Xist ( anglicky X-inactive specific transcript ) je gen kódující RNA a lokalizovaný na chromozomu X placentárních savců , je klíčovým efektorem při inaktivaci chromozomu X [1] . Je součástí komplexu Xic ( X - chromozom inactivation center ) [2] , spolu s dalšími dvěma geny kódujícími RNA ( Jpx a Ftx ) a dvěma geny kódujícími protein ( Tsx a Cnbp2 ) [3 ] . Produkt genu Xist, Xist-RNA, je velký transkript (17 kb u lidí ) [4] , který je exprimován na neaktivním chromozomu a není exprimován na aktivním chromozomu. Zpracování tohoto transkriptu se podobá zpracování mRNA a zahrnuje také kroky sestřihu (včetně alternativy [1] ) a polyadenylaci , ale zůstává v jádře a nepřekládá se . Bylo navrženo, že gen Xist vznikl alespoň zčásti jako součást genu kódujícího protein, který se později stal pseudogenem [5] . Inaktivovaný chromozom X je potažen Xist RNA, která je nezbytná pro proces inaktivace [6] . Chromozom X postrádající gen Xist nebude inaktivován, ale duplikace tohoto genu na jiném chromozomu způsobí inaktivaci i prvního chromozomu [7] .
Inaktivace chromozomu X, ke které dochází na počátku vývoje samic placentárních savců, poskytuje umlčení na transkripční úrovni jednoho ze dvou chromozomů X, což zajišťuje dávkovou rovnost (tj. v počtu aktivních variant jednoho genu) samic. a muži (viz další podrobnosti). " Kompenzace dávky "). Funkční role Xist-RNA byla jasně prokázána v samičích myších embryonálních kmenových buňkách . V těchto experimentech zavedení 19 nt antisense RNA zacílené na Xist RNA do buněk zabránilo tvorbě Xic a cis -umlčování X-vázaných genů. Později se však ukázalo, že k inaktivaci chromozomu X u myší stále dochází i v nepřítomnosti genu Xist prostřednictvím epigenetické regulace, ale ke stabilizaci takového umlčení je nezbytná Xist RNA [8] .
Bylo prokázáno, že gen Xist interaguje s genem BRCA1 spojeným s rakovinou prsu [9] [10] .
U lidí je gen Xist umístěn na dlouhém (q) rameni X chromozomu. Zahrnuje velký počet repetic [4] a skládá se z A-oblasti obsahující 8 repetic oddělených U - spacery . Oblast A obsahuje dvě velké vlásenky , z nichž každá obsahuje 4 repetice [11] . Ortolog genu Xist u lidí byl identifikován u myší a je dlouhý 15 kb, ale neobsahuje konzervované repetice [12] .
Xist-RNA se skládá ze dvou oblastí: A a C. Konzervativní oblast A obsahuje až 9 opakujících se prvků [11] . Nedávno se ukázalo, že u myší a lidí se A-region Xist-RNA skládá ze dvou dlouhých vlásenek, z nichž každá obsahuje čtyři repetice [4] [11] . Ačkoli specifická funkce oblasti A není známa, ukázalo se, že je nezbytná pro účinnou vazbu na protein Suz12 [11] .
Vazba Xist-RNA na inaktivovaný X-chromozom se provádí přes vazebné místo pro chromatin umístěné na samotném transkriptu. Poprvé bylo takové místo na Xist-RNA popsáno u samičích myších fibroblastů. Ukázalo se, že je lokalizován v oblasti C-repetice. Výše uvedené experimenty se zavedením 19nukleotidové antisense RNA komplementární k Xist do buněk narušily vazbu tohoto transkriptu na histon H2A [13] .
Jak bylo uvedeno výše, gen Xist-RNA je součástí centra inaktivace Xic ( X Inactivation Center ) [14] . Xic je lokalizován na rameni q chromozomu X (Xq13). Klíčovou roli v inaktivaci chromozomu X hraje promotor Xist, který je součástí Xic [15] . Kromě genu Xist zahrnuje Xic také gen Tsix , který je antisense vzhledem k Xist. Antisense transkripty genu Xist působí jako cis -regulátory transkripce Xist a snižují expresi tohoto genu. Mechanismus takové cis -regulace exprese Xist pomocí Tsix je stále špatně pochopen, ačkoli existuje několik vysvětlujících hypotéz. Podle jednoho z nich se Tsix podílí na modifikaci chromatinu na lokusu Xist [16] (podrobněji viz níže).
Předpokládá se, že antisense transkript Tsix aktivuje methyltransferázy DNA , které metylují promotor Xist, což vede k downregulaci tohoto promotoru, a tím k expresi genu Xist [17] . Role acetylace histonů v regulaci Xist byla prokázána [18] .
Je možné, že dvouvláknové RNA a interferující RNA také hrají roli v regulaci promotoru Xist. Zdá se, že enzym Dicer , který se specializuje na řezání dvouřetězcových RNA, štěpí duplex Xist a Tsix na začátku procesu inaktivace chromozomu X, což vede k tvorbě krátkých RNA o délce asi 30 nukleotidů (xiRNA). Očekává se, že tyto xiRNA potlačí Xist na chromozomu X, který zůstává aktivní. Tento předpoklad je potvrzen experimentem, ve kterém bylo množství endogenního Diceru v nediferencovaných buňkách sníženo o 5 %, což vedlo ke zvýšení Xist v těchto buňkách [19] .
Zdá se, že transkripční faktory pluripotentních buněk Nanog , Oct4 a Sox2 hrají roli v umlčování genu Xist. V nepřítomnosti Tsix v pluripotentních buňkách je však Xist také potlačován. Možným vysvětlením toho může být, že výše uvedené faktory způsobují sestřih na intronu 1 ve vazebném místě těchto faktorů v genu Xist, v důsledku čehož je místo zničeno a exprese Xist je potlačena [16] . V pluripotentních buňkách postrádajících Nanog nebo Oct4 se hladina exprese Xist zvýšila [20] .
Ukázalo se , že úloha polycomb represorového komplexu 2 PRC2) hraje roli v umlčování Xist nezávisle na Tsix, ačkoli konkrétní mechanismy pro toto nejsou známy. PRC2 je třída polycomb proteinů , které způsobují trimethylaci histonu H3 na lysinu 27 (K27), který potlačuje transkripci přeskupením chromatinu. Výše uvedený protein Suz12 patří do skupiny PRC2 a má doménu zinkového prstu , která se zdá, že se váže na molekulu RNA [21] .
Proces inaktivace chromozomu X začíná šířením Xist RNA z Xic po celém chromozomu , kde se zdá, že Xist RNA vyvolává tvorbu a expanzi oblasti heterochromatinu . Heterochromatin inaktivovaného chromozomu X je charakteristický nejen svou asociací s Xist-RNA, ale také přítomností speciální varianty histonu H2A (macroH2A), hypoacetylací histonů H3 a H4 , ubikvitinací histonu H2A a metylací specifických poloh na histonu H3, stejně jako methylace DNA. Právě kombinace těchto modifikací činí většinu inaktivovaného chromozomu X extrémně odolnou vůči transkripci. Kromě toho schopnost těchto modifikací samo se šířit udržuje inaktivovaný stav chromozomu X pro mnoho buněčných dělení . Je však třeba poznamenat, že asi 10 % genů na chromozomu X zůstává transkripčně aktivních [22] .
Exprese Xist a inaktivace chromozomu X se během embryonálního vývoje mění . U myší v raném embryonálním vývoji existují dvě vlny inaktivace X-chromozomu. První vlna nastává před vytvořením blastocysty a není náhodná - v buňkách embrya je chromozom X přijatý od otce inaktivován, to znamená, že inaktivace chromozomu X v této fázi je otištěna . Ve stádiu blastocysty , v buňkách vnitřní buněčné hmoty , ze které se následně tvoří všechny orgány a tkáně budoucího organismu, je tento otisk odstraněn, exprese Xist mizí, inaktivace otcovského chromozomu X je zrušena a oba chromozomy X stát se transkripčně aktivní. Nedávná data ukázala, že antisense transkripty se podílejí na reaktivaci chromozomu X [23] . V epiblastových buňkách, které se dále tvoří , začíná proces diferenciace a nastává druhá vlna inaktivace, ve které je výběr inaktivovaného chromozomu X náhodný. Xist se začíná vyjadřovat na jednom z chromozomů X a tento chromozom X vstupuje do procesu inaktivace. Díky náhodnému výběru inaktivovaného chromozomu X je každý ženský organismus mozaikou klonálních skupin buněk, ve kterých je inaktivován buď chromozom X zděděný po otci, nebo chromozom X zbylý po matce. Inaktivace chromozomu X je zachována po tisíce buněčných dělení [22] a pouze u vyvíjejících se gonocytů dochází ke snížení exprese Xist a reaktivaci chromozomu X [24] . V myších extraembryonálních tkáních přetrvává v průběhu celého embryonálního vývoje vtisknutá inaktivace otcovského chromozomu X, ke které došlo během první vlny inaktivace.
V mechanismu kompenzace dávkování hraje klíčovou roli inaktivace chromozomu X , která zajišťuje rovnost dávek genových produktů chromozomu X u obou pohlaví [22] [25] . U různých druhů je kompenzace dávek zajištěna různými způsoby, ale u všech těchto způsobů se regulace exprese X-chromozomu odehrává u jednoho ze dvou obou pohlaví [25] . Pokud jeden ze dvou chromozomů X není inaktivován nebo je exprimován pouze částečně, může být výsledná nadměrná exprese X letální [22] .
U lidí způsobují mutace v promotoru Xist familiární nenáhodnou inaktivaci chromozomu X [1] .
V roce 2013 se ukázalo, že zavedení genu Xist do jednoho z 21 chromozomů kmenové buňky s trizomií na 21. chromozomu (příčina Downova syndromu ) umožňuje tento chromozom inaktivovat. Gen Xist tak může tvořit základ nového přístupu k léčbě Downova syndromu [26] .