a indexu lomu prostředí, ve kterém je lapač umístěn (například voda), působí proti gradientní síle v axiálním směru pasti, což vede k tomu, že rovnovážná poloha je posunuta mírně dolů z polohy maximální intenzity.
Od vynálezu prvních laserových pinzet založených na jediném Gaussově paprsku (základní laserový režim TEM 00 ) A. Ashkinem v roce 1986 [13] se koncept jednovidových laserových paprsků vyvíjel pomocí použití laserových režimů vysokého řádu. , tedy Hermitovy-Gaussovy svazky (TEM nm ), Laguerre-Gaussovy svazky (LG, TEM pl ) a Besselovy svazky ( J n ).
Laguerre-Gaussovy paprsky mají jedinečnou vlastnost vtahovat opticky odrážející a pohlcující částice do optické pasti. Kruhově polarizované paprsky mají rotační orbitální moment a mohou rotovat částice. Laguerre-Gaussovy paprsky mají také svůj vlastní moment hybnosti , který může otáčet částice kolem středu paprsku [14] [15] . Tento efekt je pozorován bez externí mechanické nebo elektrické regulace paprsku.
Kromě Laguerre-Gaussových svazků mají Besselovy svazky nultého i vyššího řádu orbitální hybnost a také jedinečnou vlastnost, že současně drží mnoho částic v určité vzdálenosti [16] .
Typické nastavení má pouze jeden nebo dva laserové paprsky. Složitější experimenty vyžadují mnoho pastí spuštěných současně. Toho lze dosáhnout pomocí jediného laseru, jehož světlo prochází akusticko-optickým modulátorem nebo elektronicky řízenými zrcadly. Pomocí těchto zařízení lze laserové záření rozdělit v čase do více paprsků a pomocí difrakčních optických prvků jej v prostoru rozdělit na více paprsků [17] [18] [19] [20] .
U tohoto typu zařízení je laserové záření přiváděno přes optické vlákno . Pokud jeden konec optického vlákna tvoří povrch podobný vlastnostem čočce, umožní to zaostření světla v optické pasti s velkou numerickou aperturou [21] .
Pokud konce vláken nejsou konvexní, laserové světlo bude vychýleno, a proto lze vytvořit stabilní optickou past pouze se dvěma konci vláken na každé straně optické pasti a vyvažováním gradientních sil a světelných tlaků. Gradientové síly drží částice v příčném směru, zatímco axiální optická síla vzniká tlakem dvou protilehlých paprsků světla, které vycházejí a šíří se ze dvou optických vláken. Rovnovážná poloha koule podél osy z v takové pasti je poloha, kde jsou světelné tlaky navzájem stejné. Takové laserové pinzety jako první vytvořili A. Constable [22] a J. Gyuk [23] , kteří touto technikou natahovali mikročástice. Manipulací s příkonem z obou konců vlákna je možné ovládat tahovou sílu. Takový systém lze použít k měření viskozity a elasticity buněk s dostatečnou citlivostí k rozlišení mezi různými cytoskelety , jako jsou lidské erytrocyty a myší fibroblasty . Nedávné studie dosáhly velkého úspěchu v odlišení rakovinných buněk od normálních [24] .
Jeden z nejběžnějších systémů třídění buněk využívá metodu fluorescenční průtokové cytometrie . Při této metodě se suspenze biologických buněk třídí do několika nádob podle fluorescenčních charakteristik každé buňky v proudu. Proces třídění je řízen elektrostatickým vychylovacím systémem, který vede článek ke specifické nádobě změnou napětí aplikovaného elektrického pole.
V opticky řízeném třídicím systému buňky procházejí dvou- nebo trojrozměrnými optickými mřížkami. Bez indukovaného elektrického napětí jsou články tříděny podle vlastností lomu světla. Skupina výzkumníků vedená Kishanem Dolakia vyvinula techniku pro použití difrakční optiky a dalších optických prvků k vytvoření takových optických mřížek [25] . Na druhé straně skupina vědců z University of Toronto vybudovala automatický systém třídění využívající modulátor prostorového světla [26] .
Hlavním třídícím mechanismem je umístění uzlů optické mřížky. Když tok buněk prochází optickými mřížkami, třecí síly částic přímo soutěží s optickou gradientní silou ze sousedního uzlu optické mřížky. Změnou umístění uzlů je možné vytvořit optickou dráhu, po které se budou buňky pohybovat. Ale taková cesta bude účinná pouze pro buňky s určitým indexem lomu, které budou účinně vychylovány. Úpravou průtokové rychlosti buněk a světelného výkonu je možné dosáhnout dobrého optického třídění buněk.
Konkurenci sil v systému třídění je třeba doladit, aby bylo dosaženo vysoké optické účinnosti třídění. V současné době byla na St. Andrews University vytvořena velká výzkumná skupina, která se tímto problémem zabývá. V případě úspěchu by tato technologie mohla nahradit tradiční fluorescenční třídění buněk [27] .
Tlumené pole je elektromagnetické pole , které proniká hluboko do látky, například s úplným vnitřním odrazem [28] [29] . Elektrické pole ve světelné vlně exponenciálně klesá . Evanescentní pole našlo řadu uplatnění v optické mikroskopii nanometrových objektů, další z jeho aplikací se stává optická mikromanipulace (laserové pinzety).
V laserových pinzetách lze při šíření světla optickým vlnovodem vytvořit souvislé evanescentní pole (vícenásobný celkový vnitřní odraz). Výsledné evanescentní pole má směrovanou hybnost a může pohybovat mikročásticemi ve směru svého šíření. Tento efekt objevili vědci S. Kawata a T. Sugiura v roce 1992 [30] [31] . Ukázali, že pole může vázat částice, které byly od sebe vzdálené asi 100 nm . Tato přímá vazba pole je považována za tunelování fotonů mezerou mezi hranolem a mikročásticemi. Výsledkem je směrová optická mohutnost.
Nedávná verze laserových pinzet s evanescentním polem využívá velkou plochu optické mřížky, která umožňuje, aby bylo mnoho částic vázáno současně a nasměrováno požadovaným směrem bez použití vlnovodu. Tato technika se nazývá „lensless optický trapping“ ( anglicky lenslessoptic trapping , LOT) [32] . Přesně směrovanému pohybu částic napomáhá Ronchiho pravidlo nebo vytvoření čistých jamek optického potenciálu ve skleněné desce. V současné době vědci také pracují na zaměření evanescentních polí.
Další možnost manipulace s mikročásticemi světlem vyvinul Ming Wu , profesor na katedře radiotechniky a informatiky na Kalifornské univerzitě . Jeho systém nepoužívá světelný impuls přímo. Naproti tomu v systému, který postavil, se částice, se kterými se má manipulovat, nacházejí poblíž skleněné desky potažené fotovodivou látkou. Na tuto desku je přivedeno malé napětí, aby se na částicích vytvořil elektrostatický náboj. Fotovodivá deska je osvětlena LED diodami, jejichž výkon lze modulovat tak, aby promítal na povrch jakýkoli dynamický obraz. Působením světla se fotovodivý povrch nabije a začne přitahovat nebo odpuzovat částice. Manipulační proces se provádí změnou elektrického pole a umožňuje jej promítaný obraz [33] .
Jednou z aplikací této metody je třídění živých a mrtvých buněk. Třídění je založeno na skutečnosti, že živé články jsou naplněny elektrolytem , zatímco mrtvé články nikoliv a lze je snadno oddělit. Tento systém umožňuje současně manipulovat s 10 000 buňkami nebo částicemi [34] .
Když je množství mikročástic podporováno monochromatickým laserovým paprskem, umístění mikročástic v optické pasti závisí na redistribuci optických sil mezi částicemi. Dá se říci, že shluk mikročástic se váže k sobě se světlem. První experimenty s optickou vazbou byly provedeny v laboratoři Evgeniy Golovchenko na Harvardské univerzitě [35] .
V současnosti lze přitažlivou sílu měřit jak jednopaprskovou, tak dvoupaprskovou laserovou pinzetou ( fotonový silový mikroskop ) [36] [37] . V poslední době se začalo pracovat na měření optických mohutností v holografických laserových pinzetách s cílem dosáhnout vysoké přesnosti polohování pastí pro jednotlivé atomy [38] [39] [40] .
Základním principem měření optické síly laserových pinzet je přenos světelného pulzu spojeného s lomem světla na částicích. Změna směru šíření světla jak v příčném, tak v podélném směru poskytuje sílu, která působí na předmět. Nejmenší příčnou sílu lze tedy změřit vychýlením paprsku, který prošel částicí. Takovou odchylku lze snadno změřit pomocí detektoru axiální polohy, z nichž nejjednodušší je kvadrantová fotodioda : deska rozdělená do čtyř sektorů s paprskem světla zaostřeným ve svém středu. S částicí ve středu dopadá na sektory světlo stejné síly, ale pokud na částici působí síla, mocniny již nebudou stejné a jejich rozdíl je úměrný této síle.
Tento princip lze aplikovat s jakoukoliv laserovou pinzetou. Největší problém s takovým měřením bude Brownův pohyb (šum). Obvykle však lze měřit síly v řádu pikonewtonů a posuny v řádu nanometrů [41] .