ADP-ribosylace ( ADP-ribosylace ) je chemická reakce přidání jednoho nebo více zbytků ADP-ribosy k proteinu [1] [2] . Je to reverzibilní posttranslační modifikace , která hraje důležitou roli v mnoha buněčných procesech, jako je signální transdukce , oprava DNA , regulace genové exprese a apoptóza [3] [4] . U některých forem rakoviny byla pozorována nesprávná ADP-ribosylace [5] . Mnoho bakteriálních toxinů , jako je toxin cholery a difterický toxin , ovlivňuje ADP-ribosylaci [6] .
První předpoklady o existenci takové posttranslační modifikace proteinů, jako je ADP-ribosylace, se objevily v 60. letech 20. století. Během této doby Pierre Chambon a spolupracovníci objevili, že ATP je přijímán výtažkem z kuřecích jader [7] . Následné studie ukázaly, že do reakce vstoupila ADP-ribóza, derivát NAD + . O několik let později byl identifikován enzym , který připojuje ADP-ribózu k proteinům, nazývaný poly (ADP-ribóza) polymeráza . Nejprve se mělo za to, že poly-(ADP-ribóza) je lineární řetězec zbytků ADP-ribózy spojených glykosidickými vazbami . Později se ukázalo, že každých 20-30 zbytků se může řetězec větvit [8] .
Mono-ADP-ribosylace byla popsána o několik let později, když bylo zjištěno, že NAD + je nutný k tomu, aby byl difterický toxin aktivní . Toxin je aktivován, když je k němu připojen jeden zbytek ADP-ribózy enzymem mono-ADP-ribosyltransferázou. Zpočátku se mělo za to, že poly-ADP-ribosylace je zapojena pouze do regulace genové exprese. Nicméně, když byly nalezeny nové enzymy provádějící ADP-ribosylaci, stal se zřejmý všestranný funkční význam této modifikace. Ačkoli první známý savčí enzym schopný provádět poly-ADP-ribosylaci byl objeven na konci 80. let 20. století, další savčí proteiny s takovou aktivitou byly popsány až o 15 let později [9] . Koncem 80. let byly také objeveny enzymy ADP-ribosylcykláza, které katalyzují adici cyklické ADP-ribózy na proteiny. Ukázalo se, že proteiny rodiny sirtuinů , které mohou katalyzovat NAD + -dependentní deacetylaci , mají také mono-ADP-ribosyltransferázovou aktivitu [10] [11] .
Zpravidla NAD + slouží jako zdroj ADP-ribózových zbytků . V této přenosové reakci je N-glykosidová vazba v NAD + , která váže ADP-ribózu k nikotinamidové skupině, přerušena, načež vedlejší skupina modifikované aminokyseliny provede nukleofilní útok. ADP-ribosyltransferázy katalyzují dva typy reakcí: mono-ADP-ribosylaci a poly-ADP-ribosylaci.
Mono-ADP-ribosyltransferázy nejčastěji katalyzují adici jediného ADP-ribosového zbytku na argininový postranní řetězec prostřednictvím specifického motivu (RS-EXE). Nejprve se přeruší vazba mezi ADP-ribózou a nikotinamidem za vzniku oxoniového iontu . Argininový postranní řetězec modifikovaného proteinu pak působí jako nukleofil a napadá elektrofilní atom uhlíku vedle oxoniového iontu . Před nukleofilním útokem je arginin deprotonován enzymem zbytkem . Další konzervativní glutamátový zbytek tvoří vodíkovou vazbu s jednou z hydroxylových skupin ribózy , což usnadňuje nukleofilní útok. V důsledku prasknutí vazby se uvolňuje nikotinamid. Modifikace může být odstraněna enzymy ADP-ribosylhydrolázy, které přeruší N-glykosidickou vazbu mezi argininem a ribózou, čímž se uvolní ADP-ribóza a nemodifikovaný protein. Při reverzní reakci však NAD + nevzniká [12] .
Poly(ADP-ribóza)polymerázy ( anglicky Poly-(ADP-ribóza)polymerázy, PARP ) se nacházejí převážně v eukaryotech a katalyzují adici několika ADP-ribózových zbytků k proteinu. Stejně jako u mono-ADP-ribosylace je zdrojem ADP-ribosy NAD + . PARP využívají katalytickou triádu His - Tyr -Glu ke zvýšení vazby na NAD + a připojení sestaveného poly-ADP-ribózového řetězce k proteinu. Glutamátový zbytek usnadňuje tvorbu O-glykosidické vazby mezi dvěma ribózovými zbytky [13] . Existuje několik dalších enzymů, které rozpoznávají poly-ADP-ribózové řetězce, hydrolyzují je nebo tvoří větve. Motivy, které se mohou vázat na poly-ADP-ribózu s různou silou, byly nalezeny ve více než 800 proteinech. Poly-ADP-ribosylace tedy nejen mění strukturu a konformaci proteinu, ale může k němu také přitahovat další proteiny [14] .
Postranní řetězce mnoha aminokyselin mohou působit jako akceptory pro ADP-ribózovou skupinu. Z chemického hlediska je poly-ADP-ribosylace glykosylace : nukleofilní útok nezbytný k vytvoření vazby s ribózou v ADP-ribóze může být proveden atomy kyslíku , dusíku nebo síry postranních řetězců aminokyselin. [15] . Zpočátku se věřilo, že cíle ADP-glykosylace byly glutamátové a aspartátové zbytky . Později se však ukázalo, že serin [16] [17] , arginin [18] , cystein [19] , lysin [20] , diftamid [21] , fosfoserin [22] a asparaginové zbytky mohou také podstoupit ADP-ribosylaci [23] .
PARP se aktivují při poškození DNA nebo buněčném stresu, což zvyšuje množství poly-ADP-ribózy a snižuje množství NAD + [24] . Více než 10 let se věřilo, že jedinou poly-ADP polymerázou v savčích buňkách je PARP1 , proto je ze všech poly-ADP polymeráz tento enzym nejlépe prozkoumaný. Během apoptózy aktivované kaspázy štěpí PARP1 na dva fragmenty, čímž zcela inaktivují enzym a tím omezují tvorbu poly-ADP-ribózy. Jeden z výsledných fragmentů se přesune z jádra do cytoplazmy a, jak se běžně věří, se stane vlastním antigenem . V jiné formě programované buněčné smrti , parthanatóze , dochází k akumulaci poly-ADP-ribózy způsobené aktivací PARP nebo inaktivací poly(ADP-ribóza)glykohydrolázy - enzymu, který hydrolyzuje poly- ADP-ribóza s tvorbou volných ADP-ribóz. Během apoptózy způsobuje poly-ADP-ribóza přesun proteinů do jádra, což spouští fragmentaci DNA . Hyperaktivace PARP vede k nekrotické buněčné smrti regulované tumor nekrotizujícím faktorem . Dosud nejasným mechanismem ovlivňují inhibitory PARP nekroptózu [25] .
ADP-ribosylace může ovlivnit genovou expresi téměř v každém kroku, včetně organizace chromatinu , vazby transkripčního faktoru a zpracování mRNA . PARP1 může ovlivnit strukturu chromatinu zavedením post-translačních modifikací do histonových konců . PARP mohou také ovlivňovat strukturu transkripčních faktorů a jejich vzájemné interakce as promotory . Například mono-ADP-ribosyltransferáza PARP14 ovlivňuje vazbu k promotoru transkripčního faktoru STAT . Jiné ADP-ribosyltransferázy modifikují proteiny, které interagují s mRNA, což může vést k umlčení odpovídajících genů [26] .
PARP se mohou podílet na opravě jedno- a dvouvláknových zlomů v DNA. Například PARP1 se váže na DNA v místě jednovláknového zlomu a začíná syntetizovat poly-ADP-ribózu, která interaguje s proteinem XRCC1 . Rekrutuje do místa zlomu další proteiny podílející se na opravě: polynukleotidovou kinázu , která zpracovává konce DNA během opravy excize bází , a aprataxin , který se podílí na opravě jednořetězcových zlomů a nehomologního spojování konců [27]. .
PARP1 se také podílí na opravách dvouvláknových přerušení, například při nehomologním spojování konců. Pravděpodobně také zpomaluje pohyb replikační vidlice po poškození DNA a podporuje homologní rekombinaci . Je možné, že PARP1 se podílí na opravě dvouřetězcových přerušení společně s PARP3 . O povaze jejich společného jednání existují dvě hypotézy. Za prvé, mohou se vzájemně funkčně nahradit, když dojde ke ztrátě druhé poly-ADP-ribosyltransferázy. Podle jiné hypotézy PARP3 provádí mono-ADP-ribosylaci nebo syntetizuje krátké řetězce z poly-ADP-ribózových zbytků a také aktivuje PARP1, který je doplňuje na dlouhé řetězce [28] .
Hlavním molekulárním mechanismem intracelulární destrukce defektních proteinů je ubiquitin , proteazomový systém. ADP-ribosyltransferáza tankyráza (TNKS) interaguje s regulátorem proteazomu PI31 . Jak bylo ukázáno u Drosophila a lidských buněk , ankyrinová doména TNKS usnadňuje interakci s N-terminálním vazebným motivem a C-terminální doménou HbYX proteinu PI31. Tato interakce podporuje ADP-ribosylaci PI31 PARP domény tankyrázy. Navíc ošetření buněk Drosophila inhibitorem TNKS známým jako XAV939 narušuje funkci 26S podjednotky proteazomu. Navíc poly-ADP-ribosylovaný PI31 již nemůže inhibovat aktivitu a-podjednotek proteazomové podjednotky 20S. Poly-ADP-ribosylace PI31, zprostředkovaná tankyrázou, tedy ovlivňuje fungování proteazomu [29] .
Jak bylo diskutováno výše, PARP1 se podílí na opravě jedno- a dvouvláknových zlomů DNA a také reguluje apoptózu. Z tohoto důvodu jsou buňky se sníženou aktivitou PARP1 náchylné k malignitě . Mnoho dalších PARP také interferuje s tvorbou rakovinných buněk. PARP2 se podílí na opravě DNA, PARP3 reguluje duplikaci centrosomů a tankyráza se podílí na regulaci délky telomer . Úplná inhibice PARP je současně jedním ze současně používaných přístupů v léčbě rakoviny , protože buňky zbavené alespoň jedné PARP rychle umírají. Například inhibice PARP1 v rakovinných buňkách způsobuje jejich smrt v důsledku mnohočetného poškození DNA. PARP14 pravděpodobně souvisí se stupněm agresivity B-buněčných lymfomů [5] .
Bakteriální ADP-ribosylující exotoxiny provádějí kovalentní připojení ADP-ribosového zbytku s NAD + k proteinu infikovaného eukaryotického organismu. Například toxin cholery a jeden z enterotoxinů ADP-ribosylují a-podjednotku heterotrimerních G proteinů . V ADP-ribosylovaném stavu je a-podjednotka neustále aktivní a asociovaná s GTP , proto je cAMP v buňce neustále syntetizován , což stimuluje uvolňování vody a iontů z buněk střevního epitelu . Clostridium botulinum C3-toxin ADP-ribosyluje GTP-vazebné proteiny Rho a Ras , pertusový toxin také provádí ADP-ribosylaci G-proteinů . U difterie je translační elongační faktor EF-2 ADP-ribosylován , což narušuje syntézu proteinů [6] . Kromě těchto bakterií jsou ADP-ribosylující toxiny vylučovány buňkami Pseudomonas aeruginosa ( exotoxin A ) [30] .