DNA gyráza (nebo jednoduše gyráza ) je enzym bakterie E. coli a dalších prokaryot , patří do skupiny topoizomeráz . Jako typický představitel topoizomeráz třídy II DNA gyráza zavádí dočasné dvouřetězcové zlomy v DNA během katalytického cyklu. Jedinečnou vlastností DNA gyrázy je schopnost cíleně zavádět negativní supercoils do molekul DNA pomocí energie hydrolýzy ATP .
V roce 2007 byla popsána gyráza u parazitického prvoka Plasmodium falciparum z kmene Apicomplexa [1] . Girase byl také nalezen v chloroplastech a mitochondriích některých rostlin [2] .
Bakteriální DNA gyráza je nezbytná pro realizaci nejdůležitějších buněčných procesů - replikace , buněčné dělení , transkripce [3] . Je cílem mnoha antibiotik , jako je kyselina nalidixová , novobiocin a ciprofloxacin .
DNA gyrázu popsal M. Gellert et al., v roce 1976 [4] .
DNA gyráza je tetramerní enzym sestávající ze dvou podjednotek A (GyrA) a dvou podjednotek B (GyrB). Strukturálně je komplex tvořen třemi páry „brán“, jejichž postupné otevírání a zavírání vede k řízenému přenosu úseku DNA a zavedení dvou negativních supercoilů. N-brány jsou tvořeny ATPázovými doménami B-podjednotek. Vazba dvou molekul ATP stimuluje dimerizaci a v důsledku toho uzavření N-brány, zatímco hydrolýza ATP na ADP naopak stimuluje otevření brány. Brána DNA obsahuje katalytické centrum , které reverzibilně zavádí dvouvláknový zlom do DNA a je tvořeno všemi podjednotkami enzymu. C-brána se skládá pouze z A podjednotek gyrázy [5] . Podjednotky A a B DNA gyrázy jsou homologní s C a E proteiny topoizomerázy IV , stejně jako s C- a N-terminálními doménami eukaryotické topoizomerázy II , v tomto pořadí [6] .
V současné době je mechanismus účinku DNA gyrázy, nazývaný mechanismus průchodu řetězcem, považován za obecně uznávaný. Podle tohoto modelu DNA gyráza interaguje se dvěma funkčními oblastmi DNA, T a G segmenty. V prvním kroku enzym spojí G segment a obalí DNA kolem sebe, čímž vytvoří supercoil odpovídající pozitivní supercoiling . Klíčovou roli v obalování DNA hrají C-terminální domény A-podjednotek ( CTD , z anglického C-terminal domains). Připojení dvou molekul ATP vede k uzavření N-brány tvořené B-podjednotkami enzymu a navázání T-segmentu DNA. Konformační přestavby komplexu způsobují hydrolýzu první molekuly ATP a štěpení G-segmentu v důsledku napadení fosfodiesterových vazeb nukleové kyseliny tyrosiny katalytického centra DNA gyrázy. V dalším kroku prochází T-segment dvouvláknovým zlomem v G-segmentu a G-segment se zpětně uzavře. V konečné fázi katalytického cyklu opouští T-segment enzym přes C-bránu tvořenou A-podjednotkami gyrázy a hydrolyzuje se druhá molekula ATP [7] . K zavedení dvou negativních supercoilů dochází v důsledku inverze znaménka supercoil: pozitivní supercoil vzniklé na začátku katalytického cyklu v důsledku obalení DNA kolem enzymu, řízeného přenosem T-segmentu přes dvojitý- přerušení vlákna v G-segmentu se změní na negativní supercoil [8] . Z matematického hlediska je tato operace ekvivalentní změně spojovacího koeficientu o -2. Podle některých odhadů dosahuje rychlost gyrázy asi 100 supercoilů za sekundu [9] .
Bylo ukázáno, že DNA gyráza má výraznou specificitu pro sekvence DNA. Například jsou známá silná vazebná místa pro enzym z bakteriofága Mu a některé plazmidy (pSC101, pBR322). Mapování vazebných míst DNA gyrázy v genomu E. coli pomocí metody Topo-Seq odhalilo dlouhý (130 nt) vazebný motiv, který vysvětluje existenci silných míst a odráží obalování DNA kolem enzymatického komplexu a flexibilitu nukleové kyseliny. Analýza motivu odhalila oblasti vazby DNA na C-terminální domény podjednotek A, charakterizované periodickým nukleotidovým vzorem oblastí bohatých na AT a GC s periodou blízkou periodě dvoušroubovice DNA (~10,5 nt) [ 3] . Dříve byla podobná pravidelnost vazebného motivu nalezena u eukaryotických nukleozomů , kolem kterých se také ovíjí DNA (146 nt, organizovaná do 1,8 závitů) [10] . Celkem bylo v genomu E. coli nalezeno několik tisíc enzymových míst [3] .
Jak je ukázáno výše, gyráza má schopnost uvolnit pozitivní supercoily a nahradit je negativními. Díky tomu je gyráza extrémně důležitá pro buněčné procesy, během kterých dochází k odvíjení dvoušroubovice DNA, jako je replikace a transkripce DNA . Když se DNA nebo RNA polymeráza pohybuje podél DNA , kladné supercoils se hromadí před enzymem. Takto vzniklé napětí brání dalšímu postupu enzymu. Tento problém řeší gyráza (stejně jako topoizomeráza IV v případě replikace), která uvolňuje kladné supercoily. Gyráza tedy hraje důležitou roli jak v iniciaci, tak v prodlužování procesů syntézy templátu s DNA [8] .
Gyráza je přítomna u prokaryot a některých eukaryot, ale tyto enzymy mají u různých druhů různé sekvence aminokyselin a prostorové struktury. DNA gyráza u lidí chybí, a proto je vhodné ji použít jako cíl pro antibiotika. Existují dvě třídy antibiotik zaměřených na inhibici gyrázy:
Kromě DNA gyrázy, která indukuje tvorbu negativních supercoils, existuje také reverzní gyráza , která způsobuje tvorbu pozitivních supercoils, rovněž s vynaložením energie hydrolýzy ATP . Doposud byla reverzní gyráza nalezena výhradně v hypertermofilních archeích a bakteriích, zatímco DNA gyráza se nachází převážně v mezofilních bakteriích . Bylo registrováno několik unikátních případů, kdy jsou oba enzymy přítomny v jednom organismu – jedná se o hypertermofilní bakterii Thermotoga maritima a hypertermofilní archaea Archaeoglobus fulgidus [6] . Přítomnost reverzní gyrázy u termofilních archeí je spojena s přítomností genetických elementů ( plazmidy , virová DNA) v nich v unikátní pozitivně stočené formě, zatímco plazmidy mezofilních archeí a bakterií jsou zkrouceny negativně. Předpokládá se, že pozitivní supercoiling dodatečně stabilizuje dvoušroubovici DNA a zabraňuje tepelné denaturaci nukleové kyseliny při zvýšených teplotách [11] .
Reverzní gyráza je unikátní kombinací klasické topoizomerázy I. typu a proteinového komplexu s helikázovými vlastnostmi [6] .
| replikace DNA | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Zahájení |
| ||||||
| Prodloužení |
| ||||||
| Ukončení |
| ||||||