Cyklus trikarboxylových kyselin (zkr. CTK , Krebsův cyklus , citrátový cyklus , cyklus kyseliny citronové [1] [2] ) je ústřední částí obecné dráhy katabolismu , cyklického biochemického procesu, během kterého vznikají acetyl zbytky (CH 3 CO-) se oxidují na oxid uhličitý (CO 2 ). V tomto případě se v jednom cyklu vytvoří 2 molekuly CO 2 , 3 NADH , 1 FAD H 2 a 1 GTP (resp .ATP ) [3] . Elektrony umístěné na NADH a FADH 2 jsou následně přeneseny do dýchacího řetězce [2] , kde při oxidativních fosforylačních reakcích vzniká ATP .
Cyklus trikarboxylových kyselin je klíčovým krokem v dýchání všech buněk , které využívají kyslík , průsečík mnoha metabolických drah v těle , mezistupeň mezi glykolýzou a elektronovým transportním řetězcem . Kromě významné energetické role plní cyklus i významnou plastickou funkci, to znamená, že je významným zdrojem prekurzorových molekul, ze kterých se v průběhu dalších biochemických přeměn uvolňují tak důležité sloučeniny pro život buňky , jako jsou aminokyseliny , syntetizují se sacharidy , mastné kyseliny atd. [4]
Konverzní cyklus kyseliny citronové v živých buňkách (tedy cyklus trikarboxylové kyseliny) objevil a studoval německý biochemik Hans Krebs , za tuto práci mu byla (spolu s F. Lipmanem ) udělena Nobelova cena (1953) [1] .
U eukaryot probíhají všechny reakce Krebsova cyklu uvnitř mitochondrií a u většiny bakterií se reakce cyklu odehrávají v cytosolu [5] .
Na začátku cyklu trikarboxylových kyselin předává acetyl-koenzym A (acetyl-CoA) svou acetylovou skupinu čtyřuhlíkové sloučenině - oxaloacetátu (kyselina oxaloctová) a vzniká šestiuhlíkatý citrát (kyselina citronová). Acetyl-CoA je oxidační produkt sloučenin, jako je glukóza , aminokyseliny a mastné kyseliny [6] . Citrát je poté izomerizován na isocitrát (kyselinu isocitronovou), který je dále dehydrogenován a dekarboxylován na pětiuhlíkovou kyselinu , a-ketoglutarát . α-ketoglutarát je opět dekarboxylován a přeměněn na čtyřuhlíkový sukcinát (kyselina jantarová). Sukcinát je poté ve třech krocích enzymaticky přeměněn na čtyřuhlíkový oxaloacetát, který je připraven reagovat s novou molekulou acetyl-CoA. V každém otočení cyklu vstoupí do cyklu jedna acetylová skupina (tj. dva atomy uhlíku ) ve formě acetyl-CoA a dva atomy uhlíku opustí cyklus ve formě dvou molekul CO 2 ; jedna molekula oxaloacetátu se použije k vytvoření citrátu a jedna se následně regeneruje. Oxalacetát neopouští cyklus a jedna molekula oxaloacetátu může teoreticky vázat neomezený počet acetylových skupin a ve skutečnosti je oxaloacetát v buňkách přítomen ve velmi nízkých koncentracích. Čtyři z osmi fází cyklu jsou oxidační procesy, oxidační energie uvolněná při těchto procesech je efektivně ukládána ve formě redukovaných koenzymů NADH a FADH 2 [5] .
Ačkoli je cyklus trikarboxylových kyselin ústředním prvkem energetického metabolismu, jeho role není omezena na získávání a ukládání energie. Meziprodukty se čtyřmi a pěti uhlíkovými kruhy slouží jako prekurzory pro syntézu mnoha sloučenin. K doplnění těchto meziproduktů, které opustily cyklus, probíhají v buňce speciální anaplerotické reakce [5] .
Jak bylo uvedeno výše, všechny reakce cyklu trikarboxylových kyselin probíhají v mitochondriích a dýchací řetězec je umístěn v mitochondriích (na vnitřní membráně ). U většiny bakterií jsou enzymy cyklu trikarboxylových kyselin umístěny v cytosolu a plazmatická membrána plní funkce podobné funkcím vnitřní membrány mitochondrií [5] .
Cyklus trikarboxylové kyseliny zahrnuje 8 hlavních stupňů, které jsou podrobně diskutovány níže.
První reakcí cyklu je nevratná kondenzace acetyl-CoA s oxaloacetátem za vzniku citrátu , katalyzovaná enzymem citrátsyntázou (reakce 1 v obecném schématu):
V této reakci se methylová skupina v acetylové skupině acetyl-CoA přidá ke karbonylové skupině (druhý atom uhlíku, atom C2) oxaloacetátu . Během této reakce se v aktivním centru enzymu - citroyl-CoA vytvoří meziprodukt . Rychle se hydrolyzuje a štěpí na volný CoA a citrát, které jsou odstraněny z aktivního místa enzymu . Hydrolýza tohoto vysokoenergetického thioetherového meziproduktu činí tuto reakci vysoce exergonickou . Velká negativní změna standardní volné energie reakce citrátsyntázy je nezbytná pro řízení cyklu, protože, jak bylo uvedeno dříve, normální koncentrace oxaloacetátu v buňce je velmi nízká. CoA uvolněný během této reakce se dále podílí na oxidativní dekarboxylaci další molekuly pyruvátu komplexem pyruvátdehydrogenázy [7] .
Citrátsyntáza byla krystalizována a analyzována rentgenová difrakce v přítomnosti a nepřítomnosti jejího substrátu a inhibitorů . Každá podjednotka tohoto homodimerního enzymu je jeden polypeptid se dvěma doménami , z nichž jedna je velká a rigidní a druhá je menší a plastičtější; mezi těmito doménami je aktivní místo enzymu. Oxalacetát, první ze substrátů vážících citrátsyntázu, vyvolává významné konformační změny v plastické doméně a vytváří vazebné místo pro druhou molekulu substrátu, acetyl-CoA (viz vpravo). Když se v aktivním místě enzymu vytvoří citroyl-CoA, dojde v enzymu k druhé konformační změně v důsledku hydrolýzy thioesteru za uvolnění CoA. Tyto konformační změny, způsobené nejprve vazbou na substrát a poté na meziprodukt, zabraňují předčasnému a neproduktivnímu štěpení thioetherové vazby v acetyl-CoA. Kinetické studie citrátsyntázy potvrzují výše popsaný dvousubstrátový mechanismus jejího fungování. Výše uvedená citrátsyntázová reakce je aldolovou kondenzací [8] [9] (někteří autoři ji však považují za Claisenovu kondenzaci [7] ). Níže je uveden mechanismus reakce citrátsyntázy:
Enzym akonitáza (přesněji akonitát hydratáza) katalyzuje reverzibilní izomeraci citrátu na isocitrát tvorbou meziproduktu - cis-akonitátu trikarboxylové kyseliny , který normálně neopouští aktivní centrum. Akonitáza přidává vodu k dvojné vazbě cis -akonitátu spojeného s jeho aktivním centrem dvěma různými způsoby: v důsledku jednoho z nich vzniká citrát, v důsledku druhého isocitrát (reakce 2 a 3 obecně schéma) [7] :
I když rovnovážná směs při pH 7,4 a 25 ° C obsahuje méně než 10 % izocitrátu, reakce je v buňce posunuta doprava, protože izocitrát je rychle vtažen do další fáze cyklu a jeho koncentrace klesá. Aconitase obsahuje shluk železa a síry , který slouží jak k navázání substrátu v aktivním místě, tak ke katalytické hydrataci nebo dehydrataci. V buňkách, které neobsahují dostatek železa , ztrácí akonitáza svůj shluk železo-síra a získává regulační roli v metabolismu železa (podrobnosti viz IRE (biologie) ). Akonitáza je tedy jedním z mnoha enzymů se dvěma odlišnými funkcemi [10] .
Níže je schéma ilustrující, jak klastr akonitáza železo-síra váže isocitrát a převádí jej na cis -akonitát:
V dalším kroku enzym isocitrátdehydrogenáza katalyzuje oxidační dekarboxylaci isocitrátu za vzniku α-ketoglutarátu (oxoglutarát). Ion Mn 2+ (nebo Mg 2+ ) [11] v aktivním místě enzymu interaguje s karbonylovou skupinou intermediárního oxalosukcinátu , který se rychle tvoří, ale neopustí aktivní místo, dokud není dekarboxylován a přeměněn na α-ketoglutarát [10] .
Tyto transformace jsou podrobně diskutovány níže (reakce 4 a 5 v obecném schématu):
V buňkách byly nalezeny dvě různé formy (izozymy) isocitrátdehydrogenázy. Pro fungování jednoho z nich je zapotřebí NAD + , pro druhého NADP + (navíc aktivita druhého vyžaduje iont Mg 2+ , nikoli Mn 2+ [11] ). Reakce, které provádějí, jsou jinak totožné. U eukaryot je isozym závislý na NAD lokalizován v mitochondriální matrici a je zapojen do cyklu trikarboxylových kyselin. Hlavní funkcí NADP-dependentního izozymu, který se vyskytuje jak v mitochondriální matrix, tak v cytosolu, může být tvorba NADPH , která je nezbytná pro regenerační anabolické procesy [13] .
V další fázi cyklu trikarboxylových kyselin dochází také k oxidativní dekarboxylaci, při které dochází k přeměně α-ketoglutarátu na sukcinyl-CoA a CO 2 působením komplexu α-ketoglutarátdehydrogenázy ; NAD + působí jako akceptor elektronů , zatímco CoA funguje jako nosič sukcinylových skupin. Oxidační energie α-ketoglutarátu se ukládá během tvorby thioetherové vazby v sukcinyl-CoA [13] (reakce 6 v obecném schématu):
Tato reakce je téměř totožná s pyruvátdehydrogenázovou reakcí oxidativní dekarboxylace pyruvátu a komplex α-ketoglutarátdehydrogenázy je strukturou a funkcí extrémně blízký pyruvátdehydrogenázovému komplexu (PDC). Zahrnuje 3 enzymy homologní s enzymy E 1 , E 2 a E 3 MPC a jeho kofaktory jsou také thiaminpyrofosfát , lipoát , FAD, NAD a koenzym A. Oba komplexy mají nepochybně společného evolučního předka. Přestože jsou enzymy E 1 obou komplexů strukturálně podobné, jejich aminokyselinové sekvence se liší a samozřejmě jsou specifické pro různé substráty: E 1 komplexu PDC váže pyruvát a E 1 komplexu α-ketoglutarát dehydrogenázy váže α-ketoglutarát. Enzymy E2 obou komplexů jsou také velmi podobné a oba se vážou kovalentně na lipoát. E 3 podjednotky obou komplexů jsou totožné [14] .
Sukcinyl-CoA, stejně jako acetyl-CoA, obsahuje thioetherovou vazbu s velkou negativní standardní volnou energií hydrolýzy (ΔG'® ≈ −36 kJ/mol). V další fázi cyklu trikarboxylových kyselin se energie uvolněná při štěpení thioetherové vazby využije k vytvoření fosfoanhydridové vazby v GTP nebo ATP, zatímco sukcinyl-CoA se přemění na sukcinát [14] (reakce 6 v obecné schéma):
Tato reverzibilní reakce je katalyzována enzymem sukcinyl-CoA syntetázou (sukcinylthiokinázou); oba názvy tohoto enzymu naznačují, že se této reakce účastní nukleosidtrifosfát [14] .
Tato reakce akumulující energii zahrnuje mezikroky, ve kterých se samotná molekula enzymu fosforyluje na histidinovém zbytku v aktivním místě. Tato fosforylová skupina, která má vysoký přenosový potenciál, je převedena na ADP nebo GDP za vzniku ATP nebo GTP, v daném pořadí. Živočišné buňky mají dva isozymy sukcinyl-CoA syntetázy, z nichž jeden je specifický pro ADP a druhý pro GDP. Sukcinyl-CoA syntetáza se skládá ze dvou podjednotek: α-podjednotka ( Mr = 32 000) obsahuje fosforylovaný histidinový zbytek ( His246 ) a vazebné místo pro CoA a β-podjednotka ( Mr = 42 000) poskytuje vazebnou specifitu k ADP. nebo HDP. Aktivní místo se nachází v prostoru mezi podjednotkami. Krystalová struktura sukcinyl-CoA syntetázy obsahuje dva „silové šroubovice“ ( anglicky power helices ), jeden v každé podjednotce, a tyto spirály jsou orientovány tak, že jejich elektrické dipólové momenty posouvají částečně kladné náboje na záporně nabitý histidinfosfát ( P-His); díky tomu je intermediární fosforylovaná forma enzymu stabilizována [15] . Následuje reakční schéma katalyzované sukcinyl-CoA syntetázou:
Tvorba ATP (nebo GTP) z energie uložené během oxidační dekarboxylace α-ketoglutarátu je substrátovou fosforylační reakcí , stejně jako syntéza ATP během glykolýzy , katalyzovaná glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázou a pyruvátkinázou . GTP syntetizovaný sukcinyl-CoA syntetázou může darovat svou koncovou fosforylovou skupinu ADP za vzniku ATP v reverzibilní reakci katalyzované nukleosid difosfátkinázou :
GTP + ADP → GDP + ATP, ΔG′ o = 0 kJ/mol.Konečným výsledkem aktivity jakéhokoli izozymu sukcinyl-CoA syntetázy je tedy ukládání energie ve formě ATP. Změna Gibbsovy energie v reakci nukleosiddifosfátkinázy je nulová a ATP a GTP jsou si navzájem energeticky ekvivalentní [16] .
Sukcinát vzniklý ze sukcinyl-CoA je oxidován na fumarát působením flavoproteinsukcinátdehydrogenázy [17] (reakce 8 v obecném schématu):
U eukaryot je sukcinátdehydrogenáza pevně vázána na vnitřní membránu mitochondrií , u bakterií je umístěna na plazmatické membráně. Tento enzym obsahuje 3 různé shluky železa a síry a jednu molekulu kovalentně vázaného FAD, což je prostetická skupina enzymu. Elektrony z sukcinátu procházejí FAD a klastry železo-síra a poté jako elektronové nosiče vstupují do respiračního elektronového transportního řetězce umístěného na vnitřní mitochondriální membráně (plazmatická membrána u bakterií). FAD je redukován na FADH 2 , ale ubichinon je dalším akceptorem elektronů [2] . Přenos elektronů z sukcinátu přes tyto nosiče ke konečnému akceptoru elektronů, kyslíku , je spojen se syntézou ATP a na pár elektronů se vytvoří 1,5 molekuly ATP. Malonát , který se normálně v buňkách nevyskytuje, je silným kompetitivním inhibitorem sukcinátdehydrogenázy a přidání této sloučeniny do mitochondrií blokuje aktivitu cyklu trikarboxylových kyselin [17] .
Reverzibilní hydrataci fumarátu za vzniku L - malátu katalyzuje enzym fumaráza (přesněji fumarát hydratáza ). Přechodným produktem této reakce je karbanion [17] (reakce 9 v obecném schématu):
Mechanismus fumarázové reakce je podrobněji uveden níže:
Fumaráza je stereospecifický enzym: katalyzuje hydrataci dvojné vazby ve fumarátu ( trans izomer ), ale ne v maleátu ( cis izomer fumarátu). Fumaráza také vykazuje stereospecifitu v reverzní reakci: D-malát pro ni nemůže sloužit jako substrát [17] .
V poslední reakci cyklu trikarboxylových kyselin NAD-dependentní enzym L - malátdehydrogenáza katalyzuje oxidaci L-malátu na oxaloacetát [17] (reakce 10 v obecném schématu):
Za standardních termodynamických podmínek je rovnováha této reakce silně posunuta doleva, avšak v živé buňce je oxaloacetát neustále zapojen do vysoce exergonické citrátsyntázové reakce (1. stupeň). To udržuje extrémně nízkou koncentraci oxaloacetátu v buňce (< 10 −6 M), díky čemuž se rovnováha reakce malátdehydrogenázy posouvá doprava [17] .
Ačkoli jsou enzymy cyklu trikarboxylových kyselin obvykle popisovány jako rozpustné složky mitochondriální matrice (kromě membránově vázané sukcinátdehydrogenázy), přibývá důkazů, že tyto enzymy existují jako multienzymové komplexy v mitochondriích . Cyklické enzymy byly úspěšně izolovány z extraktů zničených buněk, avšak multiproteinové komplexy vzniklé v důsledku nekovalentních interakcí jednoho proteinu s druhým nebo se strukturní složkou buňky ( membrána , mikrotubule , mikrofilamenta ) byly zničeny. Při přípravě buněčného extraktu se však obsah buněk včetně enzymů ředí 100 nebo 1000krát [18] .
Řada důkazů naznačuje, že v buňkách poskytují multienzymové komplexy účinný přechod reakčních produktů jednoho enzymu na další enzym dráhy. Takové komplexy se nazývají metabolony . Několik enzymů cyklu trikarboxylových kyselin bylo izolováno jako součást supramolekulárních komplexů nebo bylo zjištěno, že jsou asociovány s vnitřní membránou mitochondrií, nebo se ukázalo, že mají pomalejší difúzní rychlosti než jednotlivé proteiny v roztoku. To poskytuje silný důkaz pro výměnu substrátu mezi multienzymovými komplexy a v jiných metabolických drahách a mnoho enzymů považovaných za „rozpustné“ ve skutečnosti tvoří vysoce organizované komplexy, které si vyměňují meziprodukty [18] .
Reakce tvořící jednu otáčku cyklu trikarboxylové kyseliny byly uvažovány výše. Dvouuhlíková acetylová skupina vstupuje do cyklu spojením s oxaloacetátem. Dva atomy uhlíku opouštějí cyklus ve formě dvou molekul CO 2 vzniklých při oxidaci isocitrátu a α-ketoglutarátu. Energie uvolněná během těchto oxidačních reakcí je uložena ve formě redukovaných tří molekul NADH, jedné molekuly FADH 2 a jedné molekuly ATP nebo GTP. Na konci cyklu se molekula oxaloacetátu regeneruje. Stojí za zmínku, že dva atomy uhlíku, které opouštějí cyklus ve formě dvou molekul CO2, se liší od dvou atomů uhlíku, které vstoupily do cyklu (v tomto pořadí) jako acetylová skupina. Atomy uhlíku přinášené acetylovou skupinou mohou opustit cyklus ve formě CO 2 pouze v následujících otáčkách cyklu [3] .
Ačkoli cyklus kyseliny citrónové produkuje pouze jednu molekulu ATP za otáčku přímo (když se sukcinyl-CoA přemění na sukcinát), čtyři oxidační reakce cyklu poskytují dýchacímu řetězci významný počet elektronů dodávaných NADH a FADH2 , a tedy poskytují významné množství ATP během oxidativní fosforylace [3] .
Během glykolýzy jedna molekula glukózy produkuje dvě molekuly pyruvátu, 2 ATP a 2 NADH. Během oxidativní fosforylace dvouelektronový přechod z NADH na O 2 produkuje 2,5 ATP a dvouelektronový přechod z FADH 2 na O 2 produkuje 1,5 ATP. Když jsou obě molekuly pyruvátu oxidovány na 6 CO 2 komplexem pyruvátdehydrogenázy a během cyklu trikarboxylových kyselin a elektrony jsou převedeny na O 2 během oxidativní fosforylace, celkový výtěžek ATP je 32 molekul na molekulu glukózy [3] :
| Reakce | Výdej ATP nebo redukovaných koenzymů | Celkový výstup ATP |
|---|---|---|
| glukóza → glukóza-6-fosfát | −1 ATP | −1 |
| fruktóza 6-fosfát → fruktóza 1,6-bisfosfát | −1 ATP | −1 |
| 2 glyceraldehyd-3-fosfát → 2 1,3-bisfosfoglycerát | 2 NADH | 3 nebo 5 |
| 2 1,3-bisfosfoglycerát → 2 3-fosfoglycerát | 2 ATP | 2 |
| 2 fosfoenolpyruvát → 2 pyruvát | 2 ATP | 2 |
| 2 pyruvát → 2 acetyl-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 isocitrát → 2 α-ketoglutarát | 2 NADH | 5 |
| 2 α-ketoglutarát → 2 sukcinyl-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 sukcinyl-CoA → 2 sukcinát | 2 ATP (nebo 2 GTP) | 2 |
| 2 sukcináty → 2 fumaráty | 2 FADH 2 | 3 |
| 2 malát → 2 oxalacetát | 2 NADH | 5 |
| Celkem : 30-32 |
32 molekul ATP odpovídá 32 × 30,5 kJ/mol = 976 kJ/mol, což je 34 % teoretického maxima pro úplnou oxidaci glukózy – 2 840 kJ/mol. Tyto výpočty byly provedeny s přihlédnutím ke standardním hodnotám změn volné energie, pokud však vezmeme v úvahu skutečnou potřebu buňky volné energie obsažené v ATP, pak se účinnost oxidačního procesu blíží 65 % teoretické maximálně [19] .
| Etapa | jeden | 2 | 3 | čtyři | 5 | 6 | 7 | osm |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AG'°, kJ/mol | -32.2 | 13.3 | -7.1 | -33,5 | -2.9 | 0 | -3.8 | 29.7 |
Regulaci enzymů metabolické dráhy lze provádět pomocí alosterických efektorů a kovalentních modifikací, udržujících konstantní koncentraci meziproduktů a konečných produktů v buňce a zabraňující jejich nadměrné tvorbě. Přechod atomů uhlíku z pyruvátu do cyklu trikarboxylové kyseliny je jemně regulován na dvou úrovních: přeměna pyruvátu na acetyl-CoA, výchozí sloučeninu pro cyklus (reakce pyruvátdehydrogenázy), a vstup aktivního acetátu do cyklu ( citrátsyntázová reakce). Acetyl-CoA vzniká nejen komplexem pyruvátdehydrogenázy (PDH), ale také oxidací mastných kyselin (β-oxidace) a některých aminokyselin, takže kontrola těchto drah je důležitá i pro regulaci oxidace pyruvátu a tzv. cyklus trikarboxylové kyseliny. Cyklus je navíc regulován reakcemi isocitrátdehydrogenázy a α-ketoglutarátdehydrogenázy. Níže se budeme zabývat samotnou regulací cyklu trikarboxylových kyselin [20] ; pro regulaci oxidační dekarboxylace pyruvátu viz článek Oxidační dekarboxylace pyruvátu .
Vstup metabolitů do cyklu trikarboxylových kyselin je tedy přísně regulován. Příjem metabolitů je určen třemi faktory: dostupností substrátu, supresí nahromaděných produktů a alosterickou zpětnovazební supresí enzymů, které katalyzují počáteční fáze cyklu [21] .
Každý ze tří exergonických kroků cyklu – kroky katalyzované citrátsyntázou, isocitrátdehydrogenázou a α-ketoglutarátdehydrogenázou – se za určitých podmínek může stát rychlost omezující . Dostupnost substrátů pro citrátsyntázu (acetyl-CoA a oxaloacetát) se liší v závislosti na stavu buňky a někdy inhibuje rychlost tvorby citrátu. NADH, oxidační produkt isocitrátu a α-ketoglutarátu, se za určitých podmínek hromadí a při vysokém poměru [NADH]/[NAD + ] jsou obě dehydrogenázové reakce silně potlačeny. Podobně v buňce je reakce malátdehydrogenázy v přísné rovnováze (to znamená, že je omezena substrátem) a při vysoké hodnotě poměru [NADH]/[NAD + ] a nízké koncentraci oxaloacetátu první fáze cyklu se zpomaluje. Hromadění produktů omezuje všechny tři limitující fáze cyklu: sukcinyl-CoA inhibuje α-ketoglutarátdehydrogenázu (stejně jako citrátsyntázu); citrát blokuje citrát syntázu; konečný produkt, ATP, inhibuje citrátsyntázu a isocitrátdehydrogenázu. ADP, alosterický aktivátor citrátsyntázy, snižuje inhibiční účinek ATP na tento enzym. Ionty Ca 2+ ve svalové tkáni obratlovců , které slouží jako signál pro kontrakci a doprovázejí zvýšení potřeby ATP, aktivují isocitrátdehydrogenázu a α-ketoglutarátdehydrogenázu, stejně jako pyruvátdehydrogenázový komplex (PDH). Koncentrace substrátů a meziproduktů v cyklu trikarboxylových kyselin tedy určuje takový tok uhlíku přes něj, při kterém budou koncentrace vytvořeného ATP a NADH optimální [22] .
Normálně jsou rychlosti glykolýzy a cyklu trikarboxylových kyselin úzce propojeny, takže na pyruvát se přemění pouze takové množství glukózy, které poskytne cyklu dostatečné množství „paliva“ - acetylové skupiny acetyl-CoA. Koncentrace pyruvátu, laktátu a acetyl-CoA jsou normálně udržovány konstantní. Rychlost glykolýzy souvisí s rychlostí cyklu kyseliny citrónové nejen prostřednictvím inhibice glykolýzy vysokými hladinami ATP a NADH, což je charakteristické jak pro glykolýzu, tak pro respirační krok oxidace glukózy, ale také prostřednictvím koncentrace citrátu. Citrát, první produkt cyklu trikarboxylových kyselin, je důležitým alosterickým inhibitorem fosfofruktokinázy-1 , glykolytického enzymu [18] .
Osmikrokový cyklický proces oxidace jednoduché acetylové dvouuhlíkové skupiny na CO 2 se může zdát zbytečně složitý a nesplňuje biologický princip maximální hospodárnosti . Role cyklu trikarboxylových kyselin však není omezena na oxidaci acetátového iontu (a tedy sacharidů, mastných kyselin a některých aminokyselin, při jejichž oxidaci vzniká). Tato dráha tvoří jádro metabolismu meziproduktů. Čtyř- a pětiuhlíkové konečné produkty mnoha katabolických procesů vstupují do cyklu v mezistupních. Oxalacetát a α-ketoglutarát jsou například produkty katabolismu kyseliny asparagové a glutamové , které vznikají při štěpení bílkovin. Mnoho meziproduktů cyklu se účastní některých metabolických procesů a slouží jako prekurzory v mnoha anabolických procesech. Cyklus trikarboxylových kyselin je tedy amfibolická dráha, spojuje katabolické a anabolické procesy [23] .
Pyruvát je produktem oxidace sacharidů. Dále se pyruvát přeměňuje na acetyl-CoA a je zapojen do cyklu trikarboxylové kyseliny. Kromě toho je acetyl-CoA také produktem oxidace mastných kyselin, takže cyklus trikarboxylových kyselin se také podílí na katabolismu tuků [24] . Stojí za zmínku, že pyruvát může být zapojen do cyklu trikarboxylových kyselin, aniž by byl přeměněn na acetyl-CoA, ale přeměněn na malát působením jablečného enzymu [25] .
Z α-ketoglutarátu, který vzniká v cyklu trikarboxylových kyselin, se syntetizují aminokyseliny glutamin , glutamát, prolin a arginin . Sukcinyl-CoA působí jako prekurzor při syntéze porfyrinů a hemu . Citrát se podílí na syntéze mastných kyselin a sterolů (z citrátu vzniká acetyl-CoA, navíc působí jako regulátor [26] ). Malát může být transportován z mitochondrií do cytoplazmy, kde je reverzibilně přeměněn na oxaloacetát. Výsledný oxalacetát může sloužit jako prekurzor pro syntézu aminokyselin aspartátu, asparaginu , methioninu , threoninu a isoleucinu a také pyrimidinů . Může být také přeměněn na fosfoenolpyruvát na úkor GTP a fosfoenolpyruvát (PEP) může sloužit jako prekurzor v biosyntéze fenylalaninu , tyrosinu , tryptofanu , serinu , glycinu a cysteinu . Pyruvát, produkovaný z PEP během glykolýzy, se může stát prekurzorem alaninu , leucinu a valinu a může se také podílet na glukoneogenezi [24] [25] .
Meziprodukty cyklu trikarboxylových kyselin, které opustily cyklus a účastní se syntézy různých sloučenin, jsou nahrazeny speciálními anaplerotickými reakcemi . Za normálních podmínek jsou reakce, ve kterých jsou meziprodukty cyklu zapojeny do jiných metabolických drah a reakce, které nahrazují jejich odchod, v dynamické rovnováze, takže koncentrace meziproduktů cyklu kyseliny citrónové je udržována konstantní [25] .
Níže uvedená tabulka ukazuje nejdůležitější anaplerotické reakce [25] :
| Reakce | Enzym | tkáň/organismus |
|---|---|---|
| pyruvát + HCO 3 − + ATP ⇌ oxalacetát + ADP + F n | pyruvátkarboxyláza | játra , ledviny |
| fosfoenolpyruvát + CO 2 + GDP ⇌ oxalacetát + GTP | fosfoenolpyruvát karboxykináza | srdce , kosterní svaly |
| fosfoenolpyruvát + HCO 3 − ⇌ oxalacetát + F n | fosfoenolpyruvátkarboxyláza | vyšší rostliny , kvasinky , bakterie |
| pyruvát + HCO 3 − + NAD(P)H ⇌ malát + NAD(P) + | malik-enzym | široce rozšířený mezi eukaryoty a bakteriemi |
V játrech a ledvinách savců je nejdůležitější anaplerotickou reakcí reverzibilní karboxylace pyruvátu za vzniku oxaloacetátu, katalyzovaná enzymem pyruvátkarboxylázou . Když dojde k poklesu oxaloacetátu nebo jiných meziproduktů v citrátovém cyklu, je pyruvát karboxylován za vzniku dalšího oxaloacetátu. Enzymatické přidání karboxylové skupiny k pyruvátu vyžaduje energii, která se odebírá z ATP: volná energie potřebná k přidání karboxylové skupiny k pyruvátu se téměř rovná volné energii, kterou lze získat z ATP. Pyruvátkarboxyláza je regulační enzym a je inaktivována v nepřítomnosti acetyl-CoA, pozitivního alosterického modulátoru. Pokud je acetyl-CoA, „palivo“ pro cyklus trikarboxylových kyselin, přítomen v přebytku, stimuluje pyruvátkarboxylázovou reakci, a tím podporuje tvorbu oxaloacetátu, což zase umožňuje zapojit více acetyl-CoA do cyklus trikarboxylové kyseliny. Pro realizaci pyruvátkarboxylázové reakce je zapotřebí vitamin biotin , který působí jako protetická skupina enzymu přenášejícího CO 2 . Biotin musí být přítomen v lidské stravě, nachází se v mnoha potravinách a je syntetizován střevními bakteriemi [27] .
Ostatní anaplerotické reakce uvedené v tabulce výše jsou také řízeny tak, aby byla zajištěna dostatečná koncentrace meziproduktů pro fungování cyklu trikarboxylových kyselin. Například fosfoenolpyruvátkarboxyláza je aktivována fruktóza-1,6-bisfosfátem, meziproduktem glykolýzy, který se akumuluje za podmínek přebytku kyseliny pyrohroznové [27] .
V rostlinách a bakteriích může být acetyl-CoA během glyoxylátového cyklu přeměněn na sukcinát. Tyto organismy tedy mohou provádět anaplerotickou degradaci neutrálních tuků (podrobněji o glyoxylátovém cyklu viz níže) [4] .
Existují i jiné anaplerotické způsoby. Aminokyseliny histidin, prolin, arginin, glutamin a glutamát mohou být převedeny na α-ketoglutarát a obnovit jeho koncentraci; isoleucin, valin, methionin, tryptofan - na sukcinyl-CoA, aspartát, fenylalanin a tyrosin - na fumarát; aspartát a aspragin na oxalacetát. Aminokyseliny alanin, serin, threonin, cystein a glycin mohou být přeměněny na pyruvát, který je nezbytný pro cyklus trikarboxylových kyselin [24] .
Jak bylo uvedeno výše, v některých anaerobních organismech existuje neúplný cyklus trikarboxylových kyselin . U nich neslouží k získávání energie, ale k získávání prekurzorů pro biosyntetické procesy. Tyto organismy využívají první tři reakce cyklu k produkci α-ketoglutarátu, avšak bez α-ketoglutarátdehydrogenázy nemohou provádět všechny přeměny cyklu. Mají však 4 enzymy, které katalyzují sekvenční konverzi oxaloacetátu na sukcinyl-CoA, takže mohou tvořit malát, fumarát, sukcinát a sukcinyl-CoA z oxaloacetátu v reakcích, které jsou opakem „normálních“ (oxidačních) reakcí cyklu. Touto cestou je fermentace , během níž se NADH, vzniklý během oxidace isocitrátu , přemění na NAD + redukcí oxaloacetátu na sukcinát [23] .
V rostlinách , některých bezobratlých a některých mikroorganismech (např. kvasinky, Escherichia coli ) se acetyl-CoA přeměňuje na sukcinát prostřednictvím glyoxylátového cyklu , který je úzce spjat s cyklem trikarboxylové kyseliny. Obecná rovnice pro glyoxylátový cyklus vypadá takto:
2 acetyl-CoA + NAD + + 2H 2 O → sukcinát + 2CoA + NADH + H +Výsledný sukcinát se dále podílí na biosyntetických procesech. U rostlin je glyoxylátový cyklus lokalizován ve speciálních organelách , glyoxisomech [28] [4] .
Některé bakterie jsou schopny provádět reverzní cyklus trikarboxylových kyselin . Při tomto procesu probíhají reakce cyklu trikarboxylových kyselin v opačném směru: kde atomy uhlíku vstupují do cyklu ve formě acetyl-CoA a následně jsou oxidovány na CO 2 , v reverzním cyklu naopak acetyl -CoA je uvolněn. Pro jeho realizaci jsou potřeba donory elektronů a pro tyto účely bakterie využívají vodík , sulfidy nebo thiosírany . Jiné enzymy s reverzním cyklem než odpovídající enzymy dopředného cyklu zahrnují ATP-citrát lyázu , 2-oxoglutarát: ferredoxinoxyreduktázu , pyruvátsyntázu . Reverzní cyklus trikarboxylových kyselin je považován za alternativu fotosyntézy prostřednictvím tvorby sacharidů [29] .
Cyklus trikarboxylových kyselin je běžnou cestou oxidace acetylových skupin, na kterou se redukují prakticky všechny metabolické dráhy živých organismů. Není to vůbec nejkratší cesta pro oxidaci acetátu na CO 2 , ale přírodní výběr zjistil, že má největší výhody. Časné anaeroby mohly využívat některé z reakcí cyklu trikarboxylových kyselin v lineárních biosyntetických procesech. Některé moderní anaerobní mikroorganismy totiž využívají neúplný cyklus trikarboxylových kyselin nikoli jako zdroj energie, ale jako zdroj prekurzorů pro biosyntetické procesy (podrobněji viz část Úpravy ). Spolu s vývojem sinic , které tvoří O 2 z vody, se zemská atmosféra stala aerobní a vlivem přirozeného výběru se v organismech rozvinul aerobní metabolismus, mnohem efektivnější než anaerobní fermentace [23] .
Když jsou narušeny regulační mechanismy drah, jako je cyklus trikarboxylových kyselin, může dojít k vážnému onemocnění. Cyklické enzymy jsou kódovány provozními geny a nepřítomnost funkčních kopií těchto genů lze vysvětlit přítomností tkáňově specifických rysů cyklu [30] . Mezi lidmi jsou mutace ovlivňující geny enzymů cyklu velmi vzácné, ale ty, které se vyskytují, jsou škodlivé.
Defekty v genu fumarázy vedou k nádorům hladkého svalstva ( leiomyomům ) a ledvinám ; mutace v sukcinátdehydrogenáze způsobují rakovinu nadledvin ( feochromocytom ). Buněčné kultury s takovými mutacemi akumulují fumarát ( v případě fumarázových mutací) a v menší míře sukcinát (v případě sukcinátdehydrogenázových mutací) a tato akumulace aktivuje hypoxií indukovaný transkripční faktor HIF-1α . Rozvoj rakoviny může být důsledkem stavu pseudohypoxie. V buňkách s těmito mutacemi dochází ke zvýšené expresi genů normálně regulovaných HIF-1α. Takové důsledky mutací v genech pro fumarázu a sukcinátdehydrogenázu je umožňují klasifikovat jako nádorové supresory [31] .
Byl prokázán vztah mezi defekty fumarázy a poruchami nervového systému [32] .
Mutace, které mění aktivitu α-ketoglutarátdehydrogenázy, vedou k hromadění produktů rozpadu aminokyselin v moči, což způsobuje, že moč zapáchá jako javorový sirup. Toto onemocnění se nazývá leucinóza ( angl. Maple sirup moči disease ) [33] .
Několik sloučenin a reakcí cyklu trikarboxylových kyselin bylo objeveno v roce 1930 Albertem Szent-Györgyi , zejména stanovil roli fumarátu, klíčové složky cyklu. Za své objevy byl Szent-Györgyi v roce 1937 oceněn Nobelovou cenou za fyziologii a medicínu [34] . Kompletní sled reakcí a vzniklých sloučenin stanovil v roce 1937 Hans Adolf Krebs, za což obdržel v roce 1953 Nobelovu cenu (spolu s F. Lipmanem) [35] (na jeho počest dostal cyklus trikarboxylových kyselin jeden ze svých názvů) . V roce 1948 E. Kennedy a Albert Lehninger zjistili, že u eukaryot se všechny reakce cyklu odehrávají v mitochondriích [5] .
Když se asi před 60 lety staly dostupnými izotop těžkého uhlíku 13C a radioaktivní izotopy 11C a 14C , byly použity ke sledování cesty atomů uhlíku v cyklu trikarboxylové kyseliny. Jeden z těchto experimentů přinesl velmi neočekávané výsledky. Hydroxylem značený acetát byl spojen s neznačeným oxaloacetátem za vzniku značeného citrátu. Protože citrát je symetrická molekula, předpokládalo se, že bude převeden na α-ketoglutarát, mezi nimiž budou molekuly značené na různých atomech uhlíku. Z buněk však byl izolován pouze jeden „druh“ molekul α-ketoglutarátu a vědci došli k závěru, že citrát a jakákoli jiná symetrická molekula nemůže být meziproduktem na cestě od acetátu k α-ketoglutarátu; navrhli, že kondenzací acetátu a oxaloacetátu vznikla nesymetrická trikarboxylová kyselina, jako je cis -akonitát nebo isocitrát . V roce 1948 Alexander Ogston stanovil prochiralitu citrátu (tendenci k asymetrickým reakcím v nepřítomnosti chirálního centra ), čímž vysvětlil výsledky experimentů a potvrdil, že v první fázi cyklu se tvoří právě citrát [36]. .
Pro snadnější zapamatování kyselin zapojených do Krebsova cyklu existuje mnemotechnické pravidlo :
Celý ananas a plátek soufflé Today Actually My Lunch , který odpovídá řadě - citrát, cis -akonitát, isocitrát, alfa-ketoglutarát, sukcinyl-CoA, sukcinát, fumarát, malát, oxaloacetát.
Je zde i tato mnemotechnická báseň (její autorkou je asistentka katedry biochemie KSMU E. V. Parshkova [37] ):
Štika na acetylcitrónovém kalu , Ale narcis s koněm se bál Je nad ním isolimon , ale Alfa-ketoglutar al. koenzym sukcinyl Xia , Amber ils fumar ovo, Apple ek ušetřen na zimu, Znovu se otočil Pike oh.(kyselina oxaloctová, kyselina citrónová, kyselina cis -akonitová, kyselina isocitronová, kyselina α-ketoglutarová, sukcinyl-KoA, kyselina jantarová, kyselina fumarová, kyselina jablečná, kyselina oxalooctová).
Další verze básně:
Štika sežrala acetát, ukazuje se citrát přes cis -aconitate bude to isocitrát dávání vodíků PŘES, ztrácí CO2 z toho nesmírně šťastný alfa-ketoglutarát přichází oxidace: NAD ukradne vodík B1 a lipoát s koenzymem A ve spěchu, brát CO2 a energie je sotva se objevil v sukcinylu okamžitě se zrodilo gtf a sukcinát zůstal. tak se dostal do FAD, který potřebuje vodík ztracené vodíky, stal se jen fumarátem. fumarát pil vodu, a změnil se v malát tady jsem přišel k malátu NAD, zakoupené vodíky Štika se znovu objevila a tiše se schoval Hlídání acetátu...