Virové vektory jsou nástroje běžně používané molekulárními biology k dodání genetického materiálu do buněk . Tento proces lze provádět uvnitř živého organismu ( in vivo ) nebo v buněčné kultuře ( in vitro ). Viry mají specializované molekulární mechanismy pro efektivní transport svých genomů v buňkách, které infikují. Dodání genů nebo jiného genetického materiálu vektorem se nazývá transdukce a infikované buňky jsou popsány jako transdukované. Molekulární biologové tento mechanismus poprvé použili v 70. letech 20. století. Paul Berg použil modifikovaný SV40 obsahující bakteriofágovou λ DNA k infekci kultivovaných opičích ledvinových buněk [1] .
Kromě jejich použití ve výzkumu molekulární biologie se virové vektory používají pro genovou terapii a vývoj vakcín .
Virové vektory jsou přizpůsobeny jejich specifické aplikaci, ale obvykle sdílejí několik klíčových vlastností.
Virové vektory byly původně vyvinuty jako alternativa k přirozené transfekci DNA pro experimenty molekulární genetiky . Ve srovnání s tradičními metodami, jako je precipitace fosforečnanem vápenatým, může transdukce zajistit, že je infikováno téměř 100 % buněk, aniž by to vážně ovlivnilo životaschopnost buněk. Některé viry se navíc integrují do buněčného genomu a podporují stabilní expresi.
Proteiny kódované geny lze exprimovat pomocí virových vektorů, obvykle ke studiu funkce konkrétního proteinu. Virové vektory, zejména retroviry, stabilně exprimující markerové geny, jako je GFP , jsou široce používány k trvalému značení buněk pro jejich sledování a jejich potomstvo, jako například v xenotransplantačních experimentech , kde jsou buňky infikované in vitro implantovány do hostitelského zvířete.
Vložení genu je levnější než vyřazení genu . To však dává méně spolehlivé výsledky, protože je někdy nespecifický a má mimocílové účinky na jiné geny. Velkou roli hrají také hostitelské zvířecí vektory.
Genová terapie je metoda korekce defektních genů odpovědných za rozvoj onemocnění. V budoucnu může genová terapie poskytnout způsob, jak léčit genetické poruchy , jako je těžká kombinovaná imunodeficience , cystická fibróza nebo dokonce hemofilie A. Vzhledem k tomu, že tato onemocnění jsou výsledkem mutací v sekvenci DNA určitých genů, studie genové terapie používaly viry k dopravit kopie těchto genů divokého typu do buněk pacientova těla. Genová terapie zaznamenala obrovský úspěch v laboratoři. Než však bude virová genová terapie široce používána, musí být překonáno několik problémů. Imunitní reakce na viry nejen brání doručení genů do cílových buněk, ale může pacientovi způsobit vážné komplikace. V jedné z prvních studií genové terapie v roce 1999 to vedlo ke smrti Jesse Gelsingera , který byl léčen adenovirovým vektorem. [2]
Některé virové vektory, jako jsou gama retroviry, vkládají své genomy do zdánlivě náhodného umístění na jednom z chromozomů hostitele , což může narušit funkci buněčných genů a vést k rakovině. V roce 2002 se ve studii těžké kombinované imunodeficientní retrovirové genové terapie u čtyř pacientů v důsledku léčby vyvinula leukémie; [3] tři pacienti se po chemoterapii uzdravili. [4] Vektory založené na adeno-asociovaných virech jsou v tomto ohledu mnohem bezpečnější, protože se vždy integrují na stejné místo v lidském genomu a používají se při různých poruchách, jako je Alzheimerova choroba [5] .
Viry exprimující patogenní proteiny jsou v současné době vyvíjeny jako vakcíny proti těmto patogenům na stejném principu jako DNA vakcíny . T-lymfocyty rozpoznávají buňky infikované intracelulárními parazity na základě cizích proteinů produkovaných v buňce. Imunita T buněk je rozhodující pro ochranu před virovými infekcemi a nemocemi, jako je malárie . Virová vakcína indukuje expresi patogenních proteinů v hostitelských buňkách podobným způsobem jako Sabinova vakcína proti dětské obrně a další oslabené vakcíny. Protože však virové vakcíny obsahují pouze malý zlomek genů patogenu, jsou mnohem bezpečnější a sporadická infekce patogenem není možná.
V 21. století se aktivně vyvíjejí vakcíny založené na adenovirových vektorech [6] .
Retroviry jsou jedním ze základů moderních přístupů genové terapie. Rekombinantní retroviry, jako je Moloneyho virus myší leukémie, jsou schopny se stabilně integrovat do hostitelského genomu. Obsahují reverzní transkriptázu pro vytvoření DNA kopie RNA genomu a integrázu, která umožňuje integraci do hostitelského genomu . Byly použity v řadě klinických studií schválených FDA, jako je studie SCID-X1 [7] .
Retrovirové vektory mohou být buď replikačně kompetentní, nebo replikačně defektní. Replikačně deficitní vektory jsou ve výzkumu nejběžnější volbou, protože viry mají kódující oblasti pro geny potřebné pro další kola replikace a balení virionů nahrazené jinými geny nebo odstraněny. Tyto viry jsou schopny infikovat cílové buňky a doručit virovou nálož, ale pak nemohou pokračovat v typické lytické dráze, která vede k lýze a smrti buňky.
Naopak replikačně kompetentní virové vektory obsahují všechny potřebné geny pro syntézu virionů a pokračují v proliferaci, jakmile dojde k infekci. Protože virový genom pro tyto vektory je mnohem delší, délka aktuálně vloženého požadovaného genu je omezena ve srovnání s možnou délkou inzertu pro replikačně defektní vektory. V závislosti na virovém vektoru je typická maximální délka platného DNA inzertu v replikačně defektním virovém vektoru typicky kolem 8-10 kB. [8] Ačkoli to omezuje zavedení mnoha genomových sekvencí, většina sekvencí cDNA může být stále přizpůsobena.
Hlavní nevýhodou použití retrovirů, jako je retrovirus Moloney, je potřeba aktivního buněčného dělení pro transdukci . V důsledku toho jsou buňky, jako jsou neurony , vysoce odolné vůči infekci a transdukci retroviry.
Existuje obava, že inzerční mutageneze v důsledku integrace do hostitelského genomu může vést k rakovině nebo leukémii . Tento problém zůstal teoretický, dokud genová terapie u deseti pacientů s SCID-X1 pomocí Maloneyho myšího leukemického viru [9] nevedla ke dvěma případům leukémie způsobené aktivací onkogenu LMO2 v důsledku těsné integrace vektoru. [deset]
Lentiviry jsou podtřídou retrovirů. Někdy se používají jako vektory pro genovou terapii kvůli jejich schopnosti integrovat se do genomu nedělících se buněk, což je jedinečné pro lentiviry, protože jiné retroviry mohou infikovat pouze dělící se buňky. Virový genom ve formě RNA prochází reverzní transkripcí , když virus vstoupí do buňky, aby produkoval DNA , která je pak vložena do genomu na náhodné pozici (nedávné poznatky ve skutečnosti naznačují, že vložení virové DNA není náhodné, ale je zaměřena na specifické aktivní geny a je spojena s organizací genomu [11] ) pomocí virového enzymu integrázy . Vektor, nyní nazývaný provirus , zůstává v genomu a je předán potomstvu buňky, když se dělí. Místo integrace je nepředvídatelné, což může způsobit problém. Provirus může narušit funkci buněčných genů a vést k aktivaci rakovinotvorných onkogenů , což vyvolává obavy z možného použití lentivirů v genové terapii. Studie však ukázaly, že lentivirové vektory mají menší tendenci se integrovat v místech, která mohou způsobit rakovinu, než gama-retrovirové vektory. [12] Konkrétněji jedna studie prokázala, že lentivirové vektory nezpůsobily ani zvýšení výskytu nádorů, ani dřívější nástup nádorů u myší s výrazně vyšším výskytem nádorů. [13] Kromě toho nebyl v klinických studiích s použitím lentivirových vektorů k dodání genové terapie pro léčbu HIV pozorován žádný nárůst mutagenních nebo onkologických příhod.
Z bezpečnostních důvodů lentivirové vektory nikdy nenesou geny nezbytné pro jejich replikaci. K získání lentiviru se několik plazmidů transfekuje do tzv. pakážovací buněčné linie, obvykle HEK293 . Jeden nebo více plazmidů, běžně označovaných jako sbalovací plazmidy, kóduje virionové proteiny , jako je kapsid a reverzní transkriptáza . Druhý plazmid obsahuje genetický materiál, který bude dodán vektorem. Je transkribován tak, aby produkoval genom virové jednořetězcové RNA a vyznačuje se přítomností sekvence ψ (psi). Tato sekvence se používá k zabalení genomu do virionu.
Na rozdíl od lentivirů se adenovirová DNA neintegruje do genomu a nereplikuje se během buněčného dělení. To omezuje jejich použití v základním výzkumu, ačkoli adenovirové vektory se stále používají v experimentech in vitro i in vivo . [14] Jejich hlavní využití je v genové terapii a očkování [15] [16] . Takto se lidský adenovirus používá pro vakcínu Sputnik V. Vzhledem k tomu, že lidé běžně přicházejí do styku s adenoviry , které způsobují respirační, gastrointestinální a oční infekce, většina pacientů si již vytvořila neutralizační protilátky, které dokážou virus inaktivovat dříve, než se dostane do cílové buňky. K překonání tohoto problému vědci v současné době zkoumají adenoviry , které infikují různé druhy, vůči nimž lidé nemají imunitu.
Adeno-asociovaný virus (AAV) je malý virus, který infikuje lidi a některé další druhy primátů. V současnosti je známo, že AAV nezpůsobuje onemocnění a vyvolává velmi slabou imunitní odpověď. AAV může infikovat dělící se i nedělící se buňky a může začlenit svůj genom do genomu hostitelské buňky. Navíc AAV většinou zůstává epizomální (replikace bez zahrnutí do chromozomu); naplňující dlouhý a stabilní výraz. [17] Tyto vlastnosti činí z AAV velmi atraktivního kandidáta pro vývoj virových vektorů pro genovou terapii. [1] AAV však může přinést pouze 5 KB, což je výrazně méně než původní kapacita AAV. [17]
Navíc, kvůli jeho potenciálnímu použití jako vektoru pro genovou terapii, vědci vytvořili pozměněný AAV nazývaný self-supplementing adeno-associated virus (scAAV). Zatímco AAV sbaluje jeden řetězec DNA a vyžaduje proces syntézy druhého řetězce, scAAV sbaluje oba řetězce, které jsou spojeny dohromady za vzniku dvouřetězcové DNA. Vynecháním syntézy druhého vlákna umožňuje scAAV rychlou expresi v buňce. [18] Jinak scAAV sdílí mnoho charakteristik svého protějšku AAV.
Hybridní vektory jsou vektorové viry , které jsou geneticky upraveny tak, aby měly vlastnosti více než jednoho vektoru. Viry jsou modifikovány, aby se vyhnuly nedostatkům typických virových vektorů, které mohou mít omezenou kapacitu, imunogenicitu, genotoxicitu a nemusí podporovat dlouhodobou adekvátní expresi transgenu . Nahrazením nežádoucích prvků žádoucími schopnostmi mohou hybridní vektory v budoucnu překonat standardní transfekční vektory z hlediska bezpečnosti a terapeutické účinnosti. [19]
Volba virového vektoru pro dodání genetického materiálu do buněk je spojena s některými logistickými problémy. Existuje omezený počet virových vektorů dostupných pro terapeutické použití. Jakýkoli z těchto několika virových vektorů může vyvolat imunitní reakci hostitele, pokud je vektor považován za cizího vetřelce. [20] [21] Jakmile je virový vektor jednou použit, nemůže být znovu účinně použit u pacienta, protože jej tělo rozpozná. Pokud vakcína nebo genová terapie selže v klinických studiích , nemůže být virus v budoucnu znovu použit u pacienta pro jinou vakcínu nebo genovou terapii. U pacienta může být také přítomna již existující imunita proti virovému vektoru, což činí terapii pro tohoto pacienta neúčinnou. [20] [22] Je možné čelit již existující imunitě při použití virového vektoru pro vakcinaci primingem nevirovou DNA vakcínou , ale tato metoda představuje další problém a překážku v procesu distribuce vakcíny. [23] Stávající imunitu lze také zpochybnit zvýšením dávky vakcíny nebo změnou cesty očkování . [24] Některé nevýhody virových vektorů (jako je genotoxicita a nízká exprese transgenu) lze překonat použitím hybridních vektorů.