Bioortogonální reakce jsou chemické reakce , které se mohou vyskytovat v živých systémech, aniž by zasahovaly do přirozených biochemických procesů [1] [2] [3] . Funkční skupiny zapojené do bioortogonálních reakcí se zpravidla v biomolekulách nenacházejí, reagují mezi sebou rychle a selektivně v podmínkách živých buněk a jsou inertní vůči ostatním sloučeninám, které jsou přítomny v těle. Termín navrhla Caroline Bertozzi v roce 2003 [4] . Název reakcí vychází z přeneseného významu slova „ ortogonální “, tedy na čemkoli nezávislý , a označuje vzájemnou nezávislost toku umělých a přírodních procesů.
Navzdory skutečnosti, že v oblasti organické chemie bylo objeveno, studováno a popsáno velké množství chemických reakcí, prakticky žádná z nich nemůže být provedena v buňce nebo organismu tak, aby ovlivnila pouze sloučeninu, která je pro výzkumníka zajímavá ( protein , DNA , metabolit atd.). To se děje proto, že biomolekuly obsahují velké množství funkčních skupin velmi podobných reaktivitou (hlavně nukleofilních ) a reakce, do které studovaná sloučenina vstoupí, nevyhnutelně ovlivní další molekuly obsahující podobné funkční skupiny, které nejenže nemusí splňovat cíle studium, ale také narušují přirozenou práci buňky a znemožňují její studium [5] . Provádění chemických reakcí uvnitř buňky je zároveň užitečným výzkumným nástrojem, protože umožňuje označit studované biomolekuly fluorescenčními , afinitními a hmotnostně spektrometrickými značkami, což později umožní tyto biomolekuly pozorovat vhodnými výzkumnými metodami, například pomocí fluorescenčního mikroskopu . Bioortogonální reakce jsou navrženy tak, aby zaplnily tuto mezeru, protože jsou buňce absolutně cizí, vyskytují se mezi uměle zavedenými funkčními skupinami a mají malý vliv na fungování buňky [3] .
Využití bioortogonální reakce v praxi se obvykle provádí ve dvou stupních. Nejprve je studovaná sloučenina modifikována bioortogonální funkční skupinou v buňce. Poté je do systému zavedena nízkomolekulární značka obsahující komplementární funkční skupinu a v důsledku bioortogonální reakce dochází k selektivní modifikaci (značení) této sloučeniny [3] [5] . Následně zavedený štítek umožňuje sledovat upravený substrát.
Bioortogonální reakce nyní umožnily studovat různé biomolekuly , jako jsou glykany , proteiny [6] a lipidy [7] , v reálném čase v živých systémech bez cytotoxicity . Bylo vyvinuto několik chemických reakcí, které splňují požadavky bioortogonality, mezi nimi 1,3-dipolární cykloadice azidů na cyklooktyny (také nazývaná klikací reakce bez mědi ) [8] , nitrony na cyklooktyny [9 ] , tvorba oximů nebo hydrazonů z karbonylových sloučenin [10] , reakce tetrazinů s cyklookteny [11] , click reakce isonitrilů a ligace kvadricyklanů [ 13] .
První pozorování selektivní kovalentní modifikace pomocí chemické reakce v buněčných podmínkách se objevilo v práci R. Qiana et al., kteří fluoresceinem se dvěma funkčními skupinami arsinu selektivně modifikovali protein, do kterého se vkládá fragment tetracysteinu , který je prakticky chybí v savčích proteinech , byl zaveden dříve [14] . Tento přístup umožnil zavést do proteinu malou fluorescenční značku, zatímco standardní metodou té doby bylo získání hybridů se zeleným fluorescenčním proteinem nebo jeho analogy [15] , které jsou mnohem větší a v důsledku toho někdy interferují s normální fungování studovaného proteinu.
Tento přístup přiměl chemiky, aby hledali chemické reakce a funkční skupiny, které jsou absolutně cizí přírodním sloučeninám, a biology, aby vynalezli způsoby, jak zavést bioortogonální funkce do biomolekul. Prvním krokem bylo zjištění, že biomolekuly obsahují především nukleofilní skupiny, zatímco elektrofilní skupiny se v nich vyskytují mnohem méně. Například ketony a aldehydy se nevyskytují v proteinech, zároveň však vykazují reaktivitu vůči hydrazidovým a hydroxyaminovým skupinám, které se také nevyskytují v biomolekulách. Díky tomu byla koncem 90. let v buňce možná modifikace glykanů a proteinů prostřednictvím metabolicky zavedených cukrů a aminokyselin obsahujících ketony. Ketony a aldehydy však byly přítomny v metabolitech s nízkou molekulovou hmotností (cukry, pyruvát , pyridoxalfosfát atd.), to znamená, že nebyly zcela bioortogonální [16] .
Následně chemici hledali bioortogonální reakce probíhající mezi zcela nepřirozenými funkčními skupinami. Staudingerova reakce byla první chemickou reakcí přizpůsobenou k provádění modifikací uvnitř buňky. Azidová skupina vstupující do této reakce patří mezi měkké elektrofily, které nejsou schopny reagovat s tvrdými nukleofily nejběžnějšími v přírodě. Partnerem pro azid byl fosfin, měkký nukleofil navržený G. Staudingerem v roce 1919 [17] . V roce 2000 byla Staudingerova reakce modifikována C. Bertozzim a použita jako bioortogonální Staudingerova ligace pro značení široké škály biomolekul jak v živých buňkách, tak v celých organismech [18] .
Ve stejné době se začala vyvíjet click chemie - chemický koncept, který popisuje přípravu knihoven organických sloučenin pomocí rychlých a spolehlivých reakcí umožňujících sestavení molekul z malých stavebních bloků [19] . Mezi několika reakcemi, které splňují tento koncept, nalezla mědí katalyzovaná azid-alkinová cykloadice nejširší uplatnění pro in vitro modifikaci biomolekul [20] . Kvůli toxicitě měděného katalyzátoru by však taková reakce nemohla být použita v živých buňkách nebo organismech. Skupina C. Bertozziho vytvořila nekatalytickou variantu této reakce, známou jako stresem usnadněná azid-alkynová cykloadice (SPAAC), což je slibná bioortogonální reakce [8] .
V současné době pokračuje hledání nových bioortogonálních reakcí, aby bylo možné provádět paralelní modifikace substrátů ve stejném biologickém systému.
V ideálním případě by bioortogonální reakce měla splňovat následující konkrétní podmínky [3] [4] :
Tuto reakci vyvinula skupina C. Bertozziho v roce 2000 na základě klasické Staudingerovy reakce mezi azidy a triarylfosfiny [18] . Tato reakce se stala předchůdcem oblasti bioortogonální chemie, protože v ní reagující skupiny (azidy, fosfiny) nejsou přítomny v biomolekulách, ale nyní není tak široce používána. Staudingerova ligace byla použita k modifikaci biomolekul jak v živých buňkách, tak v myších [4] .
Při Staudingerově reakci se azidová skupina chová jako měkký elektrofil , který reaguje s měkkými nukleofily , jako jsou fosfiny . Většina biologických nukleofilů jsou naopak rigidní nukleofily, které nereagují s azidy. Staudingerova ligace navíc probíhá ve vodném prostředí za vzniku stabilního produktu [18] .
Fosfiny v přírodních biomolekulách chybí [21] a neobnovují disulfidové vazby .
Na příkladu léků ( azidothymidin ) se ukázalo, že azidy jsou biokompatibilní . Malá velikost azidové skupiny usnadňuje její zavedení do biomolekul prostřednictvím metabolických cest [8] .
Základem Staudingerovy reakce je nukleofilní útok fosfinu na koncový atom dusíku azidové skupiny za vzniku fosfazidu 1 . Poté je fosfazid 1 přeměněn na iminofosforan 3 , doprovázený uvolňováním dusíku, načež dochází k hydrolýze iminofosforanu za vzniku aminu a fosfinoxidu. Pro aplikace v oblasti biokonjugace byla reakce modifikována zavedením esterové skupiny do ortho polohy jednoho z arylových substituentů fosfinu. V důsledku ataku výsledného iminofosforanu 3 na tuto skupinu se vytvoří bicyklický produkt 4 , jehož hydrolýza vede k vytvoření stabilní amidové vazby mezi substrátem a zavedenou značkou. Krokem omezujícím rychlost reakce je napadení azidové skupiny molekulou fosfinu [22] .
Hlavní nevýhodou této reakce je, že fosfiny jsou v živých systémech pomalu oxidovány kyslíkem. Kromě toho jsou pravděpodobně metabolizovány cytochromy P450 [4] . Ligace podle Staudingera probíhá poměrně pomalu, podle kinetiky druhého řádu, s rychlostní konstantou asi 0,0020 M −1 s −1 [4] . Pokusy urychlit nukleofilní útok zavedením elektron-donorních skupin do arylových substituentů urychlují reakci, ale také se zvyšuje rychlost oxidace fosfinu.
Pomalá reakční rychlost vyžaduje zvýšení koncentrace použitého fosfinu, což zvyšuje signál pozadí produkovaný přebytkem značky. Bylo vyvinuto úsilí k překonání tohoto problému: byly syntetizovány fluorogenní fosfiny na bázi fluoresceinu [23] a kumarinu [24] , jejichž působení je založeno na nárůstu fluorescence až po zabudování do biomolekuly, což umožnilo získat větší skok v intenzitě záření v důsledku reakce. V současnosti zůstává kinetika reakce vážnou překážkou jejího širokého použití.
Azid-alkynová cykloadice bez mědi je bioortogonální reakce vyvinutá C. Bertozzim jako aktivovaná verze Huisgenovy reakce . Na rozdíl od mědí katalyzované azid-alkynové cykloadice ( CuAAC , Cu-katalyzovaná azid-alkynová cykloadice) probíhá tato varianta reakce vyšší rychlostí díky odstranění úhlového napětí v molekule cyklooktynu během tvorby adičního produktu. Proto se tato reakce stala známou jako kmenem podporovaná azid-alkynová cykloadice ( SPAC ). Tato úprava umožňuje vyhnout se použití toxického měděného katalyzátoru a využít reakci bez mědi v živých buňkách a organismech.
Klasická mědí katalyzovaná azid-alkynová cykloadice je velmi rychlá a účinná biokonjugační reakce , nelze ji však použít v živých buňkách kvůli toxicitě iontů Cu + . Toxicita se přisuzuje tvorbě reaktivních forem kyslíku generovaných měděnými katalyzátory.
Ligandy byly optimalizovány , aby zabránily škodlivým účinkům na biomolekuly, nicméně se ukázalo, že různá prostředí ligandů v komplexech také ovlivňují metabolismus, protože zavádějí nežádoucí změny v buněčných procesech [25] .
Azidová skupina je bioortogonální, protože je poměrně malá (má malý vliv na penetraci molekuly do buňky), metabolicky stabilní a nevyskytuje se v nativních biomolekulách. Ačkoli azidy nejsou nejreaktivnějšími sloučeninami v 1,3-dipolární adici, jsou preferovány kvůli absenci vedlejších reakcí za podmínek modifikace [26] . Cyklooktynový fragment je větší, ale má ortogonalitu a stabilitu požadovanou pro in vivo modifikaci . Cyklooktiny jsou nejmenší stabilní cyklické alkyny . Vypočtené úhlové napětí v jejich cyklech je 19,9 kcal/mol [27] .
Reakce probíhá jako standardní 1,3-dipolární cykloadice s přizpůsobeným pericyklickým elektronovým posunem. Ambivalentní povaha 1,3-dipolu znemožňuje určení elektrofilního a nukleofilního centra v azidu, takže obraz směru elektronového přechodu postrádá smysl. Výpočty však ukazují, že největší záporný náboj nese vnitřní atom dusíku [28] .
Bezměděná azid-alkynová cykloadice byla upravena tak, aby místo azidů používala nitrony . V tomto případě se jako reakční produkty tvoří N -substituované isoxazoliny . Reakční rychlost se ve vodném prostředí zvyšuje a řídí se kinetikou druhého řádu s konstantou od 12 do 32 M – 1 s – 1 v závislosti na substituentech v nitronu . Přes vysokou rychlost reakce je její nevýhodou obtížné zavádění nitronu do biomolekuly metabolickým značením. Reakce byla použita pro modelovou modifikaci peptidu a pegylaci proteinu [9] .
V roce 2009 byla vyvinuta dipolární cykloadiční reakce oxidů nitrilu na norbornen . Zejména byl aplikován na postsyntetické modifikace oligonukleotidů . Norbornen byl vybrán jako dipolarofil kvůli rovnováze mezi stresem podporovanou reaktivitou a stabilitou. Nevýhodou této reakce je vysoká elektrofilita nitriloxidu, která vede k vedlejším reakcím, a také nízká reakční rychlost [29] .
Probíhá cykloadiční reakce oxanorbornadienu s azidy s následnou eliminací furanu retro-Diels-Alderovou reakcí. Kruhové napětí a elektronová deplece oxanorbornadienu zvyšují jeho reaktivitu v limitujícím kroku cykloadice. Štěpení furanu probíhá rychle za vzniku stabilního 1,2,3- triazolu [30] . Předběžné studie prokázaly užitečnost této reakce při modifikaci peptidů a byla také použita při tvorbě zobrazovacích sloučenin v SPECT [31] .
Cykloadice s - tetrazinů a ( E )-cyklooktenů probíhá jako Diels-Alderova reakce , po níž následuje retro-Diels-Alderova reakce s uvolňováním dusíku. Reakce probíhá velmi rychle s rychlostní konstantou 2. řádu 2000 M – 1 s – 1 (9:1 v systému methanol – voda ), což umožňuje modifikovat biomolekuly při velmi nízkých koncentracích.
Výpočet ukázal, že energie napětí v ( Z )-cyklooktenech je 7,0 kcal/mol, což je méně než v cyklooktanu (12,4 kcal/mol), v důsledku ztráty dvou transanulárních interakcí. Naopak ( E )-konfigurace dvojné vazby značně zvyšuje napětí kruhu (17,9 kcal/mol), což má pozitivní vliv na rychlost reakce [32] . Jako dienofil se používá 3,6-diaryl- s - tetrazin, který obsahuje substituenty pro potlačení interakce s vodou. Uvolnění dusíku ve druhém stupni činí reakci nevratnou [33] .
Bylo zjištěno, že voda urychluje reakci tetrazinů s cyklookteny. Norborneny byly také použity jako dienofily, ale reakce probíhala mnohem pomaleji (1 M – 1 s – 1 ve vodném prostředí). Reakce tetrazinů s ( E )-cyklooktenem byla použita k označení živých buněk fluorescenční značkou [34] a ke spojení polymerů [35] .
Click reakce izonitrilů je [4+1]-cykloadice následovaná retro-Diels-Alderovou reakcí za uvolnění N2 [ . Z tohoto důvodu je reakce nevratná. Při použití terciárního isonitrilu je produkt stabilní. V případě primárních a sekundárních izonitrilů se tvoří imin, který je následně rychle hydrolyzován (v diagramu znázorněno červeně).
Izonitril je dobrá bioortogonální skupina díky své malé velikosti, stabilitě, netoxicitě a nepřítomnosti v biologických systémech. [4+1]-cykloadiční reakce však probíhá pomalu s rychlostní konstantou 2. řádu 10–2 M – 1 s– 1 .
Tetrazol může podstoupit fotoindukovanou cykloeliminační reakci s uvolňováním dusíku. V tomto případě se vytvoří krátkodobý 1,3 - dipól , který vstupuje do 1,3-dipolární cykloadice s alkeny , což vede k pyrazolinovým aduktům [36] .
Fotoindukce probíhá při krátkodobém vystavení světlu (vlnová délka závisí na tetrazolu). Doba expozice je zvolena tak, aby se snížilo poškození buněk způsobené světlem. Reakce se ve vodném prostředí urychluje a poskytuje jeden regioizomer . Výhody tohoto přístupu spočívají v možnosti prostorové a časové kontroly reakce. Využití reakce je také zjednodušeno tím, že pomocí jednoduchých biologických metod lze do biomolekul zavádět alkeny nebo tetrazoly. Navíc byl vytvořen fluorogenní tetrazol, který umožňuje sledovat stupeň reakce v čase [37] .
Během ligace kvadricyklánu vstupuje napjatý kvadricyklan do [2+2+2]-cykloadice s π-systémy. Kvadricyklan se v nativních biomolekulách nevyskytuje, nereaguje s nimi (díky nasycení molekuly), má relativně malou velikost a silné napětí (≈ 80 kcal/mol). Je však velmi stabilní při pokojové teplotě a ve vodním prostředí při fyziologickém pH. Je schopen selektivně reagovat s elektronově deficitními π-systémy, ale ne s jednoduchými alkeny , alkyny nebo cyklooktyny [13] .
Jako druhé činidlo byl vybrán bis(dithiobenzyl)nikl(II) jako výsledek screeningu na reaktivitu. Aby se zabránilo fotoindukované inverzi na norbornadien, do reakce se přidává diethyldithiokarbamát , který chelatuje nikl ve výsledném produktu. Reakce probíhá s rychlostní konstantou druhého řádu 0,25 M −1 s −1 (ve vodném prostředí).
Využitím této reakce, stejně jako bezměďné azid-alkynové cykloadice a reakce tvorby oximu , byla vytvořena metoda pro současné značení tří substrátů bez vzájemné interference těchto tří reakcí [13] .
V oblasti biokonjugace a chemické biologie je široce používáno několik bioortogonálních reakcí, zejména Staudingerova ligace a azid-alkinová cykloadice bez obsahu mědi .
Systémy buněčné syntézy proteinů, stejně jako enzymy, mohou zavádět nepřirozené aminokyseliny do proteinových struktur a zaměňovat je za přirozené. Zejména bylo zjištěno, že nahrazení methioninu v živném médiu bakterií homopropargylglycinem ( Hpg ) nebo azidohomoalaninem ( Aha ) umožnilo integrovat tyto syntetické aminokyseliny do proteinů syntetizovaných buňkou. Takové proteiny obsahovaly bioortogonální funkční skupiny, azid nebo alkyn, a zavedení biotinu a fluorescenčních barviv vybavených komplementární funkční skupinou (fosfin, cyklooktyn nebo azid) do buňky umožnilo selektivně označit a studovat tyto proteiny. Kromě toho byly azidohomoalanin a homopropargylglycin použity současně k paralelní modifikaci dvou různých typů proteinů [38] .
Bioortogonální chemie také našla uplatnění v profilování aktivity proteinů , které mají afinitu ke konkrétnímu ligandu . K tomu je ligand označen bioortogonální funkční skupinou a zaveden do buňky. Poté, co dojde k navázání proteinů na ligand, je buňka zničena a všechny proteiny se zavedou do reakce s nějakou značkou obsahující komplementární reaktivní skupinu. V tomto případě je značka zavedena pouze do ligandu a umožňuje rozlišit a izolovat pouze ty proteiny, které jsou s tímto ligandem spojeny [39] .
Glykany nejsou přímo geneticky kódovány a nemají specifickou aktivitu proteinů, proto na ně nejsou použitelné metody genetického nebo afinitního značení. Glykany však mohou být metabolicky modifikovány modifikovanými syntetickými sacharidy ( kyselina sialová , N -acetylgalaktosamin, N -acetylglukosamin atd.) obsahujícími azidové skupiny. Glykany s vloženými azidovými skupinami byly zavedeny do Staudingerovy ligace biotinovým činidlem a studovány průtokovou cytometrií [18] .