Otevřený chromatin ( anglicky open chromatin ) - malé oblasti chromatinu , bez nukleozomů [1] . Výsadbě nukleozomů obecně brání proteinové faktory spojené s chromatinem, které rozpoznávají určité sekvence DNA . Tyto proteiny zahrnují transkripční faktory , DNA nebo RNA polymerázy . Otevřený chromatin se často shoduje s cis-regulačními sekvencemi , jmenovitě: promotory , zesilovače , izolátory , tlumiče, místa počátku replikace DNA [2] . Velikost otevřených úseků chromatinu je obvykle několik set párů bází , v průměru asi 300 bp [3] .
Otevřený chromatin se nejčastěji stanovuje metodou citlivosti DNázy. Oblasti chromatinu bez nukleozomů jsou přednostně atakovány DNázou I , když jsou s ní ošetřeny permeabilizované buňky nebo izolovaná jádra . V tomto ohledu je otevřený chromatin často označován jako hypersenzitivní místa DNázy I nebo hypersenzitivní místa . Pravděpodobnost štěpení DNA nukleázou v hypersenzitivních místech může stokrát a dokonce tisíckrát překročit průměr. Hypersenzitivita na otevřenou chromatin DNázu I by měla být odlišena od zvýšené obecné DNázové senzitivity aktivně transkribovaných genů [4] .
V závislosti na typu proteinových faktorů, jejichž vazba na DNA brání přistání nukleozomů, mohou být oblasti hypersenzitivního chromatinu na DNázu I tkáňově specifické nebo konstitutivní, tj. přítomné v buňkách diferencovaných různými cestami.
K mapování oblastí otevřeného chromatinu se využívá DNázová senzitivita ( DNáza I hypersensitivní ) a izolace regulačních prvků pomocí formaldehydu . formaldehydem asistovaná izolace regulačních prvků (FAIRE) [1] . Metoda citlivosti na DNázu neumožňuje určit, které regulační místo je tato oblast otevřeného chromatinu [1] .
Dříve byla analýza výsledků metody citlivosti na DNázu prováděna pomocí hybridizace Southern blot ( angl. Southern blot ). To nám neumožnilo analyzovat velké množství lokalit, stejně jako najít nová místa přecitlivělosti. Analýza citlivosti na DNázu může být také provedena pomocí PCR v reálném čase (kvantitativní PCR). To je mnohem jednodušší než hybridizace Southern blot, ale tato metoda má také omezený počet míst pro analýzu a nelze ji použít pro celogenomovou studii distribuce míst citlivosti DNázy I [5] .
Vývoj vysoce výkonného sekvenování a metod DNA - microarray umožňuje mapovat otevřené chromatinové oblasti v celém genomu [ 6 ] . Navíc kombinace metody citlivosti na DNázu s metodou Chromatin immunoprecipitation ( ChIP ) s následným vysoce výkonným sekvenováním poskytuje více informací o vazbě specifických transkripčních faktorů na aktivní místa chromatinu [1] .
Dalším způsobem, jak zmapovat oblasti otevřeného chromatinu, je provést imunoprecipitaci chromatinu ( ChIP ) pro protilátky proti histonům . Současně by otevřené chromatinové oblasti měly být špatně zastoupeny, protože s nimi nejsou spojeny nukleozomy. Metoda citlivosti na DNázu a histonová imunoprecipitace poskytují podobné výsledky [7] .
V eukaryotických genomech jsou zvláště důležité nekódující sekvence zapojené do regulace genové exprese v různých stádiích vývoje organismu nebo v různých tkáních. Objev a charakterizace regulačních oblastí se stává zásadní pro pochopení vzorců v genové expresi [5] . Takže v lidském genomu je více než 95 % DNA nekódujících . Tato třída sekvencí, kromě nevyžádané DNA , zahrnuje důležité regulační sekvence: promotory, zesilovače, tlumiče, izolátory nebo kontrolní lokusy ( locus control areas (LCR) ) . Konsorcium ENCODE prokázalo, že hypersenzitivní místa DNázy I identifikovaná v 1 % lidského genomu jsou markery modifikací histonů , místa časné replikace , místa začátku transkripce a vazebná místa transkripčního faktoru [8] . Otevřený chromatin je také často spojen s aktivně transkribovanými nekódujícími RNA [8] .
Kromě nekódujících regulačních sekvencí je otevřený chromatin také asociován s exony a introny aktivně transkribovaných genů. Zvláště často se takové oblasti otevřeného chromatinu shodují s prvním exonem a intronem genu [5] . Přítomnost otevřeného chromatinu však není dostatečnou podmínkou pro aktivitu genu. Netranskribované geny spojené s otevřeným chromatinem jsou ve stavu „připravenosti“ pro transkripci ( anglicky poised state ) [5] . Pro regulaci genové exprese je tedy důležitý vznik otevřeného chromatinu nebo přechod do neaktivního stavu.
Nejen vazebná místa transkripčních faktorů a dalších regulačních proteinů mohou být bez nukleozomů. Některé sekvence DNA nejsou schopny se obalit kolem nukleozomálních globulí. Jsou to sekvence, které mají sníženou flexibilitu, a sekvence, které mají tendenci vytvářet nekanonické struktury, jako jsou vlásenky [9] .
Snímek obrazovky UCSC Browser ukazuje kolokalizaci místa shluků hypersenzitivity DNaseI s promotory dvou genů. Oblasti otevřeného chromatinu jsou obklopeny H3 [ histony acetylovanými na 27. lysinovém zbytku ( H3K27Ac), což je značka pro aktivní regulační oblasti chromatinu, jako jsou promotory a zesilovače. V oblasti hypersenzitivního místa DNázy se navíc nachází vazebné místo pro mnoho transkripčních faktorů, mezi nimiž lze nalézt konzervovaný transkripční iniciační faktor TBP (je hlavní součástí TFIID ). Můžete si také všimnout časté vazby v této oblasti RNA polymerázy II , která u lidí provádí transkripci genů kódujících proteiny . Toto místo přecitlivělosti na DNázu je charakterizováno zvýšeným konzervatismem mezi savci ( Eng. Mammal Cons ), což znamená, že tato sekvence je během evoluce zachována , a v důsledku toho její funkční význam [8] .
K tvorbě oblastí bez nukleozomů dochází působením speciálních faktorů, které provádějí skládání, rozkládání a pohyb nukleozomů. Proces změny polohy nukleozomů se nazývá remodelace chromatinu . Zahrnuje komplexy remodelace chromatinu - konzervativní proteinové komplexy, které pracují se spotřebou energie ATP . Remodelace chromatinu se provádí po zavedení určitých epigenetických značek - modifikace histonů nebo metylace DNA . Pokud značky odpovídají aktivnímu chromatinu (například acetylovaný 9. lysin histonu H3, di- a trimethylovaný 4. lysin histonu H3 a mnoho dalších), pak se tvoří oblasti otevřeného chromatinu. Profil modifikací histonů má často definitivní distribuci kolem místa hypersenzitivity DNázy I [5] .
Vysoce účinné metody umožňují porovnat distribuci otevřených oblastí chromatinu v různých tkáních nebo buněčných kulturách ze stejného organismu. Takové srovnání odhalí významný rozdíl v distribuci takových oblastí v genomu [5] . To ukazuje na různou aktivitu takových míst v různých tkáních. Promotor a zesilovač genu tedy mohou být umístěny v otevřené oblasti chromatinu v jedné tkáni a mohou být uzavřeny nukleozomy v jiné. To ukazuje na různou genovou expresi v různých tkáních a je nejcharakterističtější pro tkáňově specifické geny . Naopak geny nacházející se v otevřené oblasti chromatinu ve všech tkáních a buněčných liniích se obvykle označují jako provozní geny . Profil citlivosti na DNázu se může také měnit během vývoje a diferenciace buněk. K identifikaci aktivity tkáňově specifických genů použijte definici genové ontologie ( angl. Gene Ontology (GO) ) po provedení DNase-seq [5] .