Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je diagnostika genetických onemocnění u lidského embrya před implantací do děložní sliznice, tedy před těhotenstvím. Obvykle se pro analýzu provádí biopsie jedné blastomery v embryu ve fázi rozdrcení (4-10 blastomer). U mateřského nosiče genetické patologie je možná biopsie 1. a 2. polárního tělíska vajíčka před oplodněním. V posledních letech se projevuje trend přechodu k biopsii trofektodermu (vnější vrstvy buněk) ve fázi blastocysty (pátý den vývoje embrya) [1] . Preimplantační genetická diagnostika je považována za alternativu k prenatální diagnostice . Jeho hlavní výhodou je, že při jeho užívání nedochází k selektivnímu ukončení těhotenství a pravděpodobnost narození dítěte bez diagnostikovaného genetického onemocnění je poměrně vysoká. PGD je tedy dalším postupem k technologiím asistované reprodukce a vyžaduje oplodnění in vitro (IVF) . ( anglický obsah )
Myšlenka preimplantační genetické diagnostiky se objevila ještě před narozením prvního IVF dítěte. V roce 1967 byl publikován článek R. Edwardse ( RG Edwards ) a R. Gardnera ( RL Gardner ) o biopsii králičích embryí k určení pohlaví před implantací, ve kterém autoři předpověděli vznik podobných technologií u lidí [2]. . Preimplantační genetická diagnostika u lidí však byla možná až na počátku 90. let, kdy bylo dosaženo dostatečné technologické úrovně in vitro fertilizace a byla vyvinuta polymerázová řetězová reakce , která umožňuje analýzu DNA v jednotlivých buňkách.
V roce 1989 byl učiněn první úspěšný pokus o určení pohlaví pomocí PCR analýzy blastomery odebrané z embrya ve stádiu štěpení (6–8 blastomer) [3] . První úspěšný porod po podobném postupu u párů s rizikem recesivní X-vázané choroby proběhl v roce 1990 [4] .
V roce 1990 bylo diagnostikováno monogenní onemocnění před oplodněním, technika zahrnovala PCR analýzu polárních tělísek vajíčka [5] .
K prvnímu porodu dítěte po preimplantační PCR diagnóze monogenního onemocnění ( cystická fibróza ) došlo v roce 1992 [6] .
Následně se k určení pohlaví embrya a také chromozomálních abnormalit začala používat metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Od roku 2012 je metoda FISH pro detekci chromozomálních abnormalit postupně nahrazována komparativní genomickou hybridizací. Metoda PCR zůstala nepostradatelná pro diagnostiku monogenních onemocnění.
Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je indikována u párů, které jsou přenašeči chromozomální přestavby nebo monogenního onemocnění. Příklady monogenních onemocnění jsou cystická fibróza , Tay-Sachsova choroba , srpkovitá anémie , hemofilie A, Duchennova myodystrofie a mnoho dalších.
Navíc se PGD provádí u párů se zvýšeným rizikem vrozených anomálií u dětí, které není spojeno s nosičstvím diagnostikovaných mutací. Mezi takové případy patří páry, kde je věk matky starší 35 let; pokud je věk otce vyšší než 39 let; pokud má otec závažné poruchy spermatogeneze; u párů s obvyklým potratem; u párů s opakovanými neúspěšnými pokusy o IVF.
V případě neurčeného zvýšeného rizika narození dítěte s vrozenými anomáliemi se PGD provádí pro devět chromozomů, které jsou spojeny s nejčastějšími vrozenými chorobami. Jedná se o chromozom 13 ( Patauův syndrom ), chromozom 15 ( syndrom Prader-Willi ), chromozom 16, chromozom 17, chromozom 18 ( Edwardsův syndrom ), chromozom 21 ( Downův syndrom ), chromozom 22 ( syndrom kočičích zornic ), jakož i pohlaví chromozomy X a Y (různé numerické anomálie, včetně Shereshevsky-Turnerova syndromu a Klinefelterova syndromu ).
PGD se provádí v některých případech, které nesouvisí s možnou genetickou patologií plodu, účelem takové diagnózy je narození dítěte s určitými genetickými vlastnostmi. Mezi takové případy patří například PGD, prováděná s cílem zabránit konfliktu Rhesus .
Existují případy, kdy se PGD provádí na jedné nebo více buňkách odebraných z biopsie z preimplantačních embryí za účelem testování kompatibility pro lidské leukocytární antigeny (HLA). Cílem zákroku je zahájit těhotenství, ve kterém je plod HLA kompatibilní s postiženým sourozencem, který potřebuje transplantaci krvetvorných buněk. [7] [8] Jedním takovým příkladem je případ, kdy se HLA kompatibilní dárce narodil pomocí PGD pro buněčnou terapii Fanconiho anémie u probanda [9] . V tomto případě byla vyloučena Fanconiho anémie a zvolen požadovaný typ histokompatibility . V Rusku byl popsán klinický případ 6,9leté dívky se selháním kostní dřeně, pro jejíž léčbu se narodil HLA-identický zdravý dárce. Léčba byla úspěšná pro příjemce a bezbolestná pro dárce. [deset]
Preimplantační diagnostika je možná pouze v rámci léčebného cyklu IVF .
Na rozdíl od konvenčního IVF, při kterém se do vajíčka přidává velké množství spermií, se před preimplantační diagnózou oplodnění provádí pomocí intraplazmatické injekce spermie ( ICSI ), to znamená, že spermie je do vajíčka vpravena „ručně“ pomocí mikrochirurgických nástrojů. Procedura ICSI je nutná z toho důvodu, že při odběru polárních tělísek nebo blastomer hrozí, že se genetický materiál spermie, která se nepodílela na oplodnění, dostane do analýzy společně s buňkou embrya.
Příprava na léčebný cyklus a samotný léčebný cyklus IVF s PGD se prakticky neliší od běžného léčebného cyklu IVF:
Pokud je genetická porucha zděděna od ženy, pak lze „zdravá“ embrya vybrat testováním pouze polárních těl, aniž by se dotklo samotného embrya. Je také možné testovat pouze blastomery. Nebo sekvenční studium polárních těles, pak lze provést blastomery.
Které schéma PGD bude použito pro každý konkrétní případ, se určí po konzultaci s genetikem nebo speciálně vyškoleným konzultantem PGD při plánování PGD.
Při prvním dělení meiózy se dělí oocyt 1. řádu, čímž vzniká oocyt 2. řádu a malé první redukční tělísko (obě buňky s haploidní sadou chromozomů). Při druhém dělení meiózy v důsledku dělení oocytu 2. řádu vzniká jedno vajíčko a druhé redukční tělísko. První redukční těleso se někdy také dělí na dvě stejné malé buňky. V důsledku těchto přeměn oocytu 1. řádu vzniká jedno vajíčko a tři redukční tělíska, kde vajíčko i redukční tělíska mají haploidní sadu chromozomů. Lze tedy zkoumat polární tělesa, aby se zjistilo, zda vejce zdědilo genetickou vadu.Po oplození vajíček spermiemi v podmínkách embryologické laboratoře se embryo vyvíjí - buňky se dělí. Třetí den se embryo skládá z 6-8 blastomer. A třetí den se odebírá biologický materiál na genetický výzkum – tzv. „biopsii embrya“, tedy extrakci jedné blastomery (a někdy i polárních tělísek) z embrya pomocí speciálních mikronástrojů. Zákrok nezasahuje do dalšího vývoje embrya. Zatímco se provádí genetická diagnostika, embrya se dále vyvíjejí ve vhodném kultivačním médiu až do přenosu do děložní dutiny 5. den vývoje. Do této doby by embryo mělo dosáhnout stadia blastocysty.
Před transferem embryolog zhodnotí strukturu a tvar embryí. Výsledek genetické diagnostiky je porovnán s morfologií embryí a je učiněn závěr o tom, která embrya jsou doporučena k transferu do dělohy. K transferu jsou vybírána embrya s nejlepšími morfologickými charakteristikami bez genetických poruch.
Analýza se provádí ve velmi krátkém čase. Pro analýzu blastomer jsou k dispozici pouze 2 dny, protože embryo nemůže pokračovat ve svém vývoji mimo tělo matky po stádiu blastocysty (5. den po oplodnění), takže studie musí být provedena během této krátké doby.
Alternativním přístupem je provedení PGD v kryocyklu. V tomto případě se 5. den vývoje provádí biopsie a bezprostředně po ní jsou embrya podrobena kryokonzervaci . V dalším měsíci se provádí genetická diagnostika a doporučená embrya bez mutací se v dalším cyklu přenesou do dělohy. Praxe odpojeného cyklu má řadu výhod: menší riziko hyperstimulace , více materiálu a času na analýzu, méně traumatizující postup biopsie embrya. Nevýhodou kryocyklu je delší doba od zahájení stimulace do přenosu embrya [1] .
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) je metoda cytogenetické analýzy používaná k identifikaci a lokalizaci specifických sekvencí DNA na metafázových chromozomech a v interfázových jádrech . Tato metoda využívá sondy DNA , což jsou nukleotidové sekvence s omezenou velikostí, které jsou komplementární ke specifické oblasti jaderné DNA. Sonda nese "tag", to znamená, že obsahuje nukleotidy spojené s fluoroforem (molekula schopná fluorescence). Po hybridizační proceduře lze v případě tvorby hybridní molekuly DNA sondy a cílové DNA na studovaném cytogenetickém preparátu pozorovat záři specifických sekvencí DNA na chromozomech nebo v jádrech pomocí fluorescenčního mikroskopu .
Polymerázová řetězová reakce je metoda založená na mnohonásobném selektivním kopírování určité oblasti DNA pomocí enzymů za umělých podmínek ( in vitro ). V tomto případě se zkopíruje pouze oblast, která splňuje zadané podmínky, a to pouze v případě, že je přítomna ve zkoumaném vzorku.
Schopnost diagnostiky před těhotenstvím je hlavní výhodou PGD. Taková diagnóza minimalizuje riziko, že vývoj plodu bude muset být z genetických důvodů přerušen. Navíc se v cyklu IVF-PGD obvykle získá několik embryí, což umožňuje vybrat embryo bez genetické poruchy. Nevýhodou PGD je nutnost podstoupit léčebný cyklus IVF a poměrně vysoká cena. Výhody PGD a zkušenosti na různých klinikách po celém světě však dokazují účinnost této technologie. PGD dnes poskytuje pacientům s dědičnou patologií alternativní způsob, jak snížit riziko otěhotnění s nemocným plodem a narození dítěte s genetickým onemocněním. Je třeba vzít v úvahu, že PGD nemůže být úplnou náhradou prenatální diagnostiky. Vzhledem k závažnosti dědičné patologie, která je kontrolována při PGD a prenatální diagnostice, je nutné aplikovat všechny metody výzkumu a konfirmační diagnostiky k vyloučení genetického defektu.
Kuliev, A., Rechitsky, S., & Simpson, JL (2020). Praktické preimplantační genetické testování. Archivováno 12. července 2020 ve Wayback Machine Springer Nature. Online ISBN 978-3-030-43157-0 Archivováno 12. července 2020 na Wayback Machine