IRES ( Eng. Internal Ribosome Entry Site - místo vnitřního přistání ribozomu ) - regulační místo mRNA eukaryot a jejich virů , které zajišťuje na čepičce nezávislou nebo vnitřní iniciaci translace . S tímto iniciačním mechanismem se ribozom váže na mRNA přímo v oblasti IRES, která se nejčastěji nachází v 5'-nepřekládané oblasti (5'-UTR) poblíž místa iniciace translace , čímž se obchází fáze rozpoznání čepice a skenování [1] .
Do roku 2016 bylo popsáno více než 80 buněčných (v kvasinkách , rostlinách a dalších vyšších eukaryotech ) a 56 virových IRES. IRES byly nalezeny u členů následujících rodin virů: pikornaviry , flaviviry , dicystroviry a lentiviry [2] . Navíc byla nedávno prokázána možnost eukaryotického viru IRES-dependentní translace v bakteriálních buňkách [3] .
Vnitřní místa vstupu ribozomů byla objevena v mRNA polioviru a viru encefalomyokarditidy v roce 1988 skupinami N. Sonenberg [4] a E. Wimmer [5] . Zjistili, že v molekule RNA jsou místa, která mohou vázat ribozomy, a tím zahájit translaci. Ukázalo se, že pokud je IRES umístěn mezi dva reportérové geny v mRNA, pak bude exprimován i druhý (3'-terminální) cistron . Použití této metody (tzv. metoda bicistronických konstruktů) však může vést k řadě artefaktů spojených se sestřihem a potenciální promotorovou aktivitou vnitřních míst přistání ribozomů [6] .
Všechny IRES pikornavirů se vyznačují přítomností motivu GRNA v centrální doméně, který zajišťuje vytvoření čtyřsmyčkové konformace , a také malé oblasti bohaté na pyrimidiny , která se nachází 20–25 nukleotidů proti směru AUG kodon . IRES flavivirů obsahuje 4 domény, označené I-IV, a v IRES viru hepatitidy C (HCV), typickém představiteli IRES této skupiny virů, se sekvence nezbytné pro aktivitu IRES nacházejí mezi domény II, III a IV a zachycují prvních 30 nukleotidů čtení otevřeného rámce počínaje startovacím kodonem AUG. Sekundární struktura HCV IRES byla rozsáhle studována. Konkrétně bylo zjištěno, že doména II je vlásenka dlouhá 75 nukleotidů se třemi vnitřními a jednou koncovou smyčkou a že doména III má nejsložitější sekundární strukturu , která zahrnuje několik šroubovic a vlásenek. Sekundární a terciární struktura IRES dicystrovirů je poměrně konzervovaná a zahrnuje 3 odlišné domény, z nichž každá obsahuje pseudouzel . IRES byly identifikovány téměř u všech členů rodiny lentivirů (včetně viru lidské imunodeficience ) a jejich IRES se nacházejí nejen v 5'-UTR, ale také v kódující oblasti , kde se podílejí na expresi některých izoformy hlavního strukturního polyproteinu Gag [2] .
Struktury eukaryotických IRES jsou velmi rozmanité a nebyly identifikovány žádné konzervované sekvence nebo motivy . V některých případech musí být IRES stabilní struktury v mRNA, aby fungovaly efektivně, zatímco v jiných naopak příliš rigidní struktura IRES iniciaci translace inhibuje. Bylo navrženo, že IRES nejsou pevně fixované struktury a jsou schopné přeskupení, které reguluje jejich aktivitu. IRES může také způsobit tvorbu různých proteinových izoforem, čímž dále rozšiřuje počet možných proteinových produktů odvozených z jednoho genu [7] .
IRES se nacházejí v 5'-nepřeložených oblastech virových genomických mRNA a umožňují jejich translaci nezávisle na čepičce. Řada buněčných mRNA také obsahuje IRES [8] .
V buňkách jsou IRES zodpovědné za přistání ribozomů na přepisech s čepičkou i bez čepičky v případech, kdy je iniciace translace závislá na čepičce inhibována (ve stresu , v určité fázi buněčného cyklu nebo během apoptózy ), a tak zajistit nepřetržitou syntéza potřebných bílkovin . Řada genů, jejichž mRNA obsahují IRES – c-Myc , APAF1 , Bcl-2 – je za normálních podmínek málo exprimována, ale v určitých situacích může jejich exprese významně vzrůst v důsledku translace závislé na IRES. Předpokládá se, že IRES se může také podílet na udržování nízké úrovně translace řady mRNA za normálních podmínek vazbou ribozomů a zabráněním jejich připojení k hlavním iniciačním místům. Tento mechanismus vnitřní iniciace je v současnosti málo pochopen, ale je zřejmé, že účinnost IRES je vysoce závislá na transregulačních proteinových faktorech, které zajišťují jemnou regulaci IRES-dependentní translace na úrovni jednotlivých buněk [1] .
Struktury v 5'-UTR mohou ovlivňovat aktivitu IRES a tento vliv může být zprostředkován jak interakcemi s různými transregulačními faktory, tak přímo s ribozomy. Příklady genů, jejichž IRES jsou pod kontrolou trans-regulačních proteinů, jsou protoonkogeny Myc zapojené do regulace buněčné proliferace [9] . Translace těchto mRNA závislá na IRES vyžaduje speciální translační faktory ITAF ( IRES trans-acting factor ), které působí jako chaperony RNA a nutí ji přijmout správnou konformaci vhodnou pro vazbu na podjednotku 40S ribozomu [10] .
Přítomnost IRES mezi AUG a jinými startovacími kodony (jinými než AUG) naznačuje možnou roli IRES při iniciaci translace ze slabých nestandardních startovacích kodonů. IRES může také interagovat s krátkými čtecími rámci ( uORF ). K prokázání existence IRES ve struktuře RNA nestačí analyzovat její sekvenci – všechny předpoklady musí být potvrzeny experimentálními daty [7] .
X-vázaný inhibitor apoptózy ( X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP ) hraje důležitou roli v regulaci apoptózy , takže jeho syntéza musí být přesně řízena. 5'-UTR mRNA XIAP je dlouhý 1700 nukleotidů a obsahuje IRES, který usnadňuje syntézu XIAP ve stresu. Kromě popsané XIAP mRNA produkuje alternativní sestřih mRNA s kratší 5'-UTR o 323 nukleotidech a bez IRES. Množství XIAP mRNAs krátkým 5'-UTR v buňkách je 10krát větší než s dlouhým. Bylo zjištěno, že mRNA s krátkým 5'-UTR je zodpovědná za syntézu XIAP za normálních podmínek a je překládána mechanismem závislým na čepičce, zatímco mRNA s dlouhým 5'-UTR poskytuje syntézu XIAP za stresových podmínek. Kombinace alternativních 5'-UTR a mechanismů iniciace translace tedy zajišťuje konstantní expresi XIAP za jakýchkoli podmínek [7] .
Dalším příkladem kontroly genové exprese prostřednictvím různých prvků 5'-UTR je gen pro lidský fibroblastový růstový faktor 2 ( fibroblastový růstový faktor 2, FGF-2 ) . FGF-2 je exprimován v 5 různých izoformách vyplývajících z použití alternativních start kodonů v 5'-UTR a translace jeho mRNA může probíhat nejen v závislosti na čepičce, ale také v závislosti na IRES. Je zajímavé, že translace ze čtyř z pěti startovacích kodonů je zprostředkována IRES. Předpokládá se, že IRES usnadňuje translaci z každého z těchto čtyř kodonů prostřednictvím modulace struktury mRNA transaktivačními faktory [7] .
U mnoha RNA virů dochází k iniciaci translace mechanismem nezávislým na čepičce za účasti IRES lokalizovaného v 5'-UTR [11] . K tomu dochází například u virů HIV, hepatitidy A a C [12] . Tento mechanismus iniciace translace je vhodný, protože v jeho případě není potřeba sestavovat preiniciátorový proteinový komplex a virus se může rychle množit [13] .
Některé virové mRNA mají kovalentně vázaný protein ( VPg ) na 5'-konci , takže použití iniciace závislé na čepičce je u nich vyloučeno. HCV IRES tvoří komplex s podjednotkou 40S ribozomu a rekrutuje translační faktor hostitelské buňky eIF3 [7] . IRES mnoha pikornavirů neváže 40S přímo, ale činí tak prostřednictvím iniciačního faktoru eIF4G, jehož vysoce afinitní vazebné místo se nachází v IRES [14] . U mnoha virů (například pikornaviry) samotné kanonické iniciační faktory translace k iniciaci závislé na IRES nestačí: vyžadují také speciální faktory zvané ITAF [15] . V závislosti na charakteristikách sekundární struktury a potřebě určitých translačních faktorů se IRES v rámci jednotlivých rodin virů dělí do různých tříd [16] . Například IRES pikornavirů je rozdělen do 4 tříd (I-IV) [17] .
Virový RNA genom může obsahovat více než jeden IRES. Například virus kriketové paralýzy , který je členem rodiny dicystrovirů , má RNA genom se dvěma IRES, z nichž jeden je lokalizován v 5'-UTR a druhý v intergenové oblasti . . Ukázalo se, že fungování těchto prvků je odlišné: IRES umístěný v 5'-UTR iniciuje translaci ve všech fázích virové infekce , zatímco IRES umístěný v intergenové oblasti je většinu času potlačený a je aktivován pouze 2– 3 hodiny po infekci. Časové odpojení dvou IRES je účinnou virovou strategií pro expresi určitých proteinů během dobře definované fáze infekce [18] .
Protože IRES hrají kritickou roli v regulaci řady genů, vedou mutace ovlivňující IRES k rozvoji různých onemocnění. Mezi taková onemocnění u lidí patří zejména X -vázaná choroba Charcot -Marie-Tooth , mnohočetný myelom a syndrom fragilního X [19] .
Virové IRES mohou být cíleny mnoha antivirovými léky . V současné době se vyvíjejí léky, které přímo ničí strukturu IRES nebo interferují s interakcí IRES s ribozomovými nebo proteinovými faktory, jako jsou faktory iniciace translace. Zejména IRES viru hepatitidy C, vzhledem ke svému konzervatismu mezi vzorky nalezenými na klinice, může být cílem léků, které blokují translaci tohoto viru [20] . Antisense oligonukleotidy , peptidonukleové kyseliny (RNA), uzavřené nukleové kyseliny (LNA), morfolinové oligonukleotidy , krátké vlásenkové RNA , RNA aptamery , ribozymy , deoxyribozymy , peptidy a malé molekuly [21] . Bylo prokázáno, že inhibitor Janus kinázy 2 AZD1480 je schopen potlačit reprodukci viru hepatitidy A blokováním jeho IRES-dependentní translace [22] . Apigenin , lék používaný při léčbě slintavky a kulhavky, potlačuje rozvoj virové infekce narušením IRES-dependentní translace viru slintavky a kulhavky [23] . Životní cyklus enterovirů je účinně inhibován protirakovinným lékem idarubicinem , který se váže na IRES [24] .
Zvláště zajímavé jsou onkolytické viry , jejichž životní cyklus závisí na IRES, v souvislosti s jejich možným využitím v protinádorové terapii [25] .
IRES našel široké uplatnění při navrhování vektorů pro genovou terapii . Lokalizací IRES v 5'-UTR mRNA požadovaných genů lze dosáhnout jejich koordinované exprese. V takových případech se nejčastěji používá virus encefalomyokarditidy IRES [26] .
Pro testování, zda daná sekvence RNA má vlastnosti IRES, lze použít následující metodu. Je vytvořena bicistronní eukaryotická mRNA, ve které je studovaná sekvence umístěna mezi dvěma reportérovými otevřenými čtecími rámci . Otevřený rámec umístěný před studovanou sekvencí bude přeložen na protein mechanismem závislým na čepičce. Pokud má studovaná sekvence vlastnosti IRES, pak se v buňce bude akumulovat i protein odpovídající druhému otevřenému rámci [6] .
Webové servery byly vyvinuty k predikci přítomnosti IRES ve virových RNA (VIPS) nebo ve virových a buněčných RNA (IRESPred) [27] .
V roce 2016 byl navržen algoritmus RNAiFold2T pro vývoj specifických RNA teploměrů obsahujících IRES. Translace nezávislých na čepičce takových prvků thermo-IRES je asi o 50 % intenzivnější při 42 °C než při 30 °C. Jejich translační účinnost je však stále nižší než u IRES divokého typu, která nezávisí na teplotě [28] .