Protilátky , imunoglobuliny jsou velké globulární proteiny krevní plazmy vylučované plazmatickými buňkami imunitního systému a slouží k neutralizaci buněk patogenů ( bakterie , houby , mnohobuněční parazité ) a virů , stejně jako proteinových jedů a některých dalších cizorodých látek. Každá protilátka rozpoznává jedinečný prvek patogenu, který v těle samotném chybí – antigen a v daném antigenu – jeho určitou část, epitop . Vazbou na antigeny na povrchu patogenů je mohou protilátky buď přímo neutralizovat, nebo získat další složky imunitního systému, jako je systém komplementu a fagocyty , aby zničily cizí buňky nebo virové částice. Protilátky jsou základní složkou humorální specifické imunity .
Protilátky (imunoglobuliny) tvoří nadrodinu proteinů . Molekula protilátky má tvar Y, dvě identická vazebná místa pro antigen jsou umístěna na dvou koncích molekuly a třetí konec může být jedním z několika typů, v závislosti na tom jsou protilátky přiřazeny do jedné nebo druhé třídy. Složení jedné protilátky ve většině případů zahrnuje dva těžké řetězce a dva lehké řetězce . U savců existuje pět typů těžkých řetězců – α, γ, δ, ε a μ, které odpovídají pěti izotypům (třídám) protilátek – IgA , IgG , IgD , IgE a IgM [1] . Protilátky každého izotypu se liší od ostatních ve funkcích a strukturních vlastnostech. Obrovská variabilita protilátek je zajištěna přestavbami lokusů kódujících těžké a lehké řetězce během V(D)J rekombinace .
Tvorba protilátek, které rozpoznávají normální tělesné proteiny ( autoprotilátky ), je základem pro rozvoj autoimunitních onemocnění , jako je systémový lupus erythematodes , revmatoidní artritida a další. Úplná nebo částečná absence protilátek vede k rozvoji stavů imunodeficience .
Imunoglobulinové (protilátkové) molekuly mají tvar písmene "Y" a skládají se ze dvou identických lehkých a dvou identických těžkých polypeptidových řetězců spojených dohromady disulfidovými vazbami. Polypeptidové řetězce na "horních" koncích "písmene Y" končí aminoskupinami a jsou to místa vázající antigen, "noha" - s karboxylovými skupinami [2] .
Jsou známé rozpustné a membránové formy protilátek. Membránové protilátky se nacházejí na B lymfocytech a nazývají se receptory B buněk . Rozpustné protilátky jsou strukturou téměř totožné s membránovými, rozdíly se týkají pouze C-terminální (konstantní) části. Monomerní imunoglobulinová molekula má molekulovou hmotnost 150-170 kDa a skládá se ze čtyř polypeptidových řetězců: dvou lehkých neboli L-řetězců ( anglicky Lite ) (hmotnost 50-60 kDa) a dvou těžkých neboli H-řetězců ( anglicky Heavy ) (hmotnost 100-120 kDa), které jsou uspořádány symetricky a spojeny disulfidovými vazbami . H- a L-řetězce jsou spojeny jedinou disulfidovou vazbou umístěnou v blízkosti C-konce lehkého řetězce, zbývající disulfidové vazby drží H-řetězce pohromadě. Složení lehkých řetězců zahrnuje dva homologní segmenty ( domény ) a těžké řetězce - 4-5 domén. Domény se skládají z přibližně 110 aminokyselinových zbytků (a.a.) a mají podobnou prostorovou strukturu, která je stabilizována jedinou disulfidovou vazbou, ale jejich funkce se liší [3] . Tyto domény jsou takzvané imunoglobulinové domény obsahující charakteristický strukturální motiv , známý jako imunoglobulinový záhyb, reprezentovaný dvěma β-vrstvami , které spolu interagují prostřednictvím disulfidových vazeb a elektrostatických interakcí, tvořících něco jako sendvič [4] . Domény se vzájemně ovlivňují prostřednictvím hydrofobních interakcí [5] .
N-konce všech řetězců se účastní rozpoznávání antigenu, to znamená, že tvoří dvě identická vazebná místa pro antigen. Klíčovou roli v procesu rozpoznávání antigenu hraje korespondence mezi strukturami antigenu (přesněji části molekuly antigenu - epitopu ) a místem protilátky, které rozpoznává antigen, neboli paratopem , podle „klíče princip "zámku". Specifičnost imunoglobulinů je určena aminokyselinovou sekvencí domén rozpoznávajících antigen, které se nazývají variabilní nebo V-domény (nazývají se také F V oblasti). Místo vázající antigen tvoří V-domény těžkých a lehkých řetězců ( VH- a VL - domény , v tomto pořadí). Je tvořena proměnnými smyčkami β-listů, z nichž tři patří do VL -domény a zbývající tři patří do VH -domén. Tyto smyčky se někdy nazývají oblasti určující komplementaritu ( CDR ) [ 6 . CDR jsou také známé jako hypervariabilní oblasti. V molekule imunoglobulinu jsou obvykle 3 hypervariabilní oblasti, jejichž pozice v řetězci může být různá. Každá V-doména navíc zahrnuje 4 oblasti relativně konstantního složení (frame regiony) [7] . Ultra vysoká variabilita CDR poskytuje obrovské množství imunoglobulinů [8] .
Zbývající domény molekuly imunoglobulinu mají pevnou strukturu, proto se nazývají konstantní nebo C-domény. L řetězec obsahuje jednu C doménu (označenou CL ) a H řetězec obsahuje 3 nebo 4 domény, které jsou označeny CH 1, CH 2, CH 3, CH 4. C domény se nepodílejí na rozpoznávání antigenu a jsou nezbytné pro interakci s receptory imunitních buněk , aktivaci systému komplementu a další efektorové funkce [3] .
Podíl hypervariabilních pozic ve V-doménách je malý ve srovnání s relativně invariantními pozicemi a činí 15–20 % všech aminokyselinových zbytků. Navíc se v evoluci obratlovců ukázalo, že V-domény jsou více konzervované než konstantní domény a jejich konzervatismus je spojen s konstantními oblastmi. Homologie VL domén mezi tygřími a galapážskými žraloky je tedy asi 75 % a mezi lidmi a psy asi 50 % [9] .
Protilátka se nazývá monospecifická , pokud dokáže rozpoznat pouze jeden antigen nebo epitop, a bispecifická, pokud se váže na dva různé antigeny nebo dva různé epitopy v rámci jednoho antigenu [10] . Některé protilátky se nazývají polyvalentní nebo nespecifické, pokud rozpoznávají několik antigenů [11] .
Působením proteáz se molekuly imunoglobulinu štěpí na fragmenty, které mají speciální názvy. Papain tedy štěpí molekulu imunoglobulinu na tři fragmenty: dva fragmenty Fab (z anglického Fragment antigen binding ) a jeden Fc fragment (z anglického Fragment cristallizable ). Fab fragmenty obsahují V domény, stejně jako CL a CH1 domény, zatímco Fc obsahuje zbývající C domény a disulfidové vazby je spojující. Pepsin štěpí molekulu imunoglobulinu mírně odlišně a vytváří bivalentní fragment F(ab') 2 vázající antigen a zkrácený fragment Fc' [12] .
Oblast C-domény obsahuje většinu míst, která interagují s buněčnými receptory, jako jsou Fc receptory . Doména Cy2 tedy obsahuje vazebná místa pro složku komplementu C4b, stejně jako pro receptory FcyRI a FcyRII. Vazebné místo FcyRIII je lokalizováno v doméně Cy3. Délka pobytu protilátky v krevním řečišti závisí na struktuře domény CH 2 [8] . Mezi doménami CH1 a CH2 je oblast, která má různou délku v H řetězcích různých izotypů a není součástí domén. Díky vysokému obsahu prolinu je tato oblast vysoce flexibilní, a proto je také označována jako oblast závěsu. Právě v ní se nacházejí místa pro štěpení imunoglobulinů proteázami [13] .
Molekuly protilátek podléhají glykosylaci , to znamená, že jsou to glykoproteiny . L-řetězce postrádají stabilní glykosylační místa a v H-řetězcích jsou přítomny ve všech doménách kromě variabilní (většina z nich je v doméně CH2) . V protilátkách je více N-glykosylačních míst než O-glykosylačních míst . Sacharidová složka protilátek neovlivňuje jejich specificitu, nicméně glykosylace je nezbytná pro stabilizaci funkčně důležitých vlastností molekuly, zajišťuje interakci s lektiny , určuje charakteristiky katabolismu a biologické vlastnosti protilátek. Sacharidové fragmenty ve složení protilátek mají nejčastěji základ z manosových a chitobiózových zbytků [14] .
Těžké a lehké řetězce existují v několika variantách, které se liší strukturou a funkcí, a proto se protilátky dělí do tříd nebo izotypů. Existují dva typy L řetězců (κ a λ) a pět izotypů H řetězců (μ, γ, α, δ a ε). Jedna molekula imunoglobulinu může obsahovat pouze H-řetězce jednoho typu. U savců existuje pět hlavních typů protilátek: IgM, IgG, IgA, IgD a IgE ( latinská písmena v názvech tříd protilátek odpovídají řeckým písmenům v označení izotypů H-řetězce). Imunoglobuliny třídy IgG a IgA se dělí na podtřídy (podtypy), a to také v závislosti na charakteristice H-řetězců. Imunoglobuliny všech tříd mohou patřit ke K- a L-typům v závislosti na přítomnosti L-řetězců typu κ nebo λ v jejich složení [15] . Různé izotypy H-řetězců mají různý počet C-domén: γ-, α- a δ-řetězce mají každý 3 C-domény a μ- a ε-řetězce obsahují každý 4 C-domény [8] . Třídy protilátek se také liší stupněm glykosylace, konkrétně protilátky třídy IgG jsou nejméně glykosylované [14] .
Hlavní vlastnosti tříd protilátek jsou uvedeny v tabulce níže [15] .
Vlastnictví | IgM | IgG | IgA | IgD | IgE |
---|---|---|---|---|---|
Molekulová hmotnost, kDa | 950 | 150; podtyp IgG3-165 | 150; dimer - 300 | 185 | 190 |
Počet monomerů | 5 | jeden | 1 nebo 2 | jeden | jeden |
Mocenství | 5 | 2 | 2 nebo 4 | 2 | 2 |
Izotyp H řetězce | μ | γ | α | 5 | ε |
Počet C-domén v H-řetězci | čtyři | 3 | 3 | 3 | čtyři |
Počet disulfidových vazeb mezi H řetězci | čtyři | 3-12 | 4 nebo 5 | jeden | 3 |
Obsah v séru , mg/ml | 1.5 | 13-14 | 3.5 | 0,03 | 0,00002–0,0005 |
Poločas rozpadu, dny | 5-10 | 23 (IgG3 - 7) | 6 | 3 | 2 |
Buňky, které vážou protilátku přes Fc receptory | — | Makrofágy , monocyty , neutrofily | Makrofágy, monocyty, neutrofily (slabě) | — | Žírné buňky , bazofily |
Funkce | Membránový receptor, primární imunitní odpověď | Sekundární imunitní odpověď, ochrana proti bakteriím a virům | Převládá ve slizničních sekretech | Membránový receptor | Reagins, ochrana proti parazitům |
Kromě tříd savčích protilátek uvedených výše mají někteří obratlovci další třídy protilátek. Například kostnaté ryby mají speciální třídu IgT/Z protilátek, zatímco obojživelníci , plazi a ptáci mají imunoglobuliny Y (IgY), které se skládají ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců a ve velkém množství se hromadí ve vaječném žloutku [16] . Chrupavčité ryby a savci z čeledi velbloudovitých mají protilátky s těžkým řetězcem , které postrádají lehké řetězce. Protilátky chrupavčitého a velbloudího těžkého řetězce jsou považovány za výsledek konvergentní evoluce a objevily se ve spojení s funkčními znaky. Asi 50 % protilátek velbloudů a příbuzných druhů jsou typické savčí čtyřřetězcové protilátky. Zda existují zvířata, která mají pouze protilátky s těžkým řetězcem, není známo [17] .
Mezi hlavní funkce protilátek v imunitním systému patří:
Protilátky, které se vážou na povrch cizí buňky, aktivují první složku komplementové kaskády prostřednictvím svých Fc oblastí; tento způsob aktivace komplementu se nazývá klasická cesta aktivace komplementu [19] . V důsledku toho může buňka pokrytá protilátkami zemřít dvěma způsoby. Za prvé, vazba protilátek a složek komplementu na buněčný povrch ji označí jako cíl pro destrukci fagocyty, které jsou k buňce přitahovány některými složkami kaskády komplementu. Za druhé, složky komplementu tvoří na povrchu buňky komplex atakující membránu , který způsobí její smrt v důsledku lýzy [20] .
Aby se zabránilo množení extracelulárních patogenů, protilátky „slepují“ patogenní buňky dohromady a způsobují jejich aglutinaci [21] . Protože minimální valence (tj. počet současně navázaných antigenů) protilátky je dvě, může vázat dvě molekuly antigenu umístěné na různých buňkách, a tím je spojit. Potažením povrchu patogenu k němu protilátky přitahují efektorové imunitní buňky pomocí Fc oblastí. Buňky, které rozpoznávají Fc oblasti protilátek, mají specializované Fc receptory (FcR), které se mohou vázat na Fc oblasti IgA, IgG a IgE. Vazba Fc receptoru buňky na protilátku ji aktivuje, což se u fagocytů projeví spuštěním fagocytózy, u žírných buněk a neutrofilů - degranulace , natural killers - uvolnění cytokinů a cytotoxických molekul , což v konečném důsledku vede ke zničení mikroorganismu . Aktivace přirozených zabíječských buněk protilátkami spouští mechanismus známý jako na protilátkách závislá buňkami zprostředkovaná cytotoxicita [ ( ADCC ) . Tento mechanismus může vysvětlit účinnost monoklonálních protilátek v léčbě rakoviny . Vzhledem k tomu, že Fc receptory jsou specifické pouze pro protilátky určitého izotypu, má imunitní systém dostatečnou flexibilitu ke spuštění určitého typu imunitní odpovědi na daný patogen [22] .
U lidí a vyšších primátů jsou v krevní plazmě neustále přítomny tzv. přirozené protilátky , které se tvoří bez předchozí infekce , očkování nebo jiné expozice. Díky těmto protilátkám může komplementový systém spustit lýzu buněk mikroorganismů a obalených virionů viru bez předchozí aktivace adaptivní imunity . Mnoho přirozených protilátek je specifických pro disacharid galaktózu -α(1,3)-galaktózu (a-Gal), což je koncový cukr glykosylovaných buněčných povrchových proteinů. Produkce těchto protilátek je spouštěna jako odpověď na syntézu α-Gal symbiotickými střevními bakteriemi [23] . Odmítnutí xenoimplantátu lze částečně vysvětlit působením přirozených protilátek příjemce napadajících α-Gal v proteinech štěpu [24] .
Aktivované B lymfocyty se diferencují na plazmatické buňky vylučující protilátky nebo paměťové B lymfocyty , které v těle přetrvávají dlouhou dobu a uchovávají paměť antigenů, se kterými se tělo již dříve setkalo [18] . V prenatálním a novorozeneckém období se protilátky dostávají do těla dítěte od matky. Začátek tvorby vlastních protilátek se mezi třídami protilátek liší a obvykle k němu dochází během prvních let života [19] .
Kromě výše uvedených funkcí v imunitním systému mohou protilátky plnit další, nekanonické role. U některých protilátek je složení aminokyselinových zbytků ve vazebném místě pro antigen velmi podobné složení v aktivním místě některých enzymů , takže protilátky mohou katalyzovat určité chemické reakce . Protilátky s katalytickou aktivitou se nazývají abzymy . Ukázalo se, že syntéza protilátek s různou katalytickou aktivitou začíná po imunizaci meziprodukty odpovídajících reakcí. Z hlediska katalytické aktivity jsou však abzymy mnohem horší než „pravé“ enzymy. U lidí jsou za normálních i patologických stavů často detekovány protilátky s proteolytickou aktivitou , které štěpí molekuly specifické pro patogeny. Proteolytické protilátky patří do tříd IgG, IgA a IgM. Některé protilátky třídy IgM a IgG mohou zabíjet buňky mikroorganismů samy bez účasti dalších efektorových mechanismů, ale mechanismus jejich účinku je znám jen v několika případech. Konkrétně bylo prokázáno, že inaktivující monoklonální protilátky IgM a IgG způsobují změny v genové expresi a metabolismu u patogenní houby Cryptococcus neoformans po navázání na povrch jejích buněk. Vazba protilátek na povrch patogenní bakterie Borrelia burgdorferi způsobuje tvorbu pórů a buněčnou smrt v důsledku osmotického šoku . Někdy různé protilátky inaktivují patogen synergickým působením bez zapojení dalších efektorových drah. Pro protilátky třídy IgA byly popsány specifické nekanonické funkce. Mohou tedy zprostředkovat transepiteliální transport bakterií v myším střevě a regulovat vstup bakteriálních metabolitů do hostitelských buněk. Protilátky navíc mohou ve zdravém těle fungovat jako chaperony a nosiče různých sloučenin [25] .
V podstatě všechny mikroorganismy mohou vyvolat imunitní odpověď. Úspěšné rozpoznání a zničení patogenů vyžaduje širokou škálu protilátek, které rozpoznávají různé antigeny [26] . Podle některých odhadů se v lidském těle tvoří 10 miliard různých protilátek, z nichž každá rozpoznává jedinečný epitop [27] . Přestože u každého jedince vzniká obrovské množství protilátek, počet genů , které je kódují, je omezen velikostí genomu . Existuje několik mechanismů, které umožňují obratlovcům získat obrovské množství různých protilátek z relativně malého počtu genů [28] .
Oblasti kódující složky protilátek jsou umístěny na několika chromozomech u lidí . Na chromozomu 14 jsou sestaveny geny kódující varianty těžkého řetězce, lehké řetězce κ a λ jsou kódovány na chromozomech 22 a 2 . Variabilní domény tvořené oblastmi lehkého i těžkého řetězce se mezi protilátkami tvořenými různými plazmatickými buňkami liší. Rozdíly mezi variabilními doménami ovlivňují tři smyčky známé jako hypervariabilní oblasti (HV-1, HV-2 a HV-3) nebo oblasti určující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3). Lokus těžkého řetězce kóduje 65 variabilních domén s různými CDR. Kombinace každé z těchto variant v lineárním poli genů kódujících další domény těžkého řetězce poskytuje obrovskou škálu protilátek. K této kombinaci dochází jako výsledek V(D)J rekombinace, jejíž mechanismus je popsán níže [29] .
Během procesu V(D)J-rekombinace se vytvoří jedinečná oblast DNA , která kóduje variabilní doménu. Variabilní oblast těžkého nebo lehkého řetězce je kódována lokusem rozděleným na několik fragmentů - subgenů, které jsou označeny V (z angl . variable ), D (z angl . diversity ) a J (z angl . joining ) [28] . Subgeny V, D a J kódují variabilní oblast těžkého řetězce, zatímco variabilní oblast lehkého řetězce kóduje subgeny V a J. Každý subgen je reprezentován několika variantami uspořádanými v tandemu jedna za druhou na chromozomu . V kostní dřeni během zrání B-buňky dochází k přeuspořádání v jejích lokusech kódujících variabilní domény, v důsledku čehož jedna varianta subgenů V, D a J zůstává v lokusu a zbývající varianty jsou trvale odstraněny z genomu. Protože každý subgen je přítomen v několika variantách, jejich kombinace budou produkovat protilátky s různými antigenovými specificitami. Důležitou roli ve V(D)J-rekombinaci hrají RAG proteiny , které zavádějí zlomy v určitých oblastech a v jejich nepřítomnosti je V(D)J-rekombinace nemožná [30] . Po zrání jediného funkčního genu kódujícího variabilní doménu pro těžké a lehké řetězce v genomu B buněk přestanou být zbývající lokusy kódující variabilní domény exprimovány ( alelické vyloučení ), takže každá B buňka může produkovat protilátky pouze s jednou variabilní doména [22] [31] .
Jakmile jsou B buňky aktivovány antigenem, rychle proliferují . Paralelně s častým dělením v lokusech kódujících hypervariabilní domény těžkého a lehkého řetězce je pozorována zvýšená frekvence bodových mutací . Tento proces se nazývá somatická hypermutace . Somatická hypermutace nastává rychlostí přibližně jednoho mutovaného nukleotidu variabilní domény na buněčné dělení [32] . V důsledku tohoto procesu budou dceřiné buňky vzniklé dělením produkovat protilátky s mírně odlišnými variabilními doménami. Somatická hypermutace tedy slouží jako další mechanismus pro zvýšení diverzity protilátek a ovlivňuje afinitu protilátek k antigenu [33] . Některé mutace snižují afinitu protilátky k určitému antigenu, jiné naopak zvyšují [34] . Ty B buňky, které exprimují protilátky s vysokou afinitou k antigenu, dostávají silné signály pro přežití během interakce s jinými buňkami a nepodléhají apoptóze . Z tohoto důvodu budou mít B buňky kódující protilátky s vysokou afinitou k antigenu konkurenční výhodu oproti B buňkám kódujícím protilátky s nižší afinitou a afinita k antigenu se bude zvyšovat s každým dělením B buněk. K postupnému zvyšování afinity k antigenu a selekci B lymfocytů s nejlepší afinitou dochází za účasti T helperů po V(D)J rekombinaci [35] .
K přepínání tříd protilátek dochází po aktivaci B-buňky a umožňuje jí produkovat protilátky různých tříd (IgA, IgE nebo IgG) [30] . Rozdíly mezi protilátkami různých tříd jsou spojeny s C-doménami těžkého řetězce. Nejprve naivní B buňky produkují pouze IgM nebo IgD povrchové imunoglobuliny se stejnou antigenní specificitou. Protože každý izotyp je spojen se specifickou funkcí, musí plazmatická buňka po aktivaci produkovat protilátky IgG, IgA nebo IgE, aby účinně působila proti patogenu. Prostřednictvím přepínání tříd mohou různé dceřiné buňky odvozené ze stejné B buňky produkovat protilátky různých izotypů. Během přepínání tříd dochází ke změnám pouze v C-doménách těžkého řetězce. Potomci jedné B-buňky tedy mohou produkovat protilátky různých tříd, ale se stejnou antigenní specificitou. K přepínání tříd dochází působením určitých cytokinů [36] .
Během přepínání tříd dochází k přeuspořádání v lokusu kódujícím těžké řetězce. Proces vyžaduje konzervované nukleotidové motivy , známé jako S-místa (z anglického switch ), které jsou umístěny nad každým lokusem kódujícím těžké řetězce (jediné výjimky jsou δ-typy). Speciální enzymy dále dělají dva zlomy v DNA na dvou S-místech [37] [38] . V důsledku toho je fragment mezi dvěma zlomy odstraněn a dvouřetězcový zlom v konstantní oblasti je opraven pomocí nehomologního koncového spojení [39] .
Protilátky jsou vylučovány speciálním typem B-buněk – plazmatickými buňkami. Jako většina vylučovaných proteinů jsou těžké a lehké řetězce imunoglobulinu syntetizovány ribozomy umístěnými na hrubém endoplazmatickém retikulu (ER). Během syntézy se výsledný polypeptidový řetězec dostává do lumen ER, kde podléhá glykosylaci. Správné skládání těžkých řetězců a vazba na lehké řetězce za vzniku protilátek jsou regulovány EPR chaperony, jako je calnexin a BiP . Vážou se na nově syntetizované imunoglobulinové polypeptidy a chrání je před degradací, pokud zaujmou správnou strukturu. Také v ER lumen je protilátka sestavena díky tvorbě disulfidových vazeb mezi těžkými a lehkými řetězci. Po sestavení jsou molekuly protilátek uvolněny z chaperonů a vstupují do Golgiho aparátu , kde jejich sacharidové zbytky procházejí dalším zpracováním. Vezikuly obsahující zralé protilátky pučí z Golgiho aparátu a fúzují s buněčnou membránou, načež membránové formy protilátek zůstávají ukotveny v buněčné membráně a volné protilátky se dostávají do mezibuněčného prostoru [40] .
Jak B buňky dozrávají v kostní dřeni, exprese imunoglobulinu prochází řadou změn. Nejčasnější buňky B-buněčné linie, pre-B buňky, syntetizují pouze membránově vázané formy těžkých řetězců třídy μ. Tyto řetězce tvoří komplex s proteiny nazývanými náhradní lehké řetězce a tvoří pre-B buněčný receptor , jehož malá část je vystavena na povrchu B buňky. Nezralé a zralé B buňky syntetizují lehké řetězce tříd κ a λ, které v kombinaci s těžkými řetězci třídy μ tvoří protilátky IgM. Zralé B buňky exprimují membránové formy IgM a IgD, které slouží jako receptory, které rozpoznávají antigeny a spouštějí aktivaci B buněk. Pre-B-buněčné receptory a B-buněčné receptory jsou nekovalentně asociovány s integriny , jejichž signální funkce jsou nezbytné pro expresi povrchových forem IgM a IgD [41] .
Když jsou B buňky aktivovány antigeny a jinými stimuly, změní se na plazmatické buňky vylučující protilátky. Při přechodu do plazmatických buněk se podíl secernovaných imunoglobulinů ve srovnání s membránovými buňkami dramaticky zvyšuje. Kromě toho současně dochází k přepínání tříd protilátek a buňka přestává syntetizovat IgM a IgD, ale začíná vylučovat IgA, IgE nebo IgG [42] .
Adaptivní imunita a protilátky se vyvinuly u obratlovců přibližně před 500 miliony let [43] . Nejstaršími třídami protilátek jsou pravděpodobně IgM a IgD a protilátky IgD, které se nacházejí téměř u všech obratlovců, dokonce i u chrupavčitých ryb, jsou považovány za nejstarší třídu protilátek (IgD protilátky chrupavčitých ryb se někdy označují jako IgW; W odpovídá řeckému písmeno ω ). Existují však také obratlovci, kteří ztratili IgD, jako jsou ptáci a několik druhů savců . Zároveň se třídy IgA, IgE a IgG typické pro savce nevyskytují u všech skupin obratlovců. Zejména kostnaté ryby postrádají IgA, IgE a IgD, ale existuje další třída IgT (nebo IgZ) protilátek, které ostatní obratlovci postrádají. Protilátky IgT (T odpovídá řeckému písmenu τ ) pravděpodobně chrání sliznice ryb [44] . Neobvyklé třídy protilátek existují také u jiných obratlovců, jako jsou protilátky s těžkým řetězcem u chrupavčitých ryb a velbloudů, stejně jako IgY u obojživelníků, plazů a ptáků [16] [17] .
Pro použití protilátek v medicíně a biotechnologiích je nutné znát jejich strukturu ve vysokém rozlišení . Informace o struktuře protilátek jsou široce používány v proteinovém inženýrství protilátek, modifikaci jejich schopnosti vázat antigeny a identifikaci jednotlivých epitopů protilátek. Jednou z metod široce používaných ke stanovení struktur protilátek je rentgenová difrakční analýza , avšak krystalizace protilátek je velmi dlouhý a pracný proces, proto je predikce struktur protilátek pomocí výpočetních metod rozšířená. Predikce však neposkytuje přesné informace o struktuře. Počítačové modelování struktur variabilních domén lze provádět pomocí programů Web Antibody Modeling (WAM) [45] a Prediction of Immunoglobulin Structure (PIGS) [46] . Strukturu variabilních domén lze predikovat i pomocí služby Rosetta, ve které se pomocí speciálních metod při predikci minimalizuje délka smyček odpovídajících CDR, optimalizuje se vzájemná poloha lehkých a těžkých řetězců a modelují se vytvořené , které předpovídají spojení protilátek s jejich jedinečnými antigeny [ 47 ] . Existuje několik programů, které provádějí počítačově podporovaný návrh protilátek na základě výsledků bioinformatických studií CDR [48] [49] [50] .
Jednou z nejúčinnějších metod identifikace peptidů a proteinů, včetně protilátek, je kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií [51] . Vysoce výkonné metody pro sekvenování aminokyselinových sekvencí protilátek vyžadují speciální výpočetní přístupy pro analýzu dat , včetně de novo sekvenování z dat hmotnostní spektrometrie [52] , stejně jako přístupy k prohledávání databází obsahujících proteinové sekvence [53•]. [54] . Zvláštní význam pro sekvenování aminokyselin má metoda shotgun, jejíž pokrytí se zvyšuje fragmentací metodami CID/HCD/ETD [55] . Existují metody pro stanovení aminokyselinových sekvencí, které vyžadují sekvence podobných proteinů [56] nebo známou sekvenci genomu [57] . Moderní sekvenační techniky mohou sestavit proteinové sekvence s vysokou přesností kombinací de novo peptidového sekvenování , intenzity a pozičního skóre spolehlivosti získaných z vyhledávání homologů v databázi [58] .
Detekce a stanovení koncentrace specifických protilátek v krvi je poměrně běžnou metodou lékařské diagnostiky [59] . Například přítomnost viru Epstein-Barrové nebo bakterie Borrelia burgdorferi způsobující lymskou boreliózu v těle je dána titrem protilátek proti nim. Pokud se nepodařilo detekovat odpovídající protilátky, pak se pacient s těmito patogeny buď nikdy nesetkal, nebo se s nimi setkal velmi dlouho a plazmatické buňky produkující protilátky proti nim již vymizely [60] .
V klinické imunologii je profil protilátek pacienta charakterizován stanovením koncentrací protilátek různých tříd pomocí nefelometrie [61] . Zvýšení některých tříd protilátek může být užitečné při identifikaci příčin poškození jater , když nelze stanovit přesnou diagnózu. Zvýšený obsah IgA tedy ukazuje na alkoholickou cirhózu jater , zvýšení hladiny IgM hovoří ve prospěch virové hepatitidy a primární cirhózy jater a hladina IgG se zvyšuje u virových hepatitid, autoimunitních onemocnění a cirhózy [62 ] .
Rozvoj autoimunitních onemocnění je spojen s tvorbou protilátek, které rozpoznávají epitopy vlastního organismu (autoprotilátky). Lze je zjistit krevním testem. Protilátky, které působí proti povrchovým antigenům erytrocytů , způsobují hemolytickou anémii a lze je detekovat pomocí Coombsova testu . Coombsova reakce se provádí také při screeningu protilátek při krevních transfuzích a u těhotných žen [63] .
Principu interakce mezi antigeny a protilátkami využívají imunodiagnostické metody, jako je enzymatická imunoanalýza , imunofluorescenční analýza , Western blot , imunodifuze , imunoelektroforéza a magnetická imunoanalýza . Značení protilátek radioaktivním izotopem fluoru 18F umožňuje jejich použití pro vizualizaci rakovinných nádorů pomocí pozitronové emisní tomografie [64] .
Monoklonální protilátky se používají k léčbě revmatoidní artritidy [65] , roztroušené sklerózy [66] , psoriázy [67] a mnoha druhů rakoviny, včetně non-Hodgkinských lymfomů [68] , rakoviny tlustého střeva , rakoviny hlavy a krku a rakoviny prsu [69] .
Mnoho imunodeficiencí, jako je Brutonova choroba a hypogamaglobulinémie , je spojeno s úplnou nebo částečnou absencí protilátek [70] . Pacientům trpícím těmito onemocněními je zajištěna pasivní imunita umělým podáváním protilátek [71] .
U lidí je na červených krvinkách přítomen antigen známý jako Rh faktor (Rh). Při porodu nebo komplikacích v těhotenství se krev plodu může dostat do krevního oběhu matky, a pokud je dítě Rh pozitivní a matka negativní, pak se v těle matky tvoří protilátky proti Rh faktoru. V dalších těhotenstvích s Rh pozitivním plodem jej mohou napadnout, což vede k hemolytické žloutence novorozence [72] . Aby se zabránilo výskytu Rh konfliktu , Rh-negativním ženám, které jsou těhotné s Rh-pozitivním plodem, jsou uměle injikovány protilátky proti Rh faktoru ( Rho (D)-imunoglobulin ). Zavedení Rho(D)-imunoglobulinu musí být provedeno dříve, než fetální Rh faktor aktivuje mateřské B-buňky a spustí adaptivní imunitní odpověď a tvorbu paměťových B-buněk [73] .
Protilátky specifické pro daný antigen lze získat zavedením antigenu do savce (myši, potkana , králíka , kozy , ovce , koně ) a poté z něj izolací velkého množství protilátek. Krev izolovaná z imunizovaného zvířete obsahuje polyklonální protilátky , tj. několik různých protilátek specifických pro stejný antigen. Polyklonální protilátky lze také získat injekcí antigenu do vaječného žloutku vyvíjejícího se slepičího vejce [76] . K získání protilátek, které rozpoznávají přesně definovaný epitop ve složení antigenu, jsou plazmatické buňky, které vylučují protilátky proti antigenu, izolovány ze zvířete a imortalizovány jejich sloučením s rakovinnými buňkami . Buňky získané fúzí plazmatických buněk s rakovinnými buňkami se nazývají hybridomy a neustále vylučují požadované protilátky a množí se v buněčné kultuře. Z jednotlivých hybridomů se získají identické protilátky, nazývané monoklonální [77] . Polyklonální a monoklonální protilátky jsou často purifikovány pomocí proteinu A/G nebo afinitní chromatografie [78] .
Purifikované protilátky našly ve výzkumném procesu mnoho použití. Protilátky proti mnoha antigenům lze zakoupit od komerčních společností. Ve výzkumu se protilátky nejčastěji používají k lokalizaci buněčných a extracelulárních proteinů. Používají se také v průtokové cytometrii k separaci buněk na základě toho, které proteiny exprimují [79] . Protilátky se používají k separaci proteinů a jejich asociovaných molekul od zbytku buněčného lyzátu imunoprecipitací [80] , k identifikaci proteinů separovaných gelovou elektroforézou pomocí Western blotu [81] . Protilátky tvoří základ imunofluorescence a imunohistochemie , které studují expresi a lokalizaci zájmových proteinů v buňkách a tkáních [79] [82] . Protilátky lze použít k detekci a hodnocení koncentrace proteinů, zejména pomocí enzymové imunoanalýzy a metody ELISpot [83] [84] .
Přes četné aplikace je práce s protilátkami značně pracná, protože výsledek experimentu je ovlivněn mnoha faktory, které je třeba kontrolovat, zejména ovlivňující stupeň afinity protilátky k antigenu pH , rozpouštědlo, stav tkáně a ostatní. Bylo provedeno mnoho pokusů zlepšit způsob, jakým výzkumníci ověřují protilátky [85] [86] . Výzkumníci pracující s protilátkami musí pečlivě zaznamenat experimentální podmínky, aby je mohli reprodukovat další vědci [87] .
Mimetika protilátek jsou organické sloučeniny , které, stejně jako protilátky, mohou specificky vázat antigeny. Mimetika protilátek jsou zpravidla umělé peptidy s hmotností 3 až 20 kDa. Někdy nukleové kyseliny a malé molekuly působí jako mimetika protilátek, ale nemohou to být umělé protilátky, fragmenty protilátek nebo jejich kovalentně spojené kombinace. Na rozdíl od protilátek mají jejich mimetika obecně lepší rozpustnost, lepší penetraci tkání, větší stabilitu vůči teplotě a enzymům a jsou levnější než skutečné protilátky. Některá mimetika protilátek, jako je Affimer a DARPin , jsou registrována pro použití ve výzkumných, terapeutických a diagnostických aplikacích [88] .
Termín "protilátka" ( německy: Antikörper ) se poprvé objevuje ve spisech Paula Ehrlicha . Zejména termín „ Antikörper “ lze nalézt v závěru jeho článku „Experimentální studie imunity“, který vyšel v říjnu 1891. Tato práce uvádí, že „pokud dvě látky způsobují uvolňování dvou různých Antikörper, pak jsou také různé.“ Termín Antikörper se však zpočátku neujal a pro protilátky bylo navrženo několik dalších termínů: Immunkörper, Amboceptor, Zwischenkörper, substance sensibilisatrice, kopula, Desmon, filocytáza, fixateur a Immunisin [89] .
Studium protilátek začalo v roce 1890, kdy Kitasato Shibasaburo a Emil Adolf von Behring popsali účinky protilátek proti záškrtu a tetanovému toxinu [90] . Shibasaburo vyvinul teorii humorální imunity a navrhl, že v krevním séru existuje určitý mediátor, který může interagovat s cizími antigeny [91] . Na základě myšlenek Sibasabura předložil Paul Ehrlich v roce 1897 teorii postranních řetězců , vysvětlující principy interakce protilátek a antigenů. Navrhl, že receptory („boční řetězce“) na buněčném povrchu mohou specificky interagovat s toxiny podle principu „key-lock“ a interakce receptoru s toxinem spouští produkci protilátek [92] . Jiní vědci navrhli, že protilátky se volně pohybují krevním řečištěm. V roce 1904 Almroth Wright navrhl, že protilátky pokrývají povrch bakteriálních buněk a nasměrují je k fagocytóze a destrukci; tento proces je nyní známý jako opsonizace [93] .
Ve 20. letech 20. století byli Michael Heidelberg a Oswald Avery schopni pozorovat, že antigeny mohou být precipitovány protilátkami, a ukázali, že protilátky jsou proteinové [94] . Biochemické rysy interakce protilátek a antigenů byly podrobně studovány koncem 30. let 20. století Johnem Marrakem [95] . V roce 1937 byly imunoglobuliny jako druh proteinů identifikovány gelovou elektroforézou ve frakcích γ- a β-globulinů krevního séra [90] . Ve 40. letech 20. století Linus Pauling potvrdil Ehrlichovu hypotézu o interakci mezi antigeny a protilátkami typu lock-and-key a ukázal, že interakce mezi protilátkou a antigenem závisí více na prostorové konfiguraci antigenu než na jeho chemickém složení [96] . V roce 1948 Astrid Fagreus prokázala, že protilátky jsou vylučovány plazmatickými buňkami, typem B-lymfocytů [97] .
Další výzkum byl zaměřen na studium struktury protilátek. Na začátku 60. let Gerald Edelman a Joseph Galli popsali lehký řetězec protilátky [98] a ukázali, že lehký řetězec je protein Bence Jones , který popsal Henry Bence Jones v roce 1845 [99] . Později Edelman ukázal, že protilátky se skládají ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců držených pohromadě disulfidovými vazbami. Přibližně ve stejnou dobu popsal Rodney Porter oblasti Fab a Fc v molekulách IgG [100] . Společně tito výzkumníci popsali strukturu a kompletní aminokyselinovou sekvenci IgG, za což jim byla v roce 1972 udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu [100] . Fragment Fv byl vyčištěn a popsán Davidem Givolem [101] . Časný výzkum protilátek se zaměřil na IgG a IgM a v 60. letech byly identifikovány nové izotypy imunoglobulinů. Thomas Tomashi popsal vylučované protilátky IgA [102] , David Rove a John Fey objevili IgD [103] a Kimishige Ishizaka a Teruko Ishizaka objevili IgE a zjistili, že tyto protilátky se podílejí na rozvoji alergických reakcí [104 ] . V roce 1976 Suzumi Tonegawa zahájil sérii experimentů, které ukázaly, že geny kódující protilátky procházejí přeskupením, které vytváří obrovské množství protilátek [105] . V roce 1987 obdržel Tonegawa Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu za objev mechanismů diverzity protilátek [106] .
V 70. letech 20. století byla v důsledku studia homogenních nádorových antigenů vyvinuta technologie hybridomů, díky níž bylo možné získat monoklonální protilátky s danou specificitou [3] .
Slovníky a encyklopedie | |
---|---|
V bibliografických katalozích |
Protilátky | |
---|---|
Podmínky | |
Třídy protilátek |
Lymfocytární adaptivní imunitní systém a komplement | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Lymfoidní |
| ||||||||
Lymfocyty | |||||||||
Látky |