Bisulfitové sekvenování je obecný název pro skupinu metod zaměřených na studium vzoru methylace DNA jejím zpracováním bisulfitem .
Methylace je první epigenetické značení, které bylo objeveno. Ovlivňuje úroveň genové exprese potlačením transkripční aktivity. Kromě toho je v mnoha případech methylace dědičná [1] [2] , což dodává jejímu studiu další zajímavost.
Bisulfit působí na jednovláknovou DNA , přeměňuje cytosin na uracil [3] . Pokud je tento cytosin methylován, to znamená, že k jeho pátému atomu uhlíku je připojena methylová skupina , pak takový cytosin nepodléhá transformaci. Bisulfit tedy mění sekvenci DNA v závislosti na svém methylačním vzoru a po expozici je možné určit, které dinukleotidy CpG byly methylovány porovnáním změněné sekvence s původní.
Níže popsané způsoby používají sekvenování oblastí DNA ošetřených bisulfitem ke stanovení methylačního vzoru. Existují také metody, které nejsou založeny na sekvenování, jako je kombinovaná bisulfitová restrikční analýza ( COBRA ) a imunoprecipitace methylované DNA ( MeDIP ). Úkoly studia metylačních vzorců mohou spočívat jak ve studiu metylace konkrétního cytosinu, tak ve stanovení podílu metylovaných cytosinů v určité oblasti DNA nebo dokonce v celém genomu jako celku. Z následujících metod jsou některé vhodnější pro studium specifických methylačních míst, zatímco jiné jsou vhodnější pro studium metylace na vyšších úrovních. V ideálním případě by měla být stanovena methylace každé alely . Několik přehledů [4] [5] [6] [7] [8] je věnováno popisu metod bisulfitového sekvenování .
První metoda bisulfitového sekvenování byla popsána v roce 1992 [9] . Ke stanovení metylačního vzoru byla použita PCR, jejíž primery byly specifické pro modifikovanou i nezměněnou DNA bisulfitem, to znamená, že neobsahovaly cytosiny obsažené v CpG dinukleotidech . Pro primery byly použity oblasti blízko methylačního místa zájmu, ale neobsahující je. V případě, že cytosin nebyl methylován, thymin ( uracil ) byl nalezen v amplifikované sekvenci a adenin byl nalezen v syntetizované komplementární sekvenci . Pokud byl cytosin methylován, pak zůstal v amplifikované sekvenci a guanin byl syntetizován v komplementární sekvenci . Tato metoda je velmi pracná, protože vyžaduje klonování produktů PCR k dosažení požadované citlivosti. Stejný problém lze vyřešit pomocí nested PCR .
Při pyrosekvenování se používá PCR s primery, které amplifikují jak pozměněnou, tak nemodifikovanou DNA bisulfitem. Poměr počtu methylovaných a nemethylovaných cytosinů v amplifikovatelné sekvenci je určen poměrem počtu nukleotidů A a G v syntetizované komplementární sekvenci [10] [11] .
Dalším vylepšením této metody je použití alelově specifických primerů s jednonukleotidovými polymorfismy , které umožňují studium metylačních vzorů odděleně v otcovských a mateřských alelách, což je zvláště užitečné při studiu genomového imprintingu [12] .
Tato metoda je založena na metodě analýzy jednořetězcového konformačního polymorfismu ( SSCA ) . SSCA byl vyvinut k detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNP) [13] . Fragmenty DNA stejné délky, ale různé nukleotidové sekvence, se při elektroforéze pohybují různými rychlostmi . Obecně řečeno, SSCA není dostatečně citlivá na detekci jediné substituce, ale s dostatečným počtem polymorfismů nemethylovaných CpG dinukleotidů v bisulfitově ošetřené a neošetřené DNA bude dostačující, že citlivost metody je dostatečná pro stanovení podílu methylované cytosiny v uvažované oblasti. Tato metoda neumožňuje studovat metylaci na určitém místě, ale dává představu o metylaci na úrovni určité oblasti nebo dokonce celého genomu.
High Sensitivity Melting Method [ (HRM) je založena na real-time PCR [14] . Teplota se zvýší z 55 na 95 °C, v důsledku čehož jsou komplementární vazby mezi řetězci zničeny. Rychlost tání se zaznamenává pomocí speciálních fluorescenčních barviv a při znalosti závislosti fluorescence na nukleotidové sekvenci řetězců lze rozlišit jednonukleotidové polymorfismy. Metoda neposkytuje informace o tom, které CpG dinukleotidy byly přesně methylovány, a tudíž se během bisulfitového ošetření nezměnily, poskytuje však poměrně přesné informace o jejich množství v zájmové oblasti.
Metoda extenze s jedním nukleotidovým primerem byla původně vyvinuta pro analýzu jednonukleotidových polymorfismů [15] . Ve vztahu k analýze methylace se používá následovně. Na bisulfitově ošetřené jednořetězcové DNA se primery nasedají na pár bází bezprostředně předcházející požadovanému methylačnímu místu. Primer je pak prodloužen DNA polymerázou pomocí dideoxynukleotidů , které jej ukončují . Poměr počtu methylovaných a nemethylovaných cytosinů v počáteční sekvenci je určen poměrem počtu extenzí primerů s G a A nukleotidy, v daném pořadí. Poměr počtu methylovaných a nemethylovaných cytosinů v počáteční sekvenci lze určit různými způsoby. Používají se radioaktivní nebo fluorescenční značky , stejně jako pyrosekvenování [16] .
Navíc to lze provést pomocí matrice asistované laserové desorpce / ionizace s následným použitím hmotnostního analyzátoru doby letu (MALDI-TOF) nebo vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi s iontovými páry (IP-RP- HPLC) [17] .
Metoda je založena na využití specifického štěpení RNA [18] . Když je k primeru v PCR přidán promotor RNA polymerázy in vitro , syntetizuje se RNA transkript oblasti zájmu , načež je štěpen ribonukleázou A. Ribonukleáza A štěpí jednovláknovou RNA v místech nukleotidů C a U. Pomocí nukleosidtrifosfátů dUTP a dCTP odolných vůči štěpení lze dosáhnout specifického štěpení v místech C nebo Y. Fragmenty RNA jsou pak analyzovány pomocí MALDI - TOF . Tato metoda poskytuje informace o methylaci každého z dostupných CpG dinukleotidů a nejen o podílu methylovaných nukleotidů.
Tato metoda využívá primery, které jsou specifické buď pouze pro bisulfitově transformovanou DNA, nebo pouze pro netransformovanou DNA [19] . V souladu s tím jsou k prvním primerům připojeny pouze oblasti, které byly methylovány, a ty, které nebyly methylovány, jsou připojeny k druhým primerům, což eliminuje potřebu sekvenovat oblasti po amplifikaci.
DNA amplifikovaná v MSP může být dále analyzována různými jinými metodami. Metoda MethyLight využívá MSP v reálném čase na základě fluorescence] [20] . Mc-MSP využívá analýzu křivky tání [21] . Vysoce citlivá metoda tavení používá obojí, a je tedy dostatečně citlivá na detekci nízké úrovně methylace [22] .
Použití DNA microarrays umožňuje rozšířit výše popsané metody pro analýzu metylace na úrovni celého genomu [23] . Oligonukleotidy DNA microarray jsou vytvořeny specifické pro methylaci a odpovídají požadovaným CpG místům. Některé jsou komplementární k bisulfitově změněné sekvenci (tj. té, ve které CpG místo nebylo methylováno), zatímco jiné nikoli. Příkladem takového způsobu je Illumina methylační test .
Metody bisulfitového sekvenování mají řadu omezení. U savců je rozšířená modifikace DNA 5-hydroxymethylcytosin. Při ošetření bisulfitem se 5-hydroxymethylcytosin přemění na cytosin-5-methylsulfonát, který je sekvenováním identifikován jako C. Bisulfitové sekvenování tedy nemůže rozlišit mezi 5-hydroxymethylcytosinem a methylcytosinem , a proto nemůže být považováno za metodu citlivou pouze k methylaci DNA. V roce 2012 byla vyvinuta metoda bisulfitového sekvenování k rozlišení těchto dvou modifikací [24] .
Protože neúplná konverze dusíkatých bází v DNA bisulfitem, která je možná pouze u jednovláknové DNA, dává nesprávné výsledky, je pro udržení DNA v denaturovaném stavu nezbytný přesný výběr experimentálních podmínek ( teplota , koncentrace soli) [4]. . Udržení jednovláknové konformace DNA může být usnadněno její fixací v agarózovém gelu [25] .
Dalším problémem je degradace DNA při ošetření bisulfitem. Jelikož bisulfit působí pouze na jednovláknovou DNA, je nutné reakci provádět za podmínek, ve kterých by DNA zůstala jednovláknová, a provádět ji po dobu dostatečnou pro úspěšnou konverzi. Takové podmínky, zejména vysoká teplota a dlouhá inkubační doba, však mohou vést k degradaci až 90 % veškeré DNA [26] .