Jednobuněčné sekvenování DNA

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 12. října 2019; kontroly vyžadují 5 úprav .

Jednobuněčné sekvenování DNA je přístup  , který umožňuje získat data o sekvenci DNA jednotlivé buňky pomocí sekvenování , a tedy identifikovat rozdíly mezi jednotlivými buňkami jednobuněčných organismů , orgány, tkáněmi a buněčnými subpopulacemi mnohobuněčných organismů . Tento přístup umožňuje analyzovat funkční vlastnosti buňky v kontextu mikroprostředí. Sekvenování jednobuněčného genomu zahrnuje několik kroků: izolaci jedné buňky, amplifikace celého genomu , vytvoření knihovny a sekvenování DNA pomocí technik sekvenování nové generace .

S příchodem různých metod sekvenování bylo možné stanovit sekvenci genomové DNA. Většina dosavadních dat však byla získána sekvenováním vzorků genomové DNA izolovaných z populací mikroorganismů nebo buněčných subpopulací mnohobuněčných organismů [1] . Je však známo, že diverzita v obou skupinách může být významná, protože samotné buňky přispívají k existenci populace nebo organismu různým způsobem.

Sekvenování genomu jedné buňky umožňuje přenést studium genomu na buněčnou úroveň. Dnes pomáhá řešit takové problémy, jako je de novo sekvenování nekultivovatelných mikroorganismů [2] , studium genetické mozaiky v normálních a patologických případech [3] , identifikace a studium příspěvku subpopulací nádorových buněk k rozvoji rakoviny a vznik rezistence na léčbu [4] .

Technologické výzvy

Jednobuněčné sekvenování DNA čelí výzvám fyzické izolace jednotlivých buněk , výběru amplifikační metody s nejmenším potenciálem pro zavádění chyb pro získání dostatečného množství materiálu a výběru sekvenační metody [5] [6] .

Izolace jednotlivých buněk

Prvním krokem při izolaci buněk je vytvoření suspenze životaschopných buněk, které nejsou vzájemně spojeny. Účelem izolace může být buď náhodný výběr buněk pro vytvoření reprezentativního vzorku při analýze složení subpopulací, nebo cílené vyhledávání konkrétních buněk. Při studiu tvrdých tkání je nutná předběžná mechanická nebo chemická disociace vzorku a podmínky disociace by měly stejně působit na všechny subpopulace tkáňových buněk. To je nezbytné pro vytvoření vzorku , který je nestranný vzhledem k původní sadě buněk , kde je zachována počáteční reprezentace buněk, což může být důležité pro analýzu složení subpopulací. Je třeba mít na paměti, že podmínky pro disociaci normálních a nezdravých tkání se mohou lišit, proto je v této fázi důležité zvolit vhodné podmínky. Je možná i práce se vzorky celé tkáně, např. pomocí laserové záchytné mikrodisekce [7] .

Po získání suspenze lze buňky izolovat sériovým ředěním [8] , mikropipetováním [9] , ředěním v mikrojamkách [10] pomocí optické pinzety . Fluorescenční průtokovou cytometrii lze použít k izolaci buněk se specifickými fluorescenčními vlastnostmi, které mohou být buď přirozené, nebo zavedené experimentátorem. Automatizované metody mikromanipulace [11] [12] v poslední době zaznamenaly velký rozvoj , včetně izolace buněk na čipech pomocí mikrofluidních technologií [13] ; odběr nanobiopsií již umožňuje studovat DNA jednotlivých organel [14] . Izolované buňky následně podstoupí lýzu .

Amplifikace celého genomu

Další krok, amplifikace celého  genomu (WGA ), se používá k vytvoření dostatečného množství DNA k detekci signálu a jeho extrakci ze šumu v budoucnu během sekvenování. Současně je žádoucí minimalizovat zavádění takových artefaktů, jako je preferenční amplifikace jednoduchých sekvencí, zavádění náhodných mutací a tvorba chimérických sekvencí. V poslední době se objevila sada možností řešení tohoto problému. Použití PCR se neodůvodnilo, například kvůli zvýšené frekvenci vnášení chyb termostabilními polymerázami . Proto izotermické a hybridní metody, jako je metoda amplifikace s vícenásobným posunem amplifikace ( anglicky Multiple displacement amplification, MDA ) a amplifikace s vícenásobnou rektifikací a smyčkováním ( anglicky Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC ) [15] .   

MDA

MDA umožňuje rychlou amplifikaci DNA bez potřeby PCR. Metoda je založena na použití fágové polymerázy phi29, která se vyznačuje zvýšenou procesivitou ( dokáže syntetizovat oblasti dlouhé přes 10 kilobází bez disociace) a nízkou chybovostí (1 na 10 6–10 7 párů bází ). Reakce probíhá následovně: hexamerní primery jsou žíhány na matrici, prodlužované polymerázou; když enzym narazí na jiný primer (který se také prodlouží), vytěsní ho (nahradí) a pokračuje v cestě templátem. Substituované nově syntetizované místo slouží jako přistávací místo pro nové primery a stává se templátem. Vzniká tak rozvětvený strom, kde na každé větvi dochází k syntéze. Na konci postupu se polymeráza inhibuje , přidá se nukleáza S1, která odštěpí větve v místech větvení, a DNA polymeráza I k dokončení výsledných jednořetězcových úseků [15] .

Metoda má řadu problémů, jako je ztráta alely , preferenční amplifikace a interakce mezi primery. První problém vyvstává z náhodného zesílení pouze jedné z alel u heterozygotů , což má za následek, že heterozygoti jsou nesprávně identifikováni jako homozygoti . Vzhledem k vysoké frekvenci tohoto efektu (0 - 60 %) klesá přesnost genotypizace . Druhým problémem je přeamplifikace jedné alely nad ostatními. K interakcím mezi hexamerními primery dochází v důsledku náhodné povahy sekvencí; lze je významně snížit zavedením omezení syntézy těchto primerů [15] .

MALBACS

MALBAC je hybridní lineární metoda amplifikace celého genomu. Metoda je založena na speciálních primerech: jsou dlouhé 35 nukleotidů , z nichž 27 je stejných ve všech primerech (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG) a zbývajících 8 nukleotidů se liší. Celý proces amplifikace je popsán následovně [9] :

  1. Tání (94 °C) dvouvláknové DNA s tvorbou jednovláknových fragmentů.
  2. Chlazení (0 °C), přidání primerů a polymerázy.
  3. Nasedání primerů na náhodných místech na templátu. Bst DNA polymeráza prodlužuje primery za vzniku polovičního amplikonu při 64 °C. Všechny čítací primery jsou vytěsněny z templátu.
  4. Tání (94 °C), oddělení semi-amplikonu od matrice.
  5. Chlazení (0 °C), přidání primerů a polymerázy. Primery se účinně vážou jak na templát, tak na semi-amplikon.
  6. Bst DNA polymeráza prodlužuje primery při 64 °C. Semi-amplikony jsou syntetizovány na počáteční matrici, plné amplikony jsou syntetizovány na semi-amplikonech získaných dříve .
  7. Tání (94 °C).
  8. Smyčka (58°C): 3' a 5' konce úplných amplikonů se vzájemně doplňují a tvoří smyčku, která brání použití celého amplikonu jako šablony.
  9. Opakujte kroky 5-8 pětkrát.
  10. PCR s použitím 27 běžných nukleotidů jako primerů k amplifikaci pouze kompletních amplikonů [9] .

Výhodou metody je snížení šumu spojeného s exponenciální povahou PCR amplifikace díky zavedení předběžné kvazilineární amplifikace. To umožnilo zvýšit pokrytí genomu (podíl genomu pokrytého alespoň jedním čtením), snížit pravděpodobnost ztráty alel a jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Pro vstup je navíc potřeba velmi malé množství výchozí DNA, nicméně jakákoli kontaminace vzorků může výrazně ovlivnit výsledky sekvenování [9] .

Nevýhodou je, že pro zbavení se falešně pozitivních výsledků je nutné porovnat výsledky sekvenování 2–3 buněk ze stejných i různých buněčných linií [9] . V tomto případě mohou být některé polymorfismy ztraceny, protože buňky patřící do stejné buněčné linie mají stále určité rozdíly v genomu. Použitá bst DNA polymeráza má navíc vysokou chybovost (1 z 10 5 bází) [16] .

Porovnání metod amplifikace celého genomu

V poslední době bylo provedeno několik studií srovnávajících tyto metody [17] [18] [19] . Jedna studie dospěla k závěru, že MDA poskytuje větší pokrytí než MALBAC (84 %, resp. 52 %), což umožňuje přesnější detekci jednonukleotidových polymorfismů [17] . MALBAC však poskytuje jednotnější pokrytí, a proto umožňuje přesnější detekci variací počtu kopií (CNV) [17] . Je zajímavé, že při sekvenování některých buněk byla úroveň detekce variací počtu kopií metodou MDA srovnatelná s úrovní MALBAC [17] . Jiní autoři také potvrzují rozdíl v pokrytí mezi MDA a MALBAC (84 % a 72 %) a srovnatelně vyšší uniformitu pokrytí MALBAC ( variační koeficient 0,10 oproti 0,21 pro MDA) [18] . Bylo prokázáno, že MDA produkuje méně falešně pozitivních výsledků, ale počet falešně negativních výsledků se liší experiment od experimentu [18] . MALBAC poskytuje nižší míru ztráty alel (21 %), jeho pokrytí je však menší než u MDA [18] . Obecně není jasné, která z nich vede k menšímu počtu falešně negativních výsledků, protože MDA pokrývá větší část genomu, ale ztrácí více alel kvůli preferenční amplifikaci pouze jedné z alel u heterozygota [15] [18] .

MDA a MALBAC tedy mají řadu výhod a nevýhod a výběr by měl záviset na aktuálním úkolu.

Vytvoření knihovny

Po amplifikaci mohou být knihovny připraveny pomocí komerčních kitů. Zde je možných několik možností: výběr konkrétního lokusu , výběr exomu nebo celého genomu pro další sekvenování. Každá z těchto možností předpokládá určité hodnoty pokrytí, náchylnosti k chybám a nákladů [20] . Výběr malých oblastí umožňuje zaměřit se na oblasti, které nejvíce biologicky přispívají k práci studovaného systému. To snižuje náklady na výzkum a pravděpodobnost zanesení chyb při přípravě vzorků. Použití referenčního genomu falešně pozitivní výsledky, i když omezuje detekované jednonukleotidové polymorfismy na polymorfismy přítomné v referenčním genomu. Exomové sekvenování umožňuje izolovat jedinečné vlastnosti buněk, avšak s rostoucí délkou sekvenované oblasti se zvyšuje pravděpodobnost zavedení chyb během amplifikace. Využití celého genomu umožňuje identifikovat nekódující a strukturální oblasti, ale náklady na výzkum dramaticky rostou, což ztěžuje provedení sekvenování celého genomu mnoha buněk [20] .

DNA z knihoven vytvořených tak či onak se používá při sekvenování některou z existujících metod .

Zpracování dat

Časté chyby

Většina sekvenačních artefaktů se vyskytuje během přípravy vzorku: izolace buněk, kontaminace genomové DNA, amplifikace a tvorba knihovny, protože všechny tyto kroky zavádějí další chyby, ztrátu pokrytí, snížení homogenity pokrytí, zkreslení vzorkování v preferenční selekci určitých skupin buněk a amplifikaci některých sekvencí DNA jsou příčinou ztráty alel v heterozygotních pozicích. V úvahu je třeba vzít i buněčné linie, na kterých se provádí optimalizace všech fází sekvenování: ne všechny buňky jsou diploidní , existují haploidní i aneuploidní populace a jejich ploidie může experiment významně ovlivnit [4] . Překážkou porovnávání různých výsledků v této oblasti je někdy nedostatek informací o celkovém počtu hodnocených buněk a míře hodnocení kvality sekvenování v konkrétních studiích [20] .

Jednonukleotidové polymorfismy

Jednonukleotidové polymorfismy podle projektu 1000 genomes přinášejí do lidského genomu největší rozmanitost [21] : 38 milionů jednonukleotidových polymorfismů, 1,4 milionu inzercí / delecí a více než 14 tisíc velkých delecí [21] byly potvrzeny na mapě haplotypů . Předpokládá se také, že mnoho komplexních onemocnění, jako je Alzheimerova choroba [22] , různé typy rakoviny [23] , autoimunitní onemocnění [24] mohou být spojeny právě s přítomností polymorfismů.

Dnes se hledání polymorfismů v datech jednobuněčného sekvenování opírá o stejné algoritmy jako analýza výsledků konvenčního sekvenování: GATK [25] , SNPdetector [26] , SOAPsnp [27] , VarScan [28] . Existují však rozdíly mezi sekvenováním buněčné populace a sekvenováním jednotlivých buněk: sekvenování jednotlivých buněk má menší pokrytí genomu a vyšší míru falešně pozitivních výsledků.

Rozdíl v počtu kopií segmentů DNA

Variace v počtu kopií fragmentů DNA vedou k abnormálnímu počtu kopií těchto fragmentů; rozmanitost tohoto typu genetického polymorfismu ovlivňuje i lidské zdraví [29] [30] . Některé studie zdůrazňují jejich souvislost se vznikem nádorů [31] , autoimunitních onemocnění [24] , autismu [32] atd. Zde, stejně jako při hledání jednonukleotidových polymorfismů, se v zásadě používají stejné algoritmy jako pro konvenční sekvenování: CNV -seq [33] , PenCNV [34] , CNAseg [35] , ReadDepth [36] a cn.MOPS [37] . Aby bylo možné zohlednit vnesený šum, je nutné analyzovat vliv amplifikačních metod na výskyt a vymizení odchylek v počtu kopií DNA [38] .

Srovnávací analýza buněk

Jednou ze strategií pro shlukování buněk na základě genomických dat je zavedení funkce vzdálenosti, která kvantifikuje rozdíly mezi páry vzorků [39] . V tomto případě je Jaccard Measure považována za nejvhodnější vzhledem k binární povaze genetických dat (viz níže) [40] . Alternativou k metodám založeným na distančních funkcích je shlukování založené na modelu , které předpokládá pravděpodobnostní přístup: namísto „tvrdých“ vzdáleností jsou zavedeny „měkké“ pravděpodobnosti původu buněk z různých klonů.

Po předložení dat jednobuněčného sekvenování jako matice , kde jsou zájmové mutace označeny svisle a buňky vodorovně, vyplníme je 0 a 1 v závislosti na přítomnosti konkrétní mutace v konkrétní buňce. Pokud je nádor vyšetřen, pak je v průběhu času charakterizován expanzí některých klonů a vymizením jiných [41] . Zároveň nevíme, kolik kterých klonů je přítomno, a předpokládáme, že část dat byla ztracena během přípravy vzorku.

Parametry modelu, jako je pravděpodobnost, že buňka sestoupí z konkrétního klonu, stejně jako míra falešně negativních výsledků, lze odhadnout pomocí algoritmu maximalizace očekávání [42] . Poté je problém stanovení počtu klonů redukován na výběr statistického modelu, který nejlépe popisuje sekvenační data; hodnocení se provádí pomocí informačních kritérií Bayese a Akaike [43] . Existuje také hybridní přístup, který umožňuje počáteční shlukování pomocí funkce vzdálenosti, což zvyšuje rychlost shlukování založeného na modelu, což vyžaduje velký výpočetní výkon [44] . Na základě výsledků shlukování je sestaven profil konsenzuálních klonálních mutací [45] . Podle něj je možné pomocí různých metod konstrukce stromů identifikovat vztah mezi různými klony. Je například možné prokázat evoluční historii nádoru [45] .

Úspěchy

Klonální evoluce buněk rakoviny prsu

Analýza mutačních vzorců (inzerce, delece, jednonukleotidové substituce, variace počtu kopií genu ) různých populací buněk rakoviny prsu umožnila identifikovat jak sadu mutací charakteristických pro každou z populací (klonální mutace), tak ty, které se vyskytly v několik buněk (subklonální mutace). Data byla získána pomocí jednobuněčného exomového sekvenování, ověřeného hlubokým sekvenováním. Ve studii byly použity buňky aneuploidních populací ERBC (ER + /PR + /Her2 - ) a TNBC (ER - /PR - /Her2 - ), které se liší přítomností určitých receptorů (ER/PR/Her2) na membráně povrch, stejně jako normální diploidní buňky. Výsledkem byla identifikace významně více klonálních mutací v populaci TNBC ve srovnání s ERBC a normálními buňkami. V populaci buněk TNBC byla prokázána existence tří subpopulací rakovinných buněk, identifikovaných vzorci subklonálních mutací. Byly získány důkazy, že TNBC má vyšší rychlost mutací a k jejich akumulaci může dojít nejen v důsledku chyb při zrychlené proliferaci [4] .

Dosud není jasné, jak přesně se nádory stávají odolnými vůči chemoterapii . Buď jsou v populaci již vzácné rezistentní buňky, nebo k reakci dochází spontánně po působení léků. Navíc není vždy jasné, proč se mutace hromadí: buď jde o zrychlenou rychlost mutací, jako v případě TNBC, nebo jde o hromadění mutací normální rychlostí, ale ve velkém množství v důsledku zrychlené proliferace [4]. .

Perspektivy

V tuto chvíli je hlavním problémem přítomnost kroku amplifikace genomové DNA zodpovědného za zavedení největšího počtu artefaktů. Požadavky na množství DNA při přípravě knihoven se stále více snižují a již byla prokázána přímá tvorba knihoven z izolované DNA [46] [47] . Navíc se ukázalo, že je možné se zcela obejít bez knihoven předložením DNA izolované z buňky k sekvenování [48] . Existuje také možnost odhalení epigenetických informací, jako je hledání metylačních vzorců [49] [50] a zachycení konformačního stavu chromozomů [51] . Dnes vědci obvykle pracují na desítkách až stovkách buněk, ale vývoj automatizovaných platforem pro zachycení buněk, amplifikaci DNA a přípravu knihoven výrazně zvýší rozsah a dostupnost analýzy jednotlivých buněk, což umožní provádět větší experimenty v kratším čase. [52] .

Využití jednobuněčného sekvenování DNA spolu s epigenomickými a transkriptomovými studiemi umožní přesnou klasifikaci buněk a doplní stávající pohled na buněčné populace. Bude také možné stanovit vztahy mezi sekvencí genomu, epigenetickým stavem a genovou expresí a určit funkčnost buněk [52] .

Viz také

Poznámky

  1. ↑ Tringe SG , von Mering C. , Kobayashi A. , Salamov AA , Chen K. , Chang HW , Podar M. , Short JM , Mathur EJ , Detter JC , Bork P. , Hugenholtz P. , Rubin EM Srovnávací metagenomika mikrobiální společenství.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 2005. - Sv. 308, č.p. 5721 . - S. 554-557. - doi : 10.1126/science.1107851 . — PMID 15845853 .
  2. ↑ Marcy Y. , Ouverney C. , Bik EM , Lösekann T. , Ivanova N. , Martin HG , Szeto E. , Platt D. , Hugenholtz P. , Relman DA , Quake SR Rozebírání biologické „temné hmoty“ jednobuněčnou genetická analýza vzácných a nekultivovaných mikrobů TM7 z lidských úst.  (anglicky)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - Sv. 104, č.p. 29 . - S. 11889-11894. - doi : 10.1073/pnas.0704662104 . — PMID 17620602 .
  3. ↑ McConnell MJ , Lindberg MR , Brennand KJ , Piper JC , Voet T. , Cowing-Zitron C. , Shumilina S. , Lasken RS , Vermeesch JR , Hall IM , Gage FH Variace počtu kopií mozaiky v lidských neuronech.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 2013. - Sv. 342, č.p. 6158 . - S. 632-637. - doi : 10.1126/science.1243472 . — PMID 24179226 .
  4. ↑ 1 2 3 4 Wang Y. , Waters J. , Leung ML , Unruh A. , Roh W. , Shi X. , Chen K. , Scheet P. , Vattathil S. , Liang H. , Multani A. , Zhang H . , Zhao R. , Michor F. , Meric-Bernstam F. , Navin NE Klonální evoluce u rakoviny prsu odhalená sekvenováním genomu s jedním jádrem.  (anglicky)  // Nature. - 2014. - Sv. 512, č.p. 7513 . - S. 155-160. - doi : 10.1038/příroda13600 . — PMID 25079324 .
  5. ↑ Wen L. , Tang F. Jednobuněčné sekvenování v biologii kmenových buněk.  (anglicky)  // Genome biology. - 2016. - Sv. 17, č. 1 . - S. 71. - doi : 10.1186/s13059-016-0941-0 . — PMID 27083874 .
  6. ↑ Bacher R. , Kendziorski C. Návrh a výpočetní analýza experimentů se sekvenováním jednobuněčné RNA.  (anglicky)  // Genome biology. - 2016. - Sv. 17, č. 1 . - S. 63. - doi : 10.1186/s13059-016-0927-y . — PMID 27052890 .
  7. ↑ Emmert-Buck MR , Bonner RF , Smith PD , Chuaqui RF , Zhuang Z. , Goldstein SR , Weiss RA , Liotta LA Mikrodisekce laserového záchytu.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 1996. - Sv. 274, č.p. 5289 . - S. 998-1001. — PMID 8875945 .
  8. ↑ HAM RG KLONÁLNÍ RŮST BUNĚK SAVCŮ V CHEMICKY DEFINOVANÉM, SYNTETICKÉM MÉDIU.  (anglicky)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1965. - Sv. 53. - S. 288-293. — PMID 14294058 .
  9. ↑ 1 2 3 4 5 Zong C. , Lu S. , Chapman AR , Xie XS Celogenomová detekce variací jednoho nukleotidu a počtu kopií jedné lidské buňky.  (anglicky)  // Věda (New York, NY). - 2012. - Sv. 338, č.p. 6114 . - S. 1622-1626. - doi : 10.1126/science.1229164 . — PMID 23258894 .
  10. ↑ Gole J. , Gore A. , Richards A. , Chiu YJ , Fung HL , Bushman D. , Chiang HI , Chun J. , Lo YH , Zhang K. Masivně paralelní klonování polymerázy a sekvenování genomu jednotlivých buněk pomocí nanolitrových mikrojamek.  (anglicky)  // Přírodní biotechnologie. - 2013. - Sv. 31, č. 12 . - S. 1126-1132. - doi : 10.1038/nbt.2720 . — PMID 24213699 .
  11. ↑ White AK , VanInsberghe M. , Petriv OI , Hamidi M. , Sikorski D. , Marra MA , Piret J. , Aparicio S. , Hansen CL Vysokokapacitní mikrofluidní jednobuněčná RT-qPCR.  (anglicky)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - Sv. 108, č.p. 34 . - S. 13999-14004. - doi : 10.1073/pnas.1019446108 . — PMID 21808033 .
  12. ↑ Macosko EZ , Basu A. , Satija R. , Nemesh J. , Shekhar K. , Goldman M. , Tirosh I. , Bialas AR , Kamitaki N. , Martersteck EM , Trombetta JJ , Weitz DA , Sanes JR , Shalek AK . Regev A. , McCarroll SA Vysoce paralelní profilování exprese v celém genomu jednotlivých buněk pomocí nanolitrových kapiček.  (anglicky)  // Cell. - 2015. - Sv. 161, č.p. 5 . - S. 1202-1214. - doi : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . — PMID 26000488 .
  13. ↑ Thompson AM , Paguirigan AL , Kreutz JE , Radich JP , Chiu DT Microfluidics pro jednobuněčnou genetickou analýzu.  (anglicky)  // Laboratoř na čipu. - 2014. - Sv. 14, č. 17 . - S. 3135-3142. - doi : 10.1039/c4lc00175c . — PMID 24789374 .
  14. ↑ Actis P. , Maalouf MM , Kim HJ , Lohith A. , Vilozny B. , Seger RA , Pourmand N. Kompartmentální genomika v živých buňkách odhalená jednobuněčnou nanobiopsií.  (anglicky)  // ACS nano. - 2014. - Sv. 8, č. 1 . - S. 546-553. doi : 10.1021 / nn405097u . — PMID 24279711 .
  15. ↑ 1 2 3 4 Paez JG , Lin M. , Beroukhim R. , Lee JC , Zhao X. , Richter DJ , Gabriel S. , Herman P. , Sasaki H. , Altshuler D. , Li C. , Meyerson M. , Sellers WR Pokrytí genomu a sekvenční věrnost amplifikace celého genomu na bázi phi29 polymerázy s vytěsněním více vláken.  (anglicky)  // Výzkum nukleových kyselin. - 2004. - Sv. 32, č. 9 . — P. e71. - doi : 10.1093/nar/gnh069 . — PMID 15150323 .
  16. ↑ Ausubel, FM a kol. sv. I., John Wiley & Songs, Inc. AKTUÁLNÍ PROTOKOLY V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII. — 1995.
  17. ↑ 1 2 3 4 Hou Y. , Wu K. , Shi X. , Li F. , Song L. , Wu H. , Dean M. , Li G. , Tsang S. , Jiang R. , Zhang X. , Li B. , Liu G. , Bedekar N. , Lu N. , Xie G. , Liang H. , Chang L. , Wang T. , Chen J. , Li Y. , Zhang X. , Yang H. , Xu X. , Wang L. , Wang J. Srovnání detekce variací mezi celogenomovými amplifikačními metodami používanými při jednobuněčném resekvenování.  (anglicky)  // GigaScience. - 2015. - Sv. 4. - S. 37. - doi : 10.1186/s13742-015-0068-3 . — PMID 26251698 .
  18. ↑ 1 2 3 4 5 Huang L. , Ma F. , Chapman A. , Lu S. , Xie XS Jednobuněčná celogenomová amplifikace a sekvenování: Metodologie a aplikace.  (anglicky)  // Každoroční přehled genomiky a lidské genetiky. - 2015. - Sv. 16. - S. 79-102. - doi : 10.1146/annurev-genom-090413-025352 . — PMID 26077818 .
  19. ↑ Chen M. , Song P. , Zou D. , Hu X. , Zhao S. , Gao S. , Ling F. Porovnání vícenásobného posunutí amplifikace (MDA) a vícenásobného žíhání a cyklů amplifikace na bázi smyčkování (MALBAC) v jednom - sekvenování buněk.  (anglicky)  // Public Library of Science ONE. - 2014. - Sv. 9, č. 12 . - P. e114520. - doi : 10.1371/journal.pone.0114520 . — PMID 25485707 .
  20. ↑ 1 2 3 Gawad C. , Koh W. , Quake SR Sekvenování jednobuněčného genomu: současný stav vědy.  (anglicky)  // Recenze přírody. genetika. - 2016. - Sv. 17, č. 3 . - S. 175-188. - doi : 10.1038/nrg.2015.16 . — PMID 26806412 .
  21. ↑ 1 2 Abecasis GR , Auton A. , Brooks LD , DePristo MA , Durbin RM , Handsaker RE , Kang HM , Marth GT , McVean GA Integrovaná mapa genetických variací z 1 092 lidských genomů.  (anglicky)  // Nature. - 2012. - Sv. 491, č.p. 7422 . - S. 56-65. - doi : 10.1038/příroda11632 . — PMID 23128226 .
  22. ↑ Martin ER , Lai EH , Gilbert JR , Rogala AR , Afshari AJ , Riley J. , Finch KL , Stevens JF , Livak KJ , Slotterbeck BD , Slifer SH , Warren LL , Conneally PM , Schmechel DE , Purica I. Vance MA , Roses AD , Vance JM SNPing pryč u komplexních onemocnění: analýza jednonukleotidových polymorfismů kolem APOE u Alzheimerovy choroby.  (anglicky)  // Americký časopis lidské genetiky. - 2000. - Sv. 67, č.p. 2 . - S. 383-394. - doi : 10.1086/303003 . — PMID 10869235 .
  23. ↑ Zhu Y. , Spitz MR , Lei L. , Mills GB , Wu X. Polymorfismus jednoho nukleotidu v promotoru matrix metaloproteinázy-1 zvyšuje náchylnost k rakovině plic.  (anglicky)  // Cancer research. - 2001. - Sv. 61, č.p. 21 . - S. 7825-7829. — PMID 11691799 .
  24. ↑ 1 2 Schaschl H. , Aitman TJ , Vyse TJ Variace počtu kopií v lidském genomu a jejich implikace v autoimunitě.  (anglicky)  // Klinická a experimentální imunologie. - 2009. - Sv. 156, č.p. 1 . - S. 12-16. - doi : 10.1111/j.1365-2249.2008.03865.x . — PMID 19220326 .
  25. ↑ McKenna A. , Hanna M. , Banks E. , Sivachenko A. , Cibulskis K. , Kernytsky A. , Garimella K. , Altshuler D. , Gabriel S. , Daly M. , DePristo MA The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce rámec pro analýzu dat sekvenování DNA nové generace.  (anglicky)  // Genome research. - 2010. - Sv. 20, č. 9 . - S. 1297-1303. - doi : 10.1101/gr.107524.110 . — PMID 20644199 .
  26. ↑ Zhang J. , Wheeler DA , Yakub I. , Wei S. , Sood R. , Rowe W. , Liu PP , Gibbs RA , Buetow KH SNPdetector: softwarový nástroj pro citlivou a přesnou detekci SNP.  (anglicky)  // Public Library of Science for Computational Biology. - 2005. - Sv. 1, č. 5 . - str. e53. - doi : 10.1371/journal.pcbi.0010053 . — PMID 16261194 .
  27. ↑ Li R. , Li Y. , Fang X. , Yang H. , Wang J. , Kristiansen K. , Wang J. Detekce SNP pro masivně paralelní resekvenování celého genomu.  (anglicky)  // Genome research. - 2009. - Sv. 19, č. 6 . - S. 1124-1132. - doi : 10.1101/gr.088013.108 . — PMID 19420381 .
  28. ↑ Koboldt DC , Chen K. , Wylie T. , Larson DE , McLellan MD , Mardis ER , Weinstock GM , Wilson RK , Ding L. VarScan: detekce variant v masivně paralelním sekvenování jednotlivých a spojených vzorků.  (anglicky)  // Bioinformatika. - 2009. - Sv. 25, č. 17 . - S. 2283-2285. - doi : 10.1093/bioinformatics/btp373 . — PMID 19542151 .
  29. ↑ Redon R. , Ishikawa S. , Fitch KR , Feuk L. , Perry GH , Andrews TD , Fiegler H. , Shapero MH , Carson AR , Chen W. , Cho EK , Dallaire S. , Freeman JL , González JR , Grat M. , Huang J. , Kalaitzopoulos D. , Komura D. , MacDonald JR , Marshall ČR , Mei R. , Montgomery L. , Nishimura K. , Okamura K. , Shen F. , Somerville MJ , Tchinda J. , Valsesia A. . , Woodwark C. , Yang F. , Zhang J. , Zerjal T. , Zhang J. , Armengol L. , Conrad DF , Estivil X. , Tyler-Smith C. , Carter NP , Aburatani H. , Lee C. , Jones KW , Scherer SW , Hurles ME Globální variace v počtu kopií v lidském genomu.  (anglicky)  // Nature. - 2006. - Sv. 444, č.p. 7118 . - S. 444-454. - doi : 10.1038/nature05329 . — PMID 17122850 .
  30. ↑ Zhang F. , Gu W. , Hurles ME , Lupski JR Kopírovat početní variace v lidském zdraví, nemoci a evoluci.  (anglicky)  // Každoroční přehled genomiky a lidské genetiky. - 2009. - Sv. 10. - S. 451-481. - doi : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164217 . — PMID 19715442 .
  31. ↑ Frank B. , Bermejo JL , Hemminki K. , Sutter C. , Wappenschmidt B. , Meindl A. , Kiechle-Bahat M. , Bugert P. , Schmutzler RK , Bartram ČR , Burwinkel B. Varianta čísla kopie v kandidátním nádoru supresorový gen MTUS1 a rodinné riziko rakoviny prsu.  (anglicky)  // Karcinogeneze. - 2007. - Sv. 28, č. 7 . - S. 1442-1445. - doi : 10.1093/carcin/bgm033 . — PMID 17301065 .
  32. ↑ Glessner JT , Wang K. , Cai G. , Korvatska O. , Kim CE , Wood S. , Zhang H. , Estes A. , Brune CW , Bradfield JP , Imielinski M. , Frackelton EC , Reichert J. , Crawford EL , Munson J. , Sleiman PM , Chiavacci R. , Annaiah K. , Thomas K. , Hou C. , Glaberson W. , Flory J. , Otieno F. , Garris M. , Soorya L. , Klei L. , Piven J . , Meyer KJ , Anagnostou E. , Sakurai T. , Game RM , Rudd DS , Zurawiecki D. , McDougle CJ , Davis LK , Miller J. , Posey DJ , Michaels S. , Kolevzon A. , Silverman JM , Bernier R. , Levy SE , Schultz RT , Dawson G. , Owley T. , McMahon WM , Wassink TH , Sweeney JA , Nurnberger JI , Coon H. , Sutcliffe JS , Minshew NJ , Grant SF , Bucan M. , Buxba EH , Buxba JD , Devlin B. , Schellenberg GD , Hakonarson H. Variace počtu kopií v celém genomu autismu odhaluje ubiquitin a neuronální geny.  (anglicky)  // Nature. - 2009. - Sv. 459, č.p. 7246 . - S. 569-573. - doi : 10.1038/nature07953 . — PMID 19404257 .
  33. ↑ Xie C. , Tammi MT CNV-seq, nová metoda pro detekci variace počtu kopií pomocí vysoce výkonného sekvenování.  (anglicky)  // BMC bioinformatika. - 2009. - Sv. 10. - S. 80. - doi : 10.1186/1471-2105-10-80 . — PMID 19267900 .
  34. ↑ Wang K. , Li M. , Hadley D. , Liu R. , Glessner J. , Grant SF , Hakonarson H. , Bucan M. PennCNV: integrovaný skrytý Markovův model určený pro detekci variací počtu kopií s vysokým rozlišením v celém data genotypizace SNP genomu.  (anglicky)  // Genome research. - 2007. - Sv. 17, č. 11 . - S. 1665-1674. - doi : 10.1101/gr.6861907 . — PMID 17921354 .
  35. ↑ Ivakhno S. , Royce T. , Cox AJ , Evers DJ , Cheetham RK , Tavaré S. CNAseg – nový rámec pro identifikaci změn počtu kopií u rakoviny ze sekvenačních dat druhé generace.  (anglicky)  // Bioinformatika. - 2010. - Sv. 26, č. 24 . - S. 3051-3058. - doi : 10.1093/bioinformatics/btq587 . — PMID 20966003 .
  36. ↑ Miller CA , Hampton O. , Coarfa C. , Milosavljevic A. ReadDepth: paralelní balíček R pro detekci změn počtu kopií při čtení krátkých sekvencí.  (anglicky)  // Public Library of Science ONE. - 2011. - Sv. 6, č. 1 . - P. e16327. - doi : 10.1371/journal.pone.0016327 . — PMID 21305028 .
  37. ↑ Klambauer G. , Schwarzbauer K. , Mayr A. , Clevert DA , Mitterecker A. , Bodenhofer U. , Hochreiter S. cn.MOPS: směs Poissonů pro objevování variací počtu kopií v sekvenačních datech nové generace s nízkým počtem falešných objevů hodnotit.  (anglicky)  // Výzkum nukleových kyselin. - 2012. - Sv. 40, č. 9 . — P. e69. - doi : 10.1093/nar/gks003 . — PMID 22302147 .
  38. ↑ Ning L. , Liu G. , Li G. , Hou Y. , Tong Y. , He J. Aktuální výzvy v bioinformatice jednobuněčné genomiky.  (anglicky)  // Hranice v onkologii. - 2014. - Sv. 4. - S. 7. - doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . — PMID 24478987 .
  39. ↑ Eisen MB , Spellman PT , Brown PO , Botstein D. Shluková analýza a zobrazení vzorů exprese v celém genomu.  (anglicky)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1998. - Sv. 95, č.p. 25 . - S. 14863-14868. — PMID 9843981 .
  40. ↑ Prokopenko D. , Hecker J. , Silverman EK , Pagano M. , Nöthen MM , Dina C. , Lange C. , Fier HL Využití Jaccardova indexu k odhalení stratifikace populace v sekvenačních datech: simulační studie a aplikace na 1000 Projekt genomu.  (anglicky)  // Bioinformatika. - 2016. - Sv. 32, č. 9 . - S. 1366-1372. - doi : 10.1093/bioinformatics/btv752 . — PMID 26722118 .
  41. ↑ Greaves M. , Maley C. C. Klonální evoluce u rakoviny.  (anglicky)  // Nature. - 2012. - Sv. 481, č.p. 7381 . - S. 306-313. - doi : 10.1038/příroda10762 . — PMID 22258609 .
  42. ↑ A.P. Dempster; NM Laird; D. B. Rubin. Maximální pravděpodobnost z neúplných dat pomocí algoritmu EM  // Journal of the Royal Statistical Society. Řada B (Metodická). - 1977. - Sv. 39, č. 1 . - S. 1-38. - doi : 10.2307/2984875 . Archivováno z originálu 11. prosince 2015.
  43. ↑ C. Fraley, A. E. Raftery. Kolik klastrů? Která metoda shlukování?  Odpovědi prostřednictvím shlukové analýzy založené na modelu . - 1998. - doi : 10.1093/comjnl/41.8.578 . Archivováno z originálu 22. února 2017.
  44. ↑ Chris Fraley, Adrian E. Raftery. MCLUST: Software pro shlukovou analýzu založenou na modelu  (anglicky)  // Journal of Classification. - 1999. - doi : 10.1007/s003579900058 . Archivováno z originálu 22. července 2017.
  45. ↑ 1 2 Kim KI , Simon R. Použití dat sekvenování jednotlivých buněk k modelování evoluční historie nádoru.  (anglicky)  // BMC bioinformatika. - 2014. - Sv. 15. - S. 27. - doi : 10.1186/1471-2105-15-27 . — PMID 24460695 .
  46. ↑ Falconer E. , Hills M. , Naumann U. , Poon SS , Chavez EA , Sanders AD , Zhao Y. , Hirst M. , Lansdorp PM DNA templátové sekvenování řetězce jednobuněčných buněk mapuje přeuspořádání genomu ve vysokém rozlišení.  (anglicky)  // Přírodní metody. - 2012. - Sv. 9, č. 11 . - S. 1107-1112. - doi : 10.1038/nmeth.2206 . — PMID 23042453 .
  47. ↑ Falconer E. , Lansdorp PM Strand-seq: sjednocující nástroj pro studium segregace chromozomů.  (anglicky)  // Semináře z buněčné a vývojové biologie. - 2013. - Sv. 24, č. 8-9 . - S. 643-652. - doi : 10.1016/j.semcdb.2013.04.005 . — PMID 23665005 .
  48. ↑ Coupland P. , Chandra T. , Quail M. , Reik W. , Swerdlow H. Přímé sekvenování malých genomů na Pacific Biosciences RS bez přípravy knihovny.  (anglicky)  // BioTechniques. - 2012. - Sv. 53, č.p. 6 . - S. 365-372. - doi : 10.2144/000113962 . — PMID 23227987 .
  49. ↑ El Hajj N. , Trapphoff T. , Linke M. , May A. , Hansmann T. , Kuhtz J. , Reifenberg K. , Heinzmann J. , Niemann H. , Daser A. , Eichenlaub-Ritter U. , Zechner U Haaf T. Limitní diluční bisulfitové (pyro)sekvenování odhaluje methylační vzorce specifické pro rodiče v jednotlivých časných myších embryích a oocytech skotu.  (anglicky)  // Epigenetika. - 2011. - Sv. 6, č. 10 . - S. 1176-1188. - doi : 10.4161/epi.6.10.17202 . — PMID 21937882 .
  50. ↑ Guo H. , Zhu P. , Wu X. , Li X. , Wen L. , Tang F. Jednobuněčné methylomové krajiny embryonálních myších embryonálních kmenových buněk a časných embryí analyzované pomocí sekvenování s redukovaným zastoupením bisulfitů.  (anglicky)  // Genome research. - 2013. - Sv. 23, č. 12 . - S. 2126-2135. - doi : 10.1101/gr.161679.113 . — PMID 24179143 .
  51. ↑ Nagano T. , Lubling Y. , Yaffe E. , Wingett SW , Dean W. , Tanay A. , Fraser P. Single-cell Hi-C pro celogenomovou detekci interakcí chromatinu, které se vyskytují současně v jedné buňce.  (anglicky)  // Nature protocols. - 2015. - Sv. 10, č. 12 . - S. 1986-2003. - doi : 10.1038/nprot.2015.127 . — PMID 26540590 .
  52. ↑ 1 2 Macaulay IC , Voet T. Jednobuněčná genomika: pokroky a budoucí perspektivy.  (anglicky)  // genetika PLoS. - 2014. - Sv. 10, č. 1 . — P. e1004126. - doi : 10.1371/journal.pgen.1004126 . — PMID 24497842 .