RNA polymeráza

RNA polymeráza  je enzym , který syntetizuje molekuly RNA . V úzkém smyslu se RNA polymeráza obvykle nazývá DNA-dependentní RNA polymerázy, které syntetizují molekuly RNA na templátu DNA , to znamená, že provádějí transkripci . Enzymy třídy RNA polymerázy jsou velmi důležité pro fungování buňky, proto se nacházejí ve všech organismech a v mnoha virech . Chemicky jsou RNA polymerázy nukleotidyl transferázy, které polymerují ribonukleotidy na 3' konci řetězce RNA.

Historie studia

RNA polymerázu nezávisle objevili Sam Weiss a Gerard Hurwitz (1928-2019) v roce 1960 . [1] Tou dobou už byla Nobelova cena za medicínu v roce 1959 udělena Severu Ojoovi a Arthuru Kornbergovi za objev toho, co bylo považováno za RNA polymerázu [2] , která se později ukázala jako ribonukleáza .

Nobelovu cenu za chemii v roce 2006 získal Roger Kornberg za získání přesných obrázků molekul RNA polymerázy v různých bodech procesu transkripce. [3]

Správa přepisu

Řízení procesu genové transkripce umožňuje řídit genovou expresi a umožňuje tak buňce přizpůsobit se měnícím se podmínkám prostředí, udržovat metabolické procesy na správné úrovni a také vykonávat specifické funkce nezbytné pro existenci organismu. Není divu, že působení RNA polymerázy je velmi složité a závisí na mnoha faktorech (např. u Escherichia coli bylo identifikováno více než 100 faktorů, které tak či onak ovlivňují RNA polymerázu [4] ).

RNA polymeráza zahajuje transkripci ze specifických oblastí DNA nazývaných promotory a vytváří řetězec RNA, který je komplementární k odpovídající části řetězce DNA.

Proces budování molekuly RNA s nukleotidy se nazývá elongace. V eukaryotických buňkách může RNA polymeráza sestavit řetězce s více než 2,4 miliony prvků ( tuto délku má například kompletní gen pro protein dystrofinu ).

RNA polymeráza dokončí tvorbu řetězce RNA, když narazí na specifickou sekvenci v DNA zvanou terminátor .

RNA polymeráza produkuje následující typy RNA:

• Messenger RNA (mRNA) je templát pro syntézu proteinů v ribozomech .
• Nekódující RNA nebo "RNA gen" je velká třída RNA kódujících genů, na kterých nelze postavit protein. Nejznámějšími zástupci této třídy jsou transferová RNA (tRNA) a ribozomální RNA (rRNA), které se samy účastní procesu syntézy proteinů. Od konce 90. let však bylo objeveno mnoho dalších genů RNA. To umožnilo naznačit, že geny RNA hrají v buňce významnější roli, než se dříve myslelo.
  • Transfer RNA (tRNA), která přenáší aminokyseliny do proteinového řetězce rostoucího na ribozomu během procesu translace .
  • Ribozomální RNA (rRNA), která je součástí ribozomu;
  • mikroRNA , která reguluje genovou aktivitu;
  • Katalytická RNA , která má vlastnosti enzymů.

RNA polymeráza provádí syntézu od nuly. To je možné díky tomu, že interakce počátečního nukleotidu genu a RNA polymerázy mu umožňuje získat oporu v řetězci a zpracovat následující nukleotidy. To částečně vysvětluje, proč RNA polymeráza typicky začíná transkripci s ATP, následovanou GTP, UTP a poté CTP. Na rozdíl od DNA polymerázy má RNA polymeráza také helikázovou aktivitu.

Působení RNA polymerázy

Vazba a zahájení transkripce

Vazba RNA polymerázy zahrnuje α-podjednotku, která rozpoznává element DNA předcházející genu (-40 ... -70 kroků), a σ-faktor, který rozpoznává oblast -10 ... -35. Existuje velké množství σ-faktorů, které řídí genovou expresi. Například: σ 70 , který je syntetizován za normálních podmínek a umožňuje RNA polymeráze vázat se na geny odpovědné za metabolické procesy buňky; nebo σ 32 blokující vazbu RNA polymerázy na geny proteinu tepelného šoku .

Po navázání na DNA se struktura RNA polymerázy změní z uzavřené na otevřenou. Tato transformace zahrnuje separaci monocoilů DNA za vzniku nekroucené oblasti dlouhé asi 13 kroků. Ribonukleotidy jsou pak sestaveny do řetězce podle základního řetězce DNA použitého jako templát. Supercoiling molekul DNA hraje významnou roli v aktivitě RNA polymerázy: protože úsek DNA před RNA polymerázou je nezkroucený, jsou v něm pozitivní kompenzační supercoils. Oblasti DNA za RNA polymerázou jsou opět zkroucené a jsou v nich negativní supercoils.

Prodloužení

Během elongační fáze transkripce se do řetězce přidávají ribonukleotidy a dochází k přechodu ze struktury komplexu RNA polymerázy z otevřené do transkripční. Jak je molekula RNA sestavována, oblast DNA před RNA polymerázou se dále odvíjí a 13-párový otevřený komplex se převádí na 17-párový transkripční komplex. V tomto okamžiku je promotor (oblast DNA -10...-35 kroků) dokončen a σ-faktor je oddělen od RNA polymerázy. To umožňuje, aby se zbytek komplexu RNA polymerázy začal pohybovat vpřed, protože jej σ-faktor držel na místě.

17-párový transkripční komplex obsahuje hybrid DNA a RNA obsahující 8 párů bází - 8-krokovou oblast RNA spojenou s templátovým řetězcem DNA. Jak transkripce postupuje, ribonukleotidy se přidávají na 3' konec sestavené RNA a komplex RNA polymerázy se pohybuje podél řetězce DNA. Ačkoli RNA polymeráza nevykazuje vlastnosti 3'-exonukleázy podobné screeningové aktivitě DNA polymerázy, existují důkazy, že RNA polymeráza zastavuje a opravuje chyby v případech nesprávného párování bází DNA-RNA.

Přidání ribonukleotidů k ​​RNA má mechanismus velmi podobný polymeraci DNA. Předpokládá se, že DNA a RNA polymerázy mohou být evolučně příbuzné. Asparagové zbytky v RNA polymeráze se vážou na ionty Mg 2+ , které naopak zarovnávají fosfátové skupiny ribonukleotidů: první Mg 2+ zadržuje a-fosfát nukleotidového trifosfátu, který má být přidán do řetězce. To umožňuje navázání nukleotidu na 3' OH skupinu konce sestavovaného řetězce a tím přidání NTP k řetězci. Druhý Mg 2+ obsahuje NTP pyrofosfát. Obecná reakční rovnice má tedy tvar:

(NMF) n + NTF --> (NMF) n+1 + PF i

Ukončení

Ukončení transkripce RNA může být ρ nezávislé nebo ρ závislé.

ρ-nezávislé ukončení se provádí bez pomoci ρ-faktoru . Transkripce palindromické oblasti DNA vede k vytvoření RNA vlásenky , smyčkové a spojené se sebou samým. Tato vlásenka je bohatá na guanin a cytosin , díky čemuž je stabilnější než hybrid DNA-RNA. Výsledkem je, že 8-párový hybrid DNA-RNA v transkripčním komplexu je redukován na 4-párový. Pokud jsou tyto poslední 4 páry bází složeny ze slabého adeninu a uridinu , molekula RNA se oddělí. [5]

Bakteriální RNA polymeráza

V bakteriích stejný enzym katalyzuje syntézu tří typů RNA: mRNA , rRNA a tRNA .

RNA polymeráza je poměrně velká molekula. Hlavní enzym obsahuje 5 podjednotek (~400 kDa):

• α 2 : dvě α-podjednotky vážou zbývající prvky enzymu a rozpoznávají regulační faktory. Každá podjednotka se skládá ze dvou domén: aSKD (C-terminální doména) váže první prvek promotoru a αNKD (N-terminální doména) se váže na zbývající složky polymerázy.
• β : Tato podjednotka má vlastní polymerázový účinek, který katalyzuje syntézu RNA. Spouští proces a řídí prodloužení.
• β': váže se nespecificky na DNA.
• ω: Obnovuje denaturovanou RNA polymerázu zpět do životaschopné formy in vitro . Bylo také zjištěno, že má ochranný/ chaperonový účinek na β'-podjednotku v Mycobacterium smegmatis .

K navázání na promotorové oblasti DNA potřebuje hlavní enzym ještě jednu podjednotku - sigma (σ). Faktor sigma významně snižuje afinitu RNA polymerázy k nespecifickým oblastem DNA a zároveň zvyšuje její citlivost k určitým promotorům v závislosti na její struktuře. S jeho pomocí začíná transkripce od požadovaného úseku DNA.

Kompletní holoenzym se tedy skládá ze 6 podjednotek: α 2 ββ'σω (~480 kDa). Ve struktuře RNA polymerázy je přítomna drážka 55 Á (5,5 nm ) dlouhá a 25 Á (2,5 nm) široká. Právě v této drážce je umístěna dvojitá šroubovice DNA o šířce 20 Å (2 nm). Délka drážky je 16 nukleotidů .

Molekuly RNA polymerázy nejsou rozpuštěny v cytoplazmě. Když se RNA polymeráza nepoužívá, váže se na nespecifické oblasti DNA v očekávání otevření aktivního promotoru.

Transkripční kofaktory

Existují proteiny, které se vážou na RNA polymerázu a ovlivňují její chování. Například greA a greB z E. coli zvyšují schopnost RNA polymerázy štěpit templát RNA na rostoucím konci řetězce. Takové štěpení může „zachránit“ uvázlou molekulu RNA polymerázy a pravděpodobně se také podílí na eliminaci chyb při sestavování řetězce RNA.

Samostatný kofaktor , Mfd , se účastní transkripční opravy DNA . Během tohoto procesu RNA polymeráza detekuje poškozené části DNA a rekrutuje další enzymy, aby ji opravily.

Mnoho dalších kofaktorů má regulační účinek, což způsobuje, že RNA polymeráza exprimuje nebo neexprimuje určité geny.

RNA polymeráza v eukaryotických buňkách

Eukaryota mají různé typy RNA polymeráz, klasifikované podle typů RNA, které produkují:

• RNA polymeráza I , která syntetizuje prekurzor 45S rRNA , který se pak změní na 28S, 18S a 5,8S rRNA, které již tvoří hlavní RNA úseky ribozomu . [osm]
• RNA polymeráza II , která produkuje prekurzory pro mRNA , stejně jako pro většinu snRNA a miRNA . [9] Toto je nejvíce dobře prozkoumaný typ RNA polymerázy. Protože transkripce musí být přísně kontrolována, RNA polymeráza II vyžaduje řadu transkripčních faktorů, aby se navázala na promotory.
• RNA polymeráza III , která syntetizuje tRNA , 5S rRNA a další malé RNA přítomné v jádře a cytosolu . [deset]

Existují také další typy RNA polymerázy používané v mitochondriích a chloroplastech . Molekulová hmotnost těchto enzymů je řádově 500 000. Liší se citlivostí na alfa-amanitin . RNA polymeráza I je na něj necitlivá, RNA polymeráza III je středně citlivá a RNA polymeráza II je jí silně inhibována . [jedenáct]

RNA polymeráza v archaea

Archaea používá jeden typ RNA polymerázy, který je nicméně velmi podobný třem hlavním typům RNA polymeráz u eukaryot. Někteří vědci předpokládají, že archaální RNA polymeráza může být do určité míry evolučním předkem specializovaných eukaryotických polymeráz. [12]

RNA polymeráza ve virech

Mnoho virů obsahuje RNA polymerázu. Snad nejlépe prostudovaná virová RNA polymeráza se nachází v bakteriofágu T7. Tato jediná podjednotka RNA polymeráza je podobná mitochondriální a chloroplastové, stejně jako DNA polymeráze. [14] Předpokládá se, že většina virových polymeráz pochází spíše z DNA polymeráz než z komplexních vícesložkových RNA polymeráz.

Virové polymerázy jsou velmi četné. Mnoho z nich může jako templát používat spíše RNA než DNA, jako například u virů s dvouvláknovou RNA nebo negativní jednovláknovou RNA. Některé jednovláknové RNA viry s pozitivní polaritou také obsahují RNA-dependentní RNA polymerázy . [patnáct]

Funkční oblasti

C-terminální doména RNA polymerázy

Iniciace transkripce

Doména umístěná na uhlíkovém konci RNA polymerázy II iniciuje transkripci DNA. C-terminální doména se obvykle skládá z přibližně 52 repetic sekvence Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser [16] . Transkripční faktor TFIIH, což je kináza, hyperfosforyluje C-terminální doménu RNA polymerázy, čímž způsobí, že se polymerázový komplex začne pohybovat z místa iniciace transkripce.

5'-capping

C-koncová doména je také vazebným místem pro zakončovací komplex. U eukaryot po syntéze 5'-konce mRNA fosfatázy k němu koncový fosfát z 5'-konce polyribonukleotidu, enzym guanosin transferáza, přidá guanosinmonofosfát. To tvoří 5',5'-trifosfátovou vazbu. Cap komplex pak disociuje z mRNA, 5' cap z GTP se váže na cap vazebný komplex, C-terminální doménu RNA polymerázy. 5' čepička ve struktuře eukaryotické mRNA má velký význam pro vazbu molekul mRNA na ribozomy a také zabraňuje degradaci RNA.

Spliceosom

C-terminální doména RNA polymerázy je také oblastí vazby na spliceosomové faktory zapojené do procesu sestřihu RNA . Tyto faktory podporují sestřih a odstranění intronů během transkripce RNA.

Mutace v C-terminální doméně

Byla provedena řada studií o chování RNA polymerázy, když jsou určité aminokyseliny odstraněny z její C-terminální domény. Bylo ukázáno, že zkrácené mutace v C-terminální doméně RNA polymerázy II ovlivňují její schopnost zahájit transkripci sady genů in vivo , čímž snižují citlivost na aktivační sekvence těchto genů.

Purifikace RNA polymerázy

RNA polymerázu lze izolovat následujícími způsoby:

• Na fosfocelulózovém sloupci . [17]
• pomocí centrifugace s glycerolovým gradientem . [osmnáct]
• Použití sloupce DNA .
• na iontoměničové koloně . [19]

Stejně jako kombinace výše uvedených metod.

Viz také

• DNA polymeráza
• RNA polymeráza viru T7
• Alfa amanitin

Poznámky

1. ↑ Gerard Hurwitz. The Discovery of RNA Polymerase  (anglicky)  // Journal of Biological Chemistry  : journal. - 2005. - prosinec ( roč. 280 , č. 52 ). - S. 42477-42485 . doi : 10.1074 / jbc.X500006200 . — PMID 16230341 .
2. ↑ Nobelova cena 1959 . Získáno 20. června 2007. Archivováno z originálu 2. února 2007. (neurčitý)
3. ↑ Nobelova cena za chemii 2006 . Získáno 20. června 2007. Archivováno z originálu 26. prosince 2018. (neurčitý)
4. ↑ Akira Ishihama. Funkční modulace RNA polymerázy Escherichia coli  (anglicky)  : journal. - 2000. - Sv. 54 . - str. 499-518 . — PMID 11018136 .
5. ↑ Farnham PJ; Platt T. Rho-nezávislá terminace: dyádová symetrie v DNA způsobuje pauzu RNA polymerázy během transkripce in vitro  // Nucleic Acids Res  . : deník. - 1981. - únor ( roč. 9 , č. 3 ). - str. 563-577 . — PMID 7012794 .
6. ↑ Minakhin L., Bhagat S., Brunning A., Campbell EA, Darst SA, Ebright RH, Severinov K. Bakteriální podjednotka RNA polymerázy omega a podjednotka eukaryotické RNA polymerázy RPB6 jsou sekvenční, strukturální a funkční homology a podporují sestavení RNA polymerázy ( English)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : journal. - 2001. - 30. ledna ( roč. 98 , č. 3 ). - S. 892-897 . - doi : 10.1073/pnas.98.3.892 . — PMID 11158566 .  
7. ↑ Armache KJ, Mitterweger S., Meinhart A., Cramer P. Structures of complete RNA polymerase II and its subcomplex, Rpb4/7  // J Biol Chem  : journal. - 2005. - 25. února ( roč. 280 , č. 8 ). - str. 7131-7134 . - doi : 10.1074/jbc.M413038200 . — PMID 15591044 .  
8. ↑ Grummt I. Regulace transkripce savčího ribozomálního genu pomocí RNA polymerázy I  //  Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. : deník. - 1999. - Sv. 62 . - S. 109-154 . — PMID 9932453 .
9. ↑ Lee Y; Kim M; Han J; Yeom KH; Lee S; Baek S.H.; Kim V.N. MikroRNA geny transkribované RNA polymerázou II  // EMBO  J. : deník. - 2004. - říjen ( roč. 23 , č. 20 ). - S. 4051-4060 . — PMID 15372072 .
10. ↑ Willis IM. RNA polymeráza III. Geny, faktory a transkripční specificita  //  Eur J Biochem. : deník. - 1993. - únor ( roč. 212 , č. 1 ). - str. 1-11 . — PMID 8444147 .
11. ↑ RNA polymerázy: přehled . Získáno 20. února 2011. Archivováno z originálu 6. ledna 2012. (neurčitý)
12. ↑ Langer D. , Hain J. , Thuriaux P. , Zillig W. Transkripce v archaea: podobnost s eucarya.  (anglicky)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1995. - Sv. 92, č.p. 13 . - S. 5768-5772. — PMID 7597027 .
13. ↑ Yin YW, Steitz TA Strukturální základ pro přechod od iniciační k elongační transkripci v T7 RNA polymeráze //  Science : journal. - 2002. - 15. října ( roč. 298 , č. 5597 ). - S. 1387-1395 . - doi : 10.1126/science.1077464 . — PMID 12242451 .  
14. ↑ Hedtke B. , Börner T. , Weihe A. Mitochondriální a chloroplastové RNA polymerázy fágového typu u Arabidopsis.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 1997. - Sv. 277, č.p. 5327 . - S. 809-811. — PMID 9242608 .
15. ↑ Ahlquist P. RNA-dependentní RNA polymerázy, viry a umlčování RNA.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 2002. - Sv. 296, č.p. 5571 . - S. 1270-1273. - doi : 10.1126/science.1069132 . — PMID 12016304 .
16. ↑ Anton Meinhart1; Patrik Cramer. Rozpoznání karboxy-terminální domény RNA polymerázy II 3'-RNA-processing faktory  (anglicky)  // Nature : journal. - 2004. - Červenec ( roč. 430 , č. 6996 ). - str. 223-226 . - doi : 10.1038/nature02679 . — PMID 15241417 .
17. ↑ Kelly JL; Lehman IR. Kvasinková mitochondriální RNA polymeráza. Purifikace a vlastnosti katalytické podjednotky  // J Biol Chem  .  : deník. - 1986. - srpen ( roč. 261 , č. 22 ). - S. 10340-10347 . — PMID 3525543 .
18. ↑ Honda A a spol. Purifikace a molekulární struktura RNA polymerázy z viru chřipky A/PR8  (anglicky)  // J Biochem (Tokio) : deník. - 1990. - Duben ( roč. 107 , č. 4 ). - str. 624-628 . — PMID 2358436 .
19. ↑ Hager DA , Jin DJ , Burgess RR Použití iontoměničové chromatografie s vysokým rozlišením Mono Q k získání vysoce čisté a aktivní RNA polymerázy Escherichia coli.  (anglicky)  // Biochemie. - 1990. - Sv. 29, č. 34 . - S. 7890-7894. — PMID 2261443 .

Literatura

• Lehninger Principles of Biochemistry, 4. vydání, David L. Nelson & Michael M. Cox

Odkazy

• DNAi  - DNA interaktivní: Informace a videa Flash o RNA polymeráze.
• animace RNA polymerázy Transscription - animace RNA polymerázy v akci

Slovníky a encyklopedie	Velká Katalánština Skvělý norský Velký Rus chorvatský Britannica (online) Brockhaus
V bibliografických katalozích	J9U : 987007541391605171 LCCN : sh87001690 NDL : 00575477

Přepis (biologie)
Regulace transkripce	prokaryota operon ( laktózový operon tryptofanový operon GABA operon arabinózový operon galaktózový operon ) represor ( represor laktózy tryptofanový represor ) eukaryota enzymy modifikující histony ( histony / nukleozomy ) Proteiny polycomb group , histon methyltransferáza EZH2 Histondemethyláza Acetylace a deacetylace histonů ( histonová deacetyláza HDAC1 histon acetyltransferáza ) methylace DNA DNA methyltransferáza Remodelace chromatinu CHD7 Společné pro pro- a eukaryota Koregulátory transkripce ( Koaktivátor korepresor induktor ) Transkripční faktory
Aktivace	Promotér ( Pribnov-box TATA box BRE Krabice CAAT Vzájemné prvky ) Enhancer ( E-box Vzájemné prvky ) Izolátor Tlumič
Zahájení	Místo začátku přepisu
Prodloužení	bakteriální RNA polymeráza : rpoB eukaryotická RNA polymeráza: RNA polymeráza II , RNA polymeráza III
Ukončení	Terminátor Ro nezávislé ukončení Ro faktor