Krátké otevřené čtecí rámce [1] ( anglicky upstream open reading frames, uORF ) jsou otevřené čtecí rámce ( anglicky open reading frame, ORF ) umístěné uvnitř 5'-nepřeložené oblasti (5'-UTR) eukaryotických a některých virových [2]. mRNA . uORF se podílejí na regulaci genové exprese u eukaryot a virů [3] [4] a obvykle potlačují translaci hlavního čtecího rámce (tj. kódující sekvence ), i když jejich působení může být doprovázeno různými účinky [ 5] .
Obecně se mRNA dělí na 5'-nepřeloženou oblast (5'-UTR), otevřený čtecí rámec (CDS), který začíná na start kodonu a končí na stop kodonu, a 3-netranslatovanou oblast (3'- UTR). Krátké otevřené čtecí rámce (uORF) jsou v 5'-UTR před hlavním čtecím rámcem. UORF se však může překrývat s hlavní kódující sekvencí ( angl. coding sequence, CDS ), pak je jeho stop kodon umístěn za iniciačním kodonem CDS [1] .
uORF jsou přítomny přibližně v 50 % 5'-UTR lidských mRNA a alespoň 35 % savčích mRNA [1] a jejich přítomnost způsobuje snížení genové exprese, snížení množství funkční mRNA o 30 % a proteinů tvorba o 30-80 %. Ribozomy, které se vážou na start kodon krátkého otevřeného čtecího rámce (uAUG), zahajují translaci uORF, což může nepříznivě ovlivnit účinnost translace hlavního čtecího rámce (tj. kódující oblasti). Pokud nedochází k účinné vazbě ribozomu na start kodon v kódující oblasti (tj. iniciace translace), pak v důsledku toho klesá úroveň tvorby proteinu a tím i úroveň exprese odpovídajícího genu. Může nastat i opačná situace: translace uORF bude pokračovat do translace kódující oblasti a v důsledku toho se vytvoří příliš dlouhý protein, který může být pro tělo škodlivý.
Snížení účinnosti translace v důsledku přítomnosti uORF v 5'-UTR je dobře prozkoumaným účinkem; jedním příkladem, který to ilustruje, je gen poly(A)-polymerázy a ( poly( A )-polymeráza a, PAPOLA ) , jehož mRNA obsahuje dva vysoce konzervované uORF v 5'-UTR. Mutace proximálního uAUG způsobuje zvýšení účinnosti translace této mRNA, proto uORF významně snižuje expresi tohoto genu. Dalším příkladem je receptor hormonu štítné žlázy , který má aktivační nebo represivní účinek na transkripci řady cílových genů: silná represe jeho translace se provádí 15nukleotidovým uORF uvnitř 5'-UTR jeho mRNA [6] .
Obecně se má za to, že uORF snižují účinnost translace, protože po ukončení translace uORF nemůže ribozom znovu zahájit translaci a přeložit kódující oblast. Bylo prokázáno, že pro úspěšnou reiniciaci translace by délka uORF neměla přesáhnout 20 kodonů, ale pro tuto skutečnost stále neexistuje uspokojivé vysvětlení [1] . V některých případech a za určitých podmínek může být startovací kodon uORF ignorován skenovacím ribozomem. Zároveň pod vlivem některých vnitřních a vnějších faktorů může být zesílen inhibiční účinek uORF, přičemž hlavním z těchto limitujících faktorů je dostupnost iniciačního komplexu po ukončení translace uORF [7] .
Nedávné studie více než 500 genových lokusů obsahujících 5'-UTR však ukázaly, že neexistuje žádný definitivní vztah mezi účinkem uORF na expresi dalšího genu a vzdáleností mezi uORF a kódující sekvencí. Autoři studie zároveň naznačují, že v genech obsahujících jeden uORF s největší pravděpodobností k translaci CDS dochází po skenování uORF ribozomem bez jeho disociace, a nikoli prostřednictvím reiniciace translace. Tento předpoklad se velmi liší od závěrů Kozáka (1987) a obecně od všech předchozích představ o uORF (v té době bylo za správné ve všech případech považováno pravidlo, podle kterého ribozom začíná translaci od prvního startovacího kodonu, který narazí při pohybu z 5'- na 3'-konec mRNA [8] ).
Navíc experimenty s buňkami postrádajícími Rent1 (faktor zapojený do procesu řízené destrukce defektních mRNA - nesmyslem zprostředkovaný rozpad, NMD ) ukázaly, že v nepřítomnosti NMD byly transkripty obsahující uORF úspěšně přeloženy. To ukazuje, že NMD také hraje důležitou roli v regulaci fungování těchto přepisů. S největší pravděpodobností existuje několik možností pro vývoj událostí po interakci uORF a ribozomu: pokračování translace, pokračování skenování nebo opětovné zahájení translace kódující oblasti a která z nich nastane, závisí na řadu faktorů.
GCN4mRNA kvasinkového genu GCN4 , který kóduje aktivátor transkripce, tedy obsahuje 4 uORF v 5'-UTR a pouze jeden z nich umožňuje ribozomu zahájit translaci kódující oblasti. Efektivní reiniciaci usnadňují dva cis - zesilovače umístěné na obou stranách uORF. Další studie ukázaly, že 5'-cis-aktivační sekvence (enhancer) interaguje s N-terminální doménou podjednotky eIF3A /TIF32 iniciačního faktoru eIF3, v důsledku čehož zůstává podjednotka ribozomu 40S na mRNA po translaci uORF1 a pokračuje ve skenování. Bylo také zjištěno, že reiniciace je usnadněna specifickým skládáním mRNA během skenování ribozomů a toto skládání umožňuje zesilovači interagovat s jinou sekvencí mRNA. Toto je jen jeden příklad knockoutu genu uORF, ale nyní je jasné, že mechanismus knockoutu je mnohem složitější, než naznačuje skenovací model. K podrobnému objasnění tohoto mechanismu nebo mechanismů je zapotřebí dalšího výzkumu [9] .
Proteinkináza CDalším příkladem ilustrujícím složitost mechanismů vypínání genů zprostředkovaných uORF je proteinkináza C ( PKC ) . PKC je členem rodiny serin/threonin proteinkináz , která se podílí na regulaci buněčného růstu a diferenciace . Jeho nová izoforma , PKCη, je tkáňově specifická a je exprimována hlavně v rychle se měnících buňkách, jako jsou epiteliální buňky . Nedávno bylo zjištěno, že tato izoforma hraje specifickou roli v reakci na stres a její exprese koreluje s rezistencí na protirakovinné léky u řady druhů rakoviny . 5'-UTR lidské PKCη je dlouhá (659 nukleotidů), sekvence bohatá na GC a obsahuje 2 malé konzervované uORF. Mutace v každém z těchto uORF způsobují mírné zvýšení (1,5 a 2,2krát) v expresi hlavního ORF a mutace v obou způsobí trojnásobné zvýšení. Mechanismus represe translace PKCη zřejmě probíhá za normálních podmínek. Za stresových podmínek (nedostatek glukózy nebo hypoxie ) se na expresi podílejí také dva uORF, protože poskytují slabé skenování 5'-UTR a zvyšují translaci kódující sekvence. Variace v počtu ribozomů vázaných na transkript a translaci každého uORF může také poskytnout buněčně specifické „ladění“ genové exprese [10] .
Ornitin dekarboxylázaBylo zjištěno, že kromě AUG lze jako místo startu transkripce použít také kodony, které se liší od AUG jedním nukleotidem, a účinnost iniciace v každém případě bude určena prostředím nestandardního startovacího kodonu. Exprese ornithin dekarboxylázy ( angl. ornithine dekarboxylase, ODC ), která se účastní biosyntézy polyaminů , je tedy modulována pomocí uORF se startovacím kodonem AUU. Účinnost iniciace se v tomto případě liší v závislosti na intracelulární koncentraci polyaminů, zatímco účinnost iniciace na AUU je silně snížena u buněk ochuzených o polyaminy: je to 18 % účinnosti translace hlavního ORF a u buněk nasycených u polyaminů je to 54 %. Snížená exprese ODC je tedy udržována v přítomnosti polyaminů. Tento příklad ukazuje, že pravděpodobně existuje mnohem větší počet uORF, než se dříve myslelo [10] .
Ornitin dekarboxylázaAčkoli většina uORF negativně ovlivňuje genovou expresi, někdy přítomnost uORF zvyšuje translaci. Příkladem je bicistronní vpu-env mRNA viru HIV -1 , která obsahuje konzervovaný velmi malý uORF. Tento uORF se nachází pouze 5 nukleotidů před AUG vpu a brzy končí stop kodonem překrývajícím se s AUG vpu . Bylo zjištěno, že tento uORF má významný příznivý účinek na translaci env , aniž by interferoval s translací vpu . Byly získány mutanty, u kterých byla vzdálenost mezi uORF a hlavním AUG zvýšena o 5 nukleotidů, a ukázalo se, že uORF se nepodílí na iniciaci vpu . Na základě toho autoři studie navrhli, že tento malý uORF může sloužit jako retardační místo ribozomu, během kterého ribozom interaguje se strukturami RNA , které usnadňují jeho propagaci, to znamená, že fyzicky překoná část 5'-UTR, aby dosáhl hlavní iniciační kodon [11] .
RNáza HV posledním desetiletí se ukázalo, že regulace genové exprese pomocí uORF je komplexní proces. Dobrým příkladem takové složité regulace je následující mechanismus. RNáza H1 je přítomna v jádrech a mitochondriích savčích buněk a je exprimována odlišně v různých typech buněk. Exprese izoforem tohoto enzymu je pod kontrolou dvou intraframe start kodonů AUG, stejně jako uORF, lokalizovaných v 5'-UTR. Translace RNázy H1 v mitochondriích začíná v prvním kodonu AUG a je obvykle omezena na uORF, což má za následek, že množství mitochondriální izoformy je asi 10 % množství jaderné izoformy. Translace jaderné izoformy začíná od druhého AUG a nezávisí na uORF, protože ribozom je schopen účinně znovu zahájit translaci z druhého AUG, jako by uORF vynechal. Tento regulační mechanismus umožňuje řídit expresi RNázy H1 v mitochondriích, kde její nadbytek může vést k buněčné smrti, aniž by to ovlivnilo normální úroveň exprese jaderné izoformy. Bylo také zjištěno, že změna v nukleotidovém prostředí AUG způsobila akumulaci transkriptu, což ukazuje na zapojení dalších faktorů do tohoto mechanismu. Tento příklad ilustruje vysoce specifický systém regulace genové exprese, kde se účastní uORF a další faktory [12] .
Konečně alternativní promotory a sestřih , stejně jako skutečnost, že ribozom může někdy interagovat s kodony mimo rámec a používat nestandardní startovací kodony , poskytuje další příležitosti pro regulaci genové exprese za účasti uORF. Nedávná studie na lidské monocytové buněčné linii , která byla ošetřena puromycinem pro předčasné ukončení translace a byla určena místa iniciace translace, ukázala 2994 nových uORF v samotné 5'-UTR, i když je jisté, že mnoho uORF se také překrývá s kódující oblastí a 3'-UTR [13] .
Skutečná nukleotidová sekvence uORF obvykle neovlivňuje jejich působení; důležitá je pouze délka, počet a vzdálenosti mezi uORF [7] . V některých případech však účinek uORF stále závisí na jeho nukleotidové sekvenci, zejména na aminokyselinové sekvenci peptidu , který kóduje [14] . Přestože význam uORF jako regulačních prvků zapojených do regulace vazby a translace ribozomů je dobře znám, funkce a dokonce i osud peptidů kódovaných uORF je často neznámý, pravděpodobně kvůli potížím s analýzou úrovně exprese a lokalizace peptidů. . Důkaz, že v buňkách jsou přítomny peptidy translatované uORF, byl získán v roce 2004, kdy bylo identifikováno 54 peptidů dlouhých méně než 100 aminokyselinových zbytků. Tyto peptidy byly produkovány v buňkách lidské chronické myeloidní leukémie , z nichž každá obsahovala uORF. Ačkoli byly tyto peptidy identifikovány, není známo, že by tisíce uORF v těchto buňkách produkovaly proteiny, které lze experimentálně identifikovat. To může naznačovat, že za prvé, proteiny translatované z uORF mohou být selektivně podrobeny proteolýze ; za druhé, některé uORF jsou exprimovány, ale ne v buňkách tohoto typu; za třetí, mnoho uORF nedává vzniknout proteinům. Je však zřejmé, že některé uORF jsou stále překládány na peptidy, které se hromadí v buňkách, a proto zjevně nesou funkční zátěž, i když pro mnohé to ještě nebylo stanoveno [12] .
V některých případech je však mechanismus účinku peptidů kódovaných uORF znám. Takový peptid funguje jako cis -regulační prvek a zůstává spojen s translačním ribozomem. Mechanismus jeho působení je zřejmě spojen se specifickou interakcí peptidu s ribozomem, což má za následek zpoždění terminace a nemožnost dalšího pohybu ribozomu po mRNA. Příklady mRNA, jejichž uORF kódují inhibiční peptidy, jsou savčí S - adenosylmethionin dekarboxyláza mRNA, kvasinková CPA1 mRNA kódující enzym biosyntézu argininu ; gp48 mRNA lidského cytomegaloviru . Délka těchto peptidů se pohybuje od 6 do 25 aminokyselinových zbytků a bylo prokázáno, že právě jejich aminokyselinová sekvence určuje inhibiční účinek [15] .
Inhibici translace kódující sekvence v důsledku uORF lze regulovat řadou trans faktorů a podmínek prostředí. Například translace již zmíněné mRNA S-adenosylmethionin dekarboxylázy je inhibována uORF v klidových T buňkách , ale translace je úspěšná ve stimulovaných T buňkách a T-buňkách; v jejich případě se zdá, že uORF je skenováním ribozomů ignorován. Dalším příkladem je již zmíněná kvasinková CPA1 mRNA. V jejím případě uORF blokuje translaci hlavního čtecího rámce pouze v přítomnosti argininu. Přesný mechanismus této regulace nebyl stanoven, ale inhibice funkce peptidyltransferázy v reakci na přidání argininu zastaví ribozomy na stop kodonu uORF. Předpokládá se, že arginin buď přímo inhibuje aktivitu peptidyltransferázy , nebo snižuje dostupnost A-místa ribozomu [16] .
Zajímavý jev je pozorován při translaci polycistronní RNA viru mozaiky květáku ( virus mozaiky květáku, CaMV ) . Jeho 5'-UTR obsahuje uORF, které podle očekávání mají supresivní účinek na translaci kódující sekvence. Navíc téměř celý 5'-UTR zapadá do vlásenky s rozvinutou sekundární a terciární strukturou , která vytváří překážku pohybu ribozomu. To se děje v rostlinných buňkách, které nejsou hostiteli viru, a v bezbuněčných systémech připravených z jejich extraktů. V rostlinných hostitelích viru však dochází k translaci, zřejmě v důsledku přítomnosti speciálního buněčného faktoru a prvních uORF. Podrobná studie odhalila, že když je CaMV RNA translačně aktivní, ribozomy přeskakují centrální část vlásenky s prostorovou strukturou, jako by ji přeskakovaly. Jinými slovy, v tomto případě dochází k posunování , při kterém ribozom čte první 3 uORF, zatímco se základna vlásenky odvíjí a ribozom vstoupí do zóny s takovou strukturou, že může z místa vyskočit bezprostředně po třetí uORF do místa uvnitř sedmého uORF; poté se ribozom posune dále směrem k 3'-konci a začne překládat kódující oblast [17] .
Mutace ovlivňující uORF jsou obecně škodlivé, protože narušují systém regulace genové exprese, což může přímo vést k onemocnění. Například mutace, které ničí uORF v 5'-UTR genu kódujícího protein HR ( anglicky humanless hairless homolog ), vedou k autozomálně dominantní formě alopecie . Neméně škodlivé jsou mutace, které vytvářejí nové uORF, protože také narušují normální regulaci genové exprese. Bylo navrženo, že mutace v tumor supresorovém genu může vést ke snížené expresi ochranných proteinů a rozvoji rakoviny. Mutace v CDKN2A genu kódujícím inhibitor proteinkináz mohou být předpokladem pro rozvoj melanomu . Bylo zjištěno, že mutace v uORF mohou také vést k rozvoji onemocnění, jako je dědičná trombocytémie , Alzheimerova choroba , bipolární afektivní porucha , kardiomyopatie , arytmogenní dysplazie pravé komory [18] . Všechny tyto příklady opět dokazují mimořádný význam uORF v jemné regulaci genové exprese a udržování homeostázy a variabilita v oblasti uORF může určovat individuální fenotyp nebo predispozici k onemocněním [19] .