Alternativní sestřih je varianta sestřihu messenger RNA ( mRNA ), při které se během genové exprese vytvoří několik zralých mRNA na základě stejného primárního transkriptu (pre-mRNA). Strukturální a funkční rozdíly ve výsledných transkriptech mohou být způsobeny jak selektivním zařazením exonů primárního transkriptu do zralé mRNA, tak zachováním částí intronů v ní [1] [2] . Nejběžnějším typem alternativního sestřihu je přeskočení exonu : jednotlivé exony transkriptu za určitých podmínek mohou být buď zahrnuty do zralé mRNA nebo přeskočeny [3] .
Proteiny produkované translací takových mRNA vedou k různým aminokyselinovým sekvencím; při alternativním sestřihu tedy jeden transkript zajišťuje syntézu několika proteinů. Rozšířený výskyt takového sestřihu u eukaryot vede k významnému zvýšení diverzity proteinů kódovaných v jejich genomech [4] . Například lidské tělo syntetizuje nejméně 100 tisíc různých proteinů, přičemž počet genů, které je kódují, je přibližně 20 tisíc (více než 75 % všech lidských genů, které obsahují introny, působí jako templáty pro syntézu pre-mRNA, které jsou další alternativní spojování) [1] [2] .
Tvorba alternativně sestřižených mRNA je pod kontrolou systému trans -působících proteinů ( sestřihové faktory ), které se vážou na cis místa primárního transkriptu. Mezi sestřihovými faktory se rozlišují sestřihové aktivátory a represory : ty první podporují využití svých jednotlivých míst, druhé naopak jejich použití brání. Mechanismy alternativního sestřihu jsou velmi rozmanité, znalost „kódu sestřihu“ umožňuje za určitých podmínek predikovat výsledky sestřihu konkrétního genu [5] [6] .
Alternativní anomálie sestřihu často vedou k onemocnění; mnoho lidských genetických chorob je způsobeno těmito anomáliemi [5] . Vědci se domnívají, že aberantní sestřih může přispívat k rozvoji rakoviny , a bylo prokázáno, že u různých typů rakoviny geny sestřihových faktorů často mutují , což vede k narušení normálního průběhu sestřihu [7] [8] [9] [ 10] . Bylo také zjištěno, že alternativní anomálie sestřihu přispívají k rozvoji odolnosti těla vůči chemoterapii [11] .
Alternativní sestřih byl poprvé popsán v roce 1977 u adenovirů [12] [13] . Bylo zjištěno, že adenovirus produkuje pět různých transkriptů časně v infekčním cyklu, před replikací virové DNA , a ještě jeden po zahájení replikace DNA; zatímco tvorba časných primárních transkriptů pokračuje po začátku replikace DNA. Další jediný transkript, vytvořený v pozdějších stádiích infekčního cyklu, je přečten z 5/6 z 32 kb adenovirového genomu. Pozdní transkript je mnohem delší než kterýkoli z časných virových transkriptů. Výzkumníci ukázali, že primární transkript produkovaný adenovirem typu 2 v pozdních stádiích infekce je sestřihován různými způsoby, což vede k tvorbě mRNA kódujících různé virové proteiny. Kromě toho primární transkript obsahuje více polyadenylačních míst , což má za následek různé 3' konce pro různé mRNA [14] [15] [16] .
V roce 1981 byl popsán alternativní sestřih v buněčném eukaryotickém genu. U savčích buněk se ukázalo, že taková alternativa doprovází tvorbu hormonu kalcitoninu . Primární transkript genu pro kalcitonin obsahuje 6 exonů; zralá mRNA kódující kalcitonin zahrnuje exony 1-4 a polyadenylační signál se nachází v exonu 4. V jiné mRNA vytvořené ze stejného primárního transkriptu je exon 4 přeskočen během sestřihu a zralá mRNA obsahuje exony 1-3, 5, a 6 Kóduje peptid související s genem kalcitoninu [ 17 ] [18] . Alternativní sestřih v savčích imunoglobulinových genech byl také objeven na počátku 80. let [14] [19] .
Následné studie ukázaly, že alternativní sestřih je běžný u všech eukaryot [3] . Počet izoforem proteinů, které lze přeložit z jednoho genu, přitom může být poměrně významný. Bylo tedy vypočteno, že gen ovocné mušky Drosophila melanogaster , známý jako DSCAM , pokud je nezávisle kombinován v mRNA všech dostupných exonů, může potenciálně poskytnout syntézu 38 016 izoforem [20] .
Existuje pět alternativních modelů spojování [3] [4] [5] [21] [22] :
Kromě pěti hlavních modelů alternativního sestřihu jsou známy dvě metody pro získání několika proteinů z jednoho genu v důsledku použití více promotorů a více polyadenylačních míst . Použití více promotorů je však více o regulaci transkripce než o alternativním sestřihu. Počínaje transkripcí z různých bodů je možné získat transkripty s různými 5'-koncovými exony. Na druhé straně použití více polyadenylačních míst vede k tvorbě různých 3' konců v maturujících transkriptech. Oba tyto mechanismy v kombinaci s pěti sestřihovými vzory zajišťují rozmanitost mRNA čtených ze stejného genu [3] [5] .
Jeden transkript je schopen podstoupit více než jeden typ alternativního sestřihu [22] . Výše diskutované modely dobře popisují základní spojovací mechanismy, ale nemusí být vhodné pro složité případy. Například obrázek vpravo ukazuje tři spojené formy myšího genu hyaluronidázy 3. Porovnání exonů první formy (zelená) a druhé (žlutá) ukazuje, že intron byl v konečném transkriptu zachován, a srovnání druhé formy se třetí (modrá) ukazuje přeskočení exonu [21] .
Pre-mRNA transkribovaná z DNA obsahuje exony i introny a počet a délka intronů, které vytvářejí nezbytné pozadí pro alternativní sestřih, se u různých eukaryot výrazně liší. Průměrný počet intronů na jeden gen obsahující intron v modelových organismech je tedy 2,5 u Drosophila melanogaster , 4,2 u Caenorhabditis elegans a 4,8 u Arabidopsis thaliana ; u savců se pohybuje od 5,7 do 7,8 [24] . Během sestřihu musí být exony ponechány v transkriptu a odstraněny introny. Regulaci a výběr sestřihových míst zajišťují trans -působící sestřihové aktivátorové proteiny a represory, stejně jako cis - působící prvky přítomné v samotné pre-mRNA – sestřihové zesilovače a tlumiče [25] .
Typické eukaryotické introny obsahují konsensuální sekvence ; tedy na 5'-konci každého intronu je dinukleotid GU, vedle 3'-konce je "bod větvení", ve kterém je vždy přítomen nukleotid A a sekvence umístěné kolem něj se mění. U lidí existuje konsensuální sekvence kolem bodu větvení yUnAy [26] . Za bodem větvení je řada pyrimidinů ( polypyrimidinový trakt ) a 3'-konec intronu vypadá jako AG [5] .
Sestřih pre-mRNA se provádí komplexem RNA -protein známý jako spliceosom . Spliceosom zahrnuje malé jaderné ribonukleoproteiny (snRNP) označené U1 , U2 , U4 , U5 a U6 (ribonukleotid U3 není zapojen do sestřihu mRNA) [23 ] [27] . Ribonukleotid U1 se váže na 5'-terminální dinukleotid GU a U2 se za účasti proteinových faktorů U2AF váže na bod větvení (v této fázi se komplex nazývá komplex spliceosom A). Během tvorby A-komplexu jsou určeny 5'- a 3'- hranice odstraněného intronu a také konce exonů, které by měly být ponechány [5] .
Dále se komplex U4, U5, U6 váže na A-komplex. Poté U6 nahradí U1 a U1 a U4 areál opustí. Zbývající komplex podstoupí dvě transesterifikační reakce . Během první reakce je 5'-konec intronu odříznut od překrývajícího exonu a připojen v bodě větvení k nukleotidu A pomocí 2',5'- fosfodiesterové vazby , v důsledku čehož intron má podobu lasa . Druhá reakce odřízne 3' konec intronu a spojí dva exony fosfodiesterovou vazbou; zatímco intron je uvolněn a zničen [3] [23] .
Sestřih je regulován trans -působícími proteiny ( aktivátory a represory ) a odpovídajícími cis - regulačními prvky ( tlumiče a zesilovače ) na pre-mRNA. Existují však důkazy, že v mnoha případech působení sestřihového faktoru závisí na jeho poloze: když je sestřihový faktor spojen s prvkem zesilujícím intron, působí jako sestřihový aktivátor a když se váže na regulační místo v exonu. , působí jako represor [25] . Regulace sestřihu zahrnuje i sekundární strukturu pre-mRNA, která zajišťuje efektivní vzájemnou konvergenci dvou regulačních prvků nebo maskuje ty sekvence, které by mohly sloužit jako vazebná místa pro sestřihové faktory [28] [29] . Společně tyto prvky tvoří „sestřihový kód“, který určuje, jak bude sestřih probíhat za daných buněčných podmínek [30] [31] .
V pre-mRNA jsou známy dva typy cis - aktivačních elementů, které odpovídají trans -aktivujícím RNA-vazebným proteinům. Sestřihové tlumiče jsou prvky, na které se vážou silencing represorové proteiny, čímž se snižuje pravděpodobnost, že sestřihové místo bude v sousedství. Umístění sestřihových tlumičů může být buď introny (intronové sestřihové tlumiče, ISS) nebo exony (exonové sestřihové tlumiče, ESS). Jejich nukleotidové sekvence, stejně jako proteiny, které se na ně vážou, jsou velmi rozmanité. Většina sestřihových represorů jsou heterogenní jaderné ribonukleoproteiny (hnRNP), jako je hnRNPA1 a protein vázající polypyrimidinový trakt (PTB) [5] [30] .
Zesilovače sestřihu vážou proteiny aktivátoru sestřihu, čímž se zvyšuje efektivní pravděpodobnost, že sestřihové místo bude poblíž. Jako jejich hostitel mohou také sloužit jak introny (zesilovače sestřihu intronů, ISE), tak exony (zesilovače sestřihu exonu, ESE). Většina proteinů, které se vážou na ISE a ESE, patří do rodiny proteinů SR (regulující nejen průběh alternativního sestřihu, ale i mnoho dalších buněčných procesů [32] ; první z proteinů této rodiny, identifikovaný jako sestřihový faktor, byl objeven v roce 1991 [33] ). Tyto proteiny obsahují rozpoznávací motivy RNA a také domény bohaté na arginin a serin [ 5] [30] .
Sestřihové faktory tedy působí vzájemně závisle a výsledky jejich působení závisí i na prostředí [31] . Přítomnost určitých cis - regulačních RNA sekvencí může jak zvýšit pravděpodobnost, že sestřihové místo bude poblíž, tak snížit tuto pravděpodobnost v závislosti na kontextu. Některé z těchto prvků například ovlivňují spojování pouze tehdy, jsou-li vedle nich další dobře definované prvky. Kromě toho mohou mít cis -regulační prvky různé účinky, když jsou určité proteiny exprimovány v buňce. Adaptivní význam enhancerů a sestřihových silentbloků potvrzují studie prokazující, že mutace v lidských genech, které vedou ke vzniku nových silentbloků nebo zničení starých enhancerů, podléhají přísnému výběru [34] [35] .
Pre-mRNA genu dsx Drosophila D. melanogaster obsahuje 6 exonů. U mužů zralá mRNA zahrnuje exony 1, 2, 3, 5, 6 a kóduje protein, který funguje jako transkripční regulátor ve vývoji mužského typu. U žen zralá mRNA zahrnuje exony 1, 2, 3 a 4, přičemž exon 4 obsahuje polyadenylační signál, při kterém je mRNA štěpena. Výsledný protein funguje jako transkripční regulátor ve vývoji ženského typu [36] .
V popsaném příkladu dochází k alternativnímu sestřihu typu přeskočení exonu. Intron upstream od exonu 4 obsahuje polypyrimidinový trakt, který plně nesplňuje konsenzuální sestřihovou sekvenci, proto se na něj proteiny U2AF vážou špatně v nepřítomnosti sestřihových aktivátorů. Z tohoto důvodu se toto 3' sestřihové akceptorové místo nepoužívá u mužů. U samic je však přítomen sestřihový aktivátor Transformer (Tra). Tento protein se váže na SR protein Tra2 (který je produkován u obou pohlaví a váže se na ESE v exonu 4) a spolu s dalším SR proteinem dsxRE tvoří komplex, který usnadňuje vazbu proteinů U2AF na slabý pyrimidinový trakt. U2 je rekrutován do odpovídajícího bodu větvení, což vede k začlenění exonu 4 do zralé mRNA [36] [37] .
Alternativní akceptorová místa: Drosophila TransformerPre-mRNA genu D. melanogaster Transformer (Tra) podléhají alternativnímu sestřihu podle modelu alternativních akceptorových míst. Gen Tra kóduje protein, který je exprimován pouze u žen. Primární transkript tohoto genu obsahuje intron se dvěma možnými akceptorovými místy. U mužů je zapojeno upstream akceptorové místo, díky čemuž mRNA zahrnuje rozšířenou verzi exonu 2 obsahující předčasný stop kodon; proto se u samců tvoří zkrácený neaktivní protein. Samice na druhé straně produkují kompletní protein, který hraje klíčovou roli při určování pohlaví a je známý jako Sex lethal (Sxl). Protein Sxl je sestřihový represor a vazbou na ISS v transkriptu Tra RNA v blízkosti upstream akceptorového místa zabraňuje vazbě proteinu U2AF na polypyrimidinový trakt; v důsledku toho se spliceosom váže na downstream akceptorové místo, což vede k odstranění předčasného stop kodonu. Výsledná mRNA kóduje protein Tra, který sám působí jako regulátor alternativního sestřihu dalších genů souvisejících s pohlavím (viz příklad genu dsx výše ) [3] .
Alternativní sestřih Fas receptoruAlternativní sestřih vede k syntéze více izoforem Fas receptoru . U lidí se dvě normální izoformy tohoto receptoru tvoří přeskočením exonu. mRNA obsahující 6 exonů kóduje membránově vázanou formu receptoru Fas, která stimuluje apoptózu . Zvýšená tvorba receptoru Fas v buňkách neustále vystavených slunečnímu záření a nepřítomnost tohoto receptoru v buňkách rakoviny kůže naznačují, že uvažovaný mechanismus hraje důležitou roli při eliminaci buněk, které se vydaly na cestu transformace v rakovinu [38] . Při přeskočení exonu 6 se vytvoří ve vodě rozpustná izoforma proteinu Fas, která není schopna stimulovat apoptózu. Volba mezi inzercí exonu nebo přeskočením závisí na působení dvou antagonistických proteinů: TIA-1 a PTB.
Donorové místo umístěné na 5' konci intronu po exonu 6 v pre-mRNA je špatně zarovnáno s konsenzuální sestřihovou sekvencí a ne vždy se váže na snRNP U1 [5] . Pokud nedojde k vazbě U1, exon 6 je přeskočen (obrázek a na obrázku vpravo). Vazba proteinu TIA-1 na zesilovač sestřihu intronu stabilizuje vazbu U1. Donorové místo vytvořené na 5' konci intronu pomáhá sestřihovému faktoru U2AF vázat se na 3' sestřihové místo umístěné proti směru transkripce od exonu, i když mechanismus pro to ještě není znám (obrázek b na obrázku vpravo) [39 ] . Exon 6 obsahuje sestřihový tlumič bohatý na pyrimidiny ( ure6 ), na který se může vázat PTB. Pokud dojde k PTB vazbě, pak donorové místo na 5' konci intronu nepodporuje vazbu U2AF a exon je přeskočen (obrázek c na obrázku vpravo).
Výše popsaný mechanismus je příkladem definice exonu během sestřihu. Spliceosom se sestaví v oblasti intronu a snRNP složí RNA tak, že se 5' a 3' konce intronu spojí. Ve výše popsaném případě však také interagují konce exonu. V tomto případě jsou interakce definující hranice exonů vyžadovány pro vazbu jádrových sestřihových faktorů před sestavením spliceosomu na hranicích lemujících intronů [39] .
Soutěž represor-aktivátor: exon 2 genu tat HIV-1HIV , retrovirus , který způsobuje AIDS , tvoří jedinou pre-mRNA, ze které se pak alternativním sestřihem vytvoří více než 40 různých mRNA [40] . Rovnováha mezi různě sestřihovanými transkripty zajišťuje tvorbu mRNA kódujících všechny proteiny potřebné pro replikaci viru [41] . Jeden z různě sestřižených transkriptů obsahuje transkript genu tat , ve kterém je exon 2 kazeta, to znamená, že může být zahrnut do konečného transkriptu nebo ne. Začlenění tohoto exonu je regulováno sestřihovým represorem hnRNP A1 a SR proteinem SC35. V exonu 2 se sekvence tlumiče (ESS) a sekvence zesilovače (ESE) překrývají. Pokud se represor A1 naváže na ESS, spustí kooperativní vazbu molekul A1 , uzavře 5'-koncové donorové místo před exonem 2 a zabrání vazbě U2AF35 na polypyrimidinový trakt. Pokud se SC35 váže na ESE, brání AI ve vazbě a 5' donorové místo zůstává dostupné pro spliceosom. Kompetice mezi represorem a aktivátorem vede k tvorbě RNA, respektive obsahující nebo neobsahující exon 2 [40] .
Alternativní sestřih je jednou z výjimek z pravidla, že jeden gen odpovídá jednomu proteinu (hypotéza „jeden gen – jeden enzym “) [42] . Správnější by bylo říci: „jeden gen – mnoho polypeptidů “. Externí informace jsou potřebné pro rozhodnutí, který polypeptid vytvořit z dané mRNA. Vzhledem k tomu, že metody regulace jsou dědičné, otevírá to mutacím nový způsob, jak změnit genovou expresi [9] .
Pro eukaryota má být alternativní sestřih velmi důležitým krokem ke zvýšení účinnosti genové exprese, protože umožňuje ekonomičtěji ukládat informace. Jeden gen může dát vzniknout několika proteinům spíše než jednomu, takže stejnou diverzitu proteomu lze získat z výrazně menšího genomu [3] . Poskytuje také evoluční flexibilitu. Jednobodová mutace může vést k inkluzi nebo vyloučení exonu z transkriptu, díky čemuž lze získat novou izoformu proteinu bez ztráty hlavní formy [3] . Opravdu byly nalezeny neuspořádané oblasti, které obsahují mnoho nekonstitutivních exonů, takže izoformy proteinů mohou plnit nové funkce změnou funkčních modulů v těchto místech [43] [44] [45] . Srovnávací odhady ukazují, že vznik alternativního sestřihu v průběhu evoluce předcházel vzniku mnohobuněčnosti; naznačují, že alternativní sestřih byl jedním z prostředků, které zajistily vznik mnohobuněčných organismů [46] .
Výzkum Human Genome Project a další projekty sekvenování genomu ukázaly, že lidský genom je pouze o 30 % větší než u háďátka Caenorhabditis elegans a pouze dvakrát větší než u ovocné mušky Drosophila melanogaster . Tyto údaje naznačují, že složitost lidí a obratlovců obecně může být způsobena zvýšeným používáním alternativního sestřihu ve srovnání s bezobratlými [47] [48] . Další studie genomových sekvencí člověka, myši, potkana , skotu , D. melanogaster , C. elegans a Arabidopsis thaliana však ukázala, že neexistuje žádný významný rozdíl v použití alternativního sestřihu mezi lidmi a jinými eukaryoty [49] . Existují však důkazy, že získaná data jsou artefaktem spojeným s nerovnoměrným zahrnutím komplementárních sekvencí DNA odebraných z různých organismů do srovnávací analýzy . Při srovnání frekvence použití alternativního sestřihu pro náhodné vzorky genů získaných z porovnávaných organismů se ukázalo, že alternativní sestřih je stále častější u obratlovců než u bezobratlých [50] .
Změny v aparátu pro zpracování RNA mohou vést k poruchám sestřihu v mnoha transkriptech a substituce jednoho nukleotidu v místech sestřihu nebo cis regulačních sestřihových místech vedou k rozdílům ve sestřihu stejného genu, jako je tomu u sestřihu mutovaného genového transkriptu. Ve studii z roku 2005 se ukázalo, že přes 60 % mutací, které vedou k rozvoji onemocnění, neovlivňuje samotnou kódující sekvenci, ale sestřih [51] . Bylo také prokázáno, že asi třetina dědičných onemocnění je spojena s poruchami sestřihu [25] .
Abnormálně sestřižené mRNA se nacházejí ve významné části rakovinných buněk [7] [8] [10] . Analýza RNA-Seq a proteomů ukázala výrazné rozdíly v expresi sestřihových izoforem těch proteinů, které se účastní signálních drah spojených s rozvojem rakoviny [52] . Není známo, zda poruchy sestřihu ovlivňují vývoj rakoviny přímo, nebo zda jsou výsledkem poruchy buněčných procesů v důsledku přechodu do rakovinného bujení. Bylo zaznamenáno, že u některých typů rakoviny, jako je rakovina tlustého střeva nebo rakovina prostaty , se počet chyb sestřihu u různých pacientů významně měnil; tento jev se nazývá transkriptomická nestabilita [53] [54] .
Navíc se ukázalo, že nestabilita transkriptomu je spojena se sníženou expresí genů sestřihových faktorů. Obecně platí, že alternativní sestřih se v rakovinných buňkách používá méně než v normálních buňkách a vzory sestřihu se také liší. V rakovinných buňkách tedy dochází k retenci intronů častěji než v normálních buňkách, zatímco k přeskočení exonu dochází méně často. Vlastnosti sestřihu v rakovinných buňkách mohou být spojeny s vysokou frekvencí somatických mutací v genech sestřihových faktorů a některé rysy mohou být způsobeny změnami ve fosforylaci transregulačních sestřihových faktorů [55] [9] . Některé rysy sestřihu mohou být spojeny se změnou relativního počtu jeho faktorů; například v buňkách rakoviny prsu jsou pozorovány zvýšené hladiny sestřihového faktoru SF2/ASF [56] . Jedna studie ukázala, že relativně malý podíl (383 z 26 000) alternativních sestřihových variant byl významně častější v rakovinných buňkách než v normálních buňkách; z toho vyplývá, že existuje omezený počet genů, jejichž aberantní sestřih vede k rozvoji nádoru [57] . Předpokládá se však, že škodlivý účinek narušeného sestřihu je omezován speciálním buněčným post-transkripčním kontrolním mechanismem, rozkladem zprostředkovaným nesmyslem [58] .
Příkladem genu, jehož specifická sestřihová varianta je spojena s rozvojem rakoviny u lidí, je jeden z genů DNMT . Tři geny DNMT kódují enzymy, které přidávají methylové skupiny k DNA, a modifikace těchto genů má často regulační účinky. V nádorech a rakovinných buněčných liniích bylo nalezeno několik abnormálně sestřižených mRNA genu DNMT3B . Exprese dvou z těchto mRNA způsobila změny v methylaci DNA v těchto buňkách. Buňky s jednou abnormální mRNA rostly dvakrát rychleji než kontrolní buňky, takže detekované mRNA jsou spojeny s rozvojem rakoviny [9] .
Dalším příkladem je protoonkogen Ron ( MST1R ). Důležitou vlastností rakovinných buněk je jejich schopnost migrovat ( metastázovat ) do normálních tkání a narušovat jejich práci. Tvorba abnormálně sestřižené Ron mRNA byla spojena se zvýšenými hladinami SF2/ASF v buňkách rakoviny prsu. Abnormální izoforma Ron přeložená z této mRNA zvýšila motilitu buněk [56] .
Nadměrná exprese zkrácené verze FOSB proteinu , ΔFosB, ve specifické populaci neuronů v nucleus accumbens je základem vzniku a udržování drogové závislosti a přirozené odměny [ 59] [ 60] [61] [62] .
Nedávné studie poukazují na roli struktury chromatinu a modifikací histonů v regulaci alternativního sestřihu. Epigenetické faktory proto mohou ovlivnit nejen genovou expresi, ale také jejich sestřih [63] .
Analýza alternativního sestřihu v celém genomu je náročný úkol. Alternativně sestřižené transkripty se typicky nacházejí porovnáním exprimovaných sekvenčních značek ( anglicky Expressed sequence tag, EST ). Většina EST knihoven je sestavena z velmi omezeného počtu tkání, takže tkáňově specifické transkripty nebyly dříve brány v úvahu. Objevily se však vysoce výkonné metody pro studium sestřihu, jako jsou DNA microarrays a deep sequencing ( angl. deep sequencing ). Tyto metody lze použít k hledání polymorfismů a mutací lokalizovaných v těch sestřihových prvcích, které ovlivňují vazbu na proteiny, nebo v jejich bezprostřední blízkosti. Kombinací těchto metod s technikami sestřihu, jako je in vitro analýza reportérového genu , je možné studovat účinek polymorfismů a mutací na sestřih pre-mRNA [25] [30] [64] .
Microarray analýza používá DNA fragmenty, které jsou jednotlivé exony (jako je Affymetrix microarray ) nebo hranice mezi exony. Do mikročipu se pak přidá značená cDNA z požadované tkáně. Tato sonda cDNA se váže komplementárně k fragmentům DNA již na mikročipu. Díky této metodě lze detekovat přítomnost určitých alternativně sestřižených mRNA [65] .
Metoda CLIP ( anglicky Cross-linking and immunoprecipitation - tvorba křížových vazeb a imunoprecipitace ) využívá UV záření k vytvoření křížových vazeb mezi proteiny a RNA, které procházejí sestřihem. Trans -působící regulační sestřihové proteiny jsou pak precipitovány specifickými protilátkami . Když je RNA asociovaná s proteinem izolována a klonována, je určena sekvence RNA asociovaná s regulačním proteinem [6] . Použití reportérových genů umožňuje identifikovat sestřihové proteiny zapojené do specifických případů alternativního sestřihu: v závislosti na tom, jak k sestřihu došlo, dá reportérový gen vzniknout dvěma různým fluorescenčním proteinům . Tato metoda byla použita k izolaci mutantů s narušeným sestřihem a k identifikaci regulačních sestřihových proteinů inaktivovaných v těchto mutantech [6] .
| Post-transkripční modifikace | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nukleární |
| ||||||||
| Cytosolický |
| ||||||||