Bakteriální sekreční systémy jsou proteinové komplexy umístěné v bakteriální buněčné membráně a používané k sekreci různých proteinů . Zejména je používají patogenní bakterie k izolaci faktorů virulence . Podle složení, struktury a působení sekrečního systému se dělí na několik typů. Nejzásadnější rozdíly jsou pozorovány mezi sekrečními systémy grampozitivních a gramnegativních bakterií. Existuje nejméně šest typů sekrečních systémů specifických pro gramnegativní bakterie, čtyři typy sekrečních systémů jsou jedinečné pro grampozitivní bakterie a dva typy sekrečních systémů se nacházejí u obou skupin bakterií [1] .
Sekreční systémy typu Sec a Tat se nacházejí u grampozitivních a gramnegativních bakterií, stejně jako u archaeí a eukaryot . Přestože systémy Sec a Tat mají některé společné komponenty, způsob jejich práce se zásadně liší. Oba systémy jsou navrženy tak, aby byly vylučovány přes buněčnou membránu. U gramnegativních bakterií mohou být proteiny dodané systémy Sec nebo Tat do buněčné membrány nebo periplazmatického prostoru (periplazmy) uvolněny z buňky jinými sekrečními systémy [1] .
Převážně nesbalené proteiny jsou transportovány systémem Sec . Specifické nosné proteiny se vážou v cytoplazmě na cílové proteiny, které mají vhodný sekreční signál na N-konci . Skládá se z 20 aminokyselinových zbytků a obsahuje tři oblasti: kladně nabitý N-konec, hydrofobní oblast jádra a polární C-konec . Nosné proteiny dodávají cíle motorickým proteinům , které vytlačují vylučované proteiny ven přes kanál SecYEG. Některé grampozitivní bakterie mají další proteiny systému Sec. Systém Sec se používá k izolaci faktorů virulence pro gramnegativní patogenní bakterie, jako jsou Vibrio cholerae , Klebsiella pneumoniae a Yersinia enterocolitica . Příklady grampozitivních bakterií, které používají systém Sec k izolaci faktorů virulence, jsou Staphylococcus aureus a Listeria monocytogenes . Proteiny určené k uvolnění do periplazmy nebo extracelulárního prostředí jsou vylučovány systémem SecB. Proteiny určené pro vnitřní membránu jsou vylučovány systémem SRP. Systémy podtypů SecB a SRP rozpoznávají různé signální sekvence [1] .
SecBCílové proteiny systému SecB mají signální sekvenci, která je rozpoznána proteinem SecB plovoucím v cytoplazmě. Funguje jako chaperon , který zabraňuje skládání cílových proteinů. SecB dodává cílové proteiny proteinu SecA, který je protlačuje kanálem SecYEG pomocí energie hydrolýzy ATP , která sama katalyzuje . Proteiny, které se musí uvolnit do vnějšího prostředí, jsou vylučovány systémy typu II nebo V [1] .
SRPSystémy SRP dodávají cílové proteiny do buněčné membrány. Transmembránové proteiny , které jsou cíli systému SRP, mají hydrofobní oblasti, a proto jsou v cytoplazmě nestabilní. Proto v dráze SRP dochází k sekreci proteinu kotranslačně: syntetizovaná oblast polypeptidového řetězce je tlačena do kanálu SecYEG, zatímco ribozom překládá zbytek proteinu. Tento mechanismus vyžaduje částice rozpoznávající signály ( signal recognitionarticulate, SRP ) . SRP se vážou na transmembránovou oblast proteinu, jakmile opustí ribozom. SRP pak interaguje s proteinem FtsY, který dodává komplex mRNA , ribozomu a částečně syntetizovaného polypeptidu do kanálu SecYEG. Dále souběžně probíhá postupná sekrece proteinu a translace jeho zbývající části a nakonec se protein ukotví svou transmembránovou doménou v buněčné membráně [1] .
Na rozdíl od dráhy Sec vylučuje dráha Tat převážně složené proteiny. Zpravidla se jedná o proteiny, které ke svému fungování vyžadují specifické posttranslační modifikace , které lze získat pouze v cytosolu . Systém Tat zahrnuje tři proteiny: TatA, TatB a TatC, přičemž první dva u grampozitivních bakterií jsou spojeny do jediného proteinu. U Escherichia coli je signální peptid proteinů určených k sekreci rozpoznáván proteiny TatB a TatC a TatA tvoří membránový kanál . Signální peptid rozpoznávaný proteiny Tat je reprezentován sekvencí serin - arginin -arginin na N-konci proteinu. U grampozitivních bakterií zajišťuje systém Tat uvolňování proteinů do extracelulárního média, zatímco u gramnegativních bakterií proteiny, které prošly Tat, buď zůstávají v periplazmatickém prostoru, nebo opouštějí buňku sekrečními systémy typu II. Systém Tat je nezbytný pro plnou virulenci u některých patogenních bakterií, včetně Pseudomonas aeruginosa , Yersinia pseudotuberculosis a E. coli O157:H7 . U řady patogenů, jako je P. aeruginosa , Legionella pneumophila a Mycobacterium tuberculosis , je fosfolipáza C sekretována prostřednictvím systému Tat , který degraduje fosfolipidy a podílí se na potlačení aktivity imunitního systému [1] .
Některé patogenní gramnegativní bakterie mají specializované sekreční systémy, které přenášejí faktory virulence ven a někdy i do jiných eukaryotických nebo prokaryotických buněk . Mnoho proteinů, které jsou transportovány přes vnější membránu gramnegativních bakterií, vstoupilo do periplazmy cestou Sec nebo Tat. Některé sekreční systémy jsou reprezentovány jedním kanálem procházejícím dvěma membránami a periplazmatickým prostorem [1] .
Sekreční systém typu I zahrnuje jednostupňový přenos proteinu z cytosolu do extracelulárního prostředí kanálem procházejícím jak membránami, tak periplazmou. Kanály systémů typu I jsou velmi blízké ABC-transportérům , které odstraňují různé malé molekuly z buněk , jako jsou antibiotika a toxiny . Některé bakterie mají současně několik systémů typu I, z nichž každý je určen k sekreci jednoho nebo více proteinů. Proteiny vylučované systémy typu I jsou velmi rozmanité: jsou mezi nimi degradující enzymy , jako jsou proteázy a lipázy , adhezní molekuly , proteiny vázající hem . Ve většině případů mají cílové proteiny C-terminální signální peptid, který není odstraněn při sekreci [1] .
V typickém případě je sekreční systém I. typu organizován následovně. ABC transportér je umístěn v buněčné membráně, štěpí ATP a získává energii pro přenos proteinů. Interaguje s proteinem MPF, který prochází periplazmou a interaguje s proteinem OMF ve vnější membráně. N-konec MPF visí dolů do cytosolu a předpokládá se, že se podílí na rozpoznávání signálu. OMF tvoří ve vnější membráně pór, kterým prochází protein [1] .
Sekreční systémy typu I jsou nezbytné pro virulenci řady patogenních bakterií, jako jsou Vibrio cholerae a Serratia marcescens . Prostřednictvím tohoto systému navíc E. coli odstraňuje kolicin V a její uropatogenní kmeny pomocí systému typu I odstraňují hemolyzin, který ničí membrány eukaryotických buněk [1] .
Sekreční systémy typu II se podílejí na transportu proteinů z periplazmy do vnějšího prostředí. Cílové proteiny musí být předběžně dopraveny do periplazmy systémy Sec nebo Tat a také musí nést N-terminální signální peptidy, které mají být odstraněny, které jsou rozpoznávány systémy Sec a Tat. Cílové proteiny však musí být poskládány do periplazmy, než budou odstraněny systémy typu II. Systémy typu II odstraňují z buňky proteiny s různými funkcemi, ale většina z nich jsou enzymy: proteázy, lipázy, fosfatázy , enzymy, které působí na sacharidy . Sekreční systém typu II je tvořen 15 proteiny. Komplex ve vnější membráně tvoří multimerní protein sekretin. Jeho dlouhý N-konec interaguje s jinými proteiny systému lokalizovanými v buněčné membráně. V buněčné membráně je sekreční systém typu II reprezentován platformou alespoň 4 proteinů. Cytoplazma obsahuje ATPázu, která dodává energii do systému. Předpokládá se, že substrátové proteiny jsou protlačovány sekretinovým komplexem speciální proteinovou strukturou - pseudopilem, který je blízký pili typu IVV. cholerae uvolňuje toxin cholery prostřednictvím sekrečního systému typu IIa P. aeruginosa uvolňuje endotoxin A. Řada patogenů uvolňuje proteiny prostřednictvím sekrečního systému typu II, které jim pomáhají přizpůsobit se jejich prostředí. Mezi takové patogeny patří L. pneumophila , enterotoxigenní a enterohemoragické kmeny E. coli (ETEC a EHEC), K. pneumoniae , Aeromonas hydrophila a Dickeya dadantii [1] .
Sekreční systémy typu III byly velmi podrobně studovány [2] . Zajišťují sekreci různých proteinů přes membrány i periplazmu. Ve většině případů sekreční systémy typu III dodávají substráty přímo do eukaryotické buňky, to znamená, že transportují proteiny přes tři membrány najednou. Substráty systémů typu III se nazývají efektorové proteiny. Některé patogeny, jako jsou Pseudomonas a Yersinia , vylučují pouze několik efektorových proteinů a Shigella - několik desítek. Substrátové proteiny mají N-koncový signální peptid, který nelze odstranit. Mnoho efektorových proteinů interaguje s chaperony před sekrecí a jsou vylučovány v rozvinutém stavu s výdejem energie ATP [1] .
Sekreční systém typu III zahrnuje 9 jádrových proteinů a osm z nich souvisí s bičíkem , který tvoří bakteriální bičík . Kromě 9 základních proteinů obsahuje systém typu III 10 až 20 dalších proteinů, z nichž některé jsou kritické pro fungování systému. Proteiny systémů typu III jsou kódovány několika operony umístěnými buď na plazmidech nebo v ostrůvcích patogenity na bakteriálním chromozomu . Systémy typu III jsou přenášeny mezi bakteriemi prostřednictvím horizontálního přenosu genů, a proto se často vyskytují u nepříbuzných druhů [1] .
Strukturálně lze v systému typu III rozlišit bazální komplex, jehlicovou komponentu a translokon. Bazální komplex prochází buněčnou membránou, periplazmatickým prostorem a vnější membránou a vytváří růžicovitou strukturu. Nejčastěji tvoří bazální komplex alespoň 15 proteinů. Z objímky vychází vlákno ve tvaru tyčinky, nazývané jehla. Jehla směřuje do extracelulárního prostoru, je uvnitř dutá a má dostatečný průměr , aby přes ni mohl projít nesložený protein. Na konci jehly je speciální komplex, který určuje blízkost eukaryotické buňky a reguluje sekreci efektorových proteinů. Stejný komplex je zodpovědný za vložení translokonu do membrány eukaryotické buňky. Translocon obsahuje pór, kterým bakteriální protein vstupuje do eukaryotické buňky [1] .
Systémy typu III jsou používány mnoha patogeny, jako jsou Yersinia , Salmonella a Shigella [1] . Pomocí sekrečních systémů tohoto typu jsou vylučovány složky bičíku. Vztah mezi flagelinem a systémovými proteiny typu III ukazuje na společný původ [3] [4] .
Evolučně jsou sekreční systémy typu IV blízké proteinovému aparátu konjugace a vylučují jak jednotlivé molekuly proteinu, tak proteinové komplexy a komplexy proteinů a DNA . Substrátové proteiny jsou vylučovány přímo do jiné buňky – bakteriální (stejného druhu nebo jiného druhu) nebo eukaryotické. Protože systémy typu IV mohou přenášet komplexy protein-DNA, mohou se podílet na přenosu DNA během konjugace, izolace nebo vychytávání DNA a dodávání efektorových proteinů nebo komplexů protein-DNA přímo do buňky příjemce. Pomocí systému typu IV dodává Agrobacterium tumefaciens onkogenní T-DNA do rostlinných buněk ; tento systém se nazývá VirB/D. Proteiny VirB6-10 tvoří kanál, který prochází buňkou a vnějšími membránami, zatímco VirB4, VirB11 a VirD4 jsou umístěny v buněčné membráně a jako ATPázy dodávají energii pro transport. Extracelulární pili je tvořena proteiny VirB2 a VirB5. Předpokládá se, že VirD4 hraje roli „brány“ a brání necílovým proteinům ve vstupu do kanálu. Nejasná je také role pily. Podle jedné hypotézy je určen pouze pro komunikaci s buňkou příjemce, podle jiné hraje přímou roli v přenosu proteinu do buňky příjemce [1] .
Systémy typu IV používají různé lidské patogeny: Neisseria gonorrhoeae , L. pneumophila , Brucella suis a Helicobacter pylori [1] .
Komponenty sekrečního systému typu V jsou jedinečné v tom, že samy jsou vylučovány bez účasti pomocných proteinových kanálů. Mají β-barelovou strukturu , která proniká přes vnější membránu. Skrze něj vystupuje zbytek bílkovin nebo jiných bílkovin. Proteiny systému typu V jsou dodávány do periplazmy systémem Sec a nesou tedy odpovídající N-terminální signální peptid, který je v periplazmě odstraněn. Většina substrátů systémů typu V jsou faktory virulence. U N. gonorrhoeae je tak transportována proteáza degradující protilátku ; Shigella flexneri má protein, který hraje roli adhezní molekuly, a Y. enterocolitica má protein, který podporuje sekreční systém typu III [1] .
systémy typu VI transportují proteiny především do bakteriálních buněk, ale někdy i do eukaryotických buněk. Tyto systémy mohou přenášet proteiny z jedné bakterie do druhé, což může sloužit jako prostředek pro komunikaci bakterií. Systémy typu VI jsou velmi velké, obsahují až 21 proteinů, jejichž geny jsou sestaveny do celého shluku. Třináct z nich je nejkonzervativnějších a zřejmě zajišťují strukturu sekrečního aparátu. Zajímavé je, že systémy typu VI jsou strukturně homologní s bakteriofágovými ocasy, takže bylo navrženo, že se vyvinuly z obrácených fágových ocasů, které proteiny spíše vytlačují ven, než aby je vstřikovaly do buňky. Patogeny pravděpodobně využívají i systémy VI. typu: v laboratorních podmínkách byly nalezeny u patogenních P. aeruginosa , V. cholerae a S. marcescens , ale podrobnosti o jejich fungování jsou nejasné [1] .
Gram-pozitivní bakterie nemají vnější membránu, ale mají mnohem silnější vrstvu peptidoglykanu než gramnegativní bakterie . Navíc některé grampozitivní bakterie, jako je Mycobacterium , mají buněčnou stěnu obohacenou o lipidy , a proto se dokonce nazývá mykomembrána. Z těchto důvodů se mechanismy sekrece proteinů u grampozitivních bakterií významně liší od mechanismů sekrece gramnegativních bakterií. Dráhy Sec a Tat jsou však přítomny u grampozitivních i gramnegativních bakterií [1] .
Mnoho grampozitivních bakterií má dva proteiny, SecA1 a SecA2, namísto jednoho proteinu SecA systému Sec. Mezi takové bakterie patří L. monocytogenes , Bacillus subtilis , Clostridium difficile , M. tuberculosis a Corynbacteria glutamicum . Protein SecA1 je zapojen do systému Sec a je životně důležitý, zatímco SecA2 je potřeba pouze příležitostně a vylučuje proteiny spojené se stresovou reakcí, modifikacemi buněčných stěn, opravami a metabolismem . U některých bakterií přispívá k virulenci. Substráty SecA2 jsou secernovány SecYEG, i když nelze vyloučit možnost interakce SecA2 s jinými transportními proteiny. Někteří zástupci rodů Streptococcus a Staphylococcus mají druhý systém Sec nazývaný aSec nebo SecA2-SecY2. Mezi tyto systémy patří nejen SecA2, ale také pomocné proteiny - SecY2, který hraje roli kanálu, a minimálně další tři proteiny Sec. Systémy aSec obvykle vylučují velké, bohatě glykosylované proteiny spojené s buněčnou stěnou [1] .
Sortázy jsou enzymy, které kovalentně připojují proteiny k buněčné stěně poté, co prošly buněčnou membránou. Téměř všechny grampozitivní bakterie exprimují mnoho sortáz s různými specificitami. K vazbě proteinu na buněčnou stěnu dochází během transpeptidační reakce katalyzované sortázami. Cílové proteiny Sortázy jsou transportovány přes membránu proteiny systému Sec [1] .
Injektozomy grampozitivních bakterií jsou funkčně podobné sekrečním systémům typu III a IV u gramnegativních bakterií. Například Streptococcus pyogenes injektuje alespoň jeden faktor virulence, NAD + -glykohydrolázu , do cytoplazmy keratinocytů právě mechanismem těchto systémů. V eukaryotické buňce rozbíjí NAD glykohydroláza glykosidickou vazbu v NAD + , což vede k tvorbě nikotinamidu a ADP-ribózy , důležitého druhého posla , který může narušit buněčné signální dráhy . Tvorbu póru v membráně eukaryotické buňky provádí protein SLO, který je předem sekretován systémem Sec [1] .
Sekreční systémy typu VII se nacházejí u bakterií, jejichž buněčné stěny jsou vysoce obohaceny o lipidy a nazývají se mykomembrány, jako jsou druhy rodů Mycobacterium a Corynebacterium . Systémy typu VII transportují proteiny přes buněčnou membránu a mykomembránu. Podobné systémy byly identifikovány u řady nemykomembránových bakterií, jako je S. aureus , Bacillus anthracis a L. monocytogenes . První systémy typu VII byly nalezeny u M. tuberculosis a byly nazývány systémy ESX. Základní složky systému - EccB, EccC, EccD, EccE a MycP - jsou membránové proteiny , které interagují s peptidoglykanem a cytosolickými proteiny, jako jsou chaperony. EccA pravděpodobně dodává energii do systému. Zdá se, že čtyři proteiny Ecc tvoří kanál v buněčné membráně. Mechanismy transportu proteinů přes membránu jsou dosud neznámé [1] .
Vrozená imunita savců má řadu mechanismů pro rozpoznávání bakteriálních sekrečních systémů a jejich substrátů . Například blízkost bakteriálních sekrečních systémů může být stanovena přítomností látek bakteriálního původu v cytosolu: peptidoglykan, flagellin, lipopolysacharid (LPS). Jsou rozpoznávány buněčnými receptory , které spouštějí imunitní reakce. Nod-like receptory například rozpoznávají flagellin a LPS a spouštějí signální kaskády, které nakonec vedou k produkci zánětlivých cytokinů . Imunitní systém může dokonce sledovat proces translokace bakteriálních proteinů do eukaryotické buňky. Makrofágy tedy mohou zachytit účinek efektorového proteinového systému YopE typu III Yersinia na Rho GTPázy a spustit imunitní odpověď. Imunitní buňky mohou detekovat začlenění bakteriálních proteinů tvořících póry do membrán hostitelských buněk. Například, když je protein S. pyogenes zaveden do membrány, aktivuje se Nod-like receptor NLRP3 . Navíc existují důkazy, že imunitní systém je schopen detekovat složky sekrečních systémů, které trčí na povrchu bakteriální buňky [1] .