Uzavřená nukleová kyselina

Uzamčená nukleová kyselina ( LNA), také známá jako přemosťující  nukleová kyselina (BNA) [1] a často označovaná jako nepřístupná RNA , je modifikovaný nukleotid RNA , ve kterém je fragment ribózy modifikován dalším můstkem spojujícím 2'- kyslíková skupina. a 4' uhlík. Most „uzamkne“ ribózu do 3' - endo (severní) konformace, která se často nachází v duplexech A-formy . Tato struktura poskytuje zvýšenou odolnost proti enzymatické degradaci [2] [3] [4] [5] . LNA také nabízí zvýšenou specificitu a afinitu pro párování bází jako monomer nebo složka oligonukleotidu [6] . LNA nukleotidy mohou být smíchány se zbytky DNA nebo RNA v oligonukleotidu.

Syntéza

Obika et al., byli první, kdo chemicky syntetizoval LNA v roce 1997 [7] a skupina Jespera Wengela nezávisle následovala v roce 1998 [8] . To se stalo možným poté, co Zamechnik a Stevenson v roce 1978 položili základy pro možnost, že by oligonukleotidy mohly být vynikajícími prostředky pro kontrolu genové exprese [9] . K dnešnímu dni se ukázalo, že dva různé přístupy, nazývané lineární a konvergentní strategie, poskytují vysoký výkon a účinnost v LNA. Strategii lineární syntézy poprvé podrobně popsal Obick et al. [7] V tomto přístupu lze jako výchozí materiál použít uridin (nebo jakýkoli dostupný RNA nukleosid ). Konvergentní strategie vyžaduje syntézu intermediárního cukru, který slouží jako donor glykosylu , nezbytný pro vazbu na dusíkaté báze . Typicky se D-glukóza používá k přípravě meziproduktu cukru, který se následně nechá reagovat s dusíkatými bázemi za použití modifikovaného Vorbrügenova postupu umožňujícího stereoselektivní vazbu [10] .

Přidání různých fragmentů zůstává možné při zachování klíčových fyzikálně-chemických vlastností, jako je vysoká afinita a specificita evidentní v původně syntetizované LNA [11] . Takové oligomery jsou chemicky syntetizovány a jsou komerčně dostupné.

Začlenění do DNA/RNA

LNA může být začleněna do DNA a RNA promiskuitou určitých DNA a RNA polymeráz. Phusion DNA polymeráza, komerčně vyvinutý enzym založený na Pfu DNA polymeráze , účinně začleňuje LNA do DNA [12] .

Charakteristika

LNA poskytuje zvýšenou biologickou stabilitu ve srovnání s biologickými nukleovými kyselinami . Oligonukleotidy modifikované LNA prokázaly zlepšenou termodynamiku, když byly hybridizovány s RNA , jednovláknovou DNA a dvouvláknovou DNA [13] .

Aplikace

Zimy LNA

DNAzymy mohou být modifikovány tak, aby zahrnovaly zbytky LNA za vzniku LNAzymů (LNA-modifikované DNAzymy). Tyto modifikované oligonukleotidy, stejně jako jejich příbuzné DNAzymy, jsou typicky endonukleázy , které se vážou na specifické cílové sekvence RNA a štěpí fosfodiesterovou vazbu , která existuje mezi nukleotidy [14] . Vykazují však účinnější štěpení fosfodiesterové vazby ve srovnání s jejich nemodifikovanými protějšky [15] . Modifikace ramen pro rozpoznávání substrátu DNAzyme monomery LNA vytváří LNAzyme, který rozpoznává Coxsackievirus A21 (CAV-21) a štěpí jeho cílovou RNA sekvenci , podobnou té v 5' nepřeložené oblasti (5'UTR) lidského rinoviru -14 (HRV- 14); sekvence nerozpoznaná nemodifikovanými DNAzymy [16] .

Terapie

Terapeutické využití oligonukleotidů na bázi LNA je novou oblastí biotechnologie [17] . U různých oligonukleotidů LNA byly hodnoceny jejich farmakokinetické a toxické profily. Studie dospěly k závěru, že toxicita LNA je obecně nezávislá na oligonukleotidové sekvenci a vykazuje preferovaný bezpečnostní profil pro translatovatelné terapeutické aplikace [11] .

LNA byla zkoumána pro své terapeutické vlastnosti při léčbě rakoviny a infekčních onemocnění. Blokovaná antisense molekula fosforothioátu nukleové kyseliny, nazvaná SPC2996, byla navržena tak, aby cílila na mRNA kódující onkoprotein Bcl-2, protein, který inhibuje apoptózu v buňkách chronické lymfocytární leukémie (CLL). Klinické studie fáze I a II prokázaly na dávce závislé snížení počtu cirkulujících buněk CLL u přibližně 30 % vzorku, což naznačuje další studii SPC2996 [18] .

LNA byla také aplikována na Miravirsen , experimentální léčivo pro hepatitidu C , což je 15nukleotidová fosforothioátová sekvence s vazebnou specifitou pro MiR-122 ( miRNA exprimovaná v hepatocytech ) [19] [20] .

Detekce a diagnostika

Alelicky specifická PCR využívající LNA umožňuje navrhnout kratší primery bez obětování vazebné specificity [21] .

LNA byla zahrnuta do fluorescenční in situ hybridizace (FISH) [22] . FISH je běžná technika používaná k vizualizaci genetického materiálu v různých buňkách, ale studie ukázaly, že tato technika byla omezena špatnou hybridizační účinností sond. Naopak sondy začleněné do LNA prokázaly zvýšenou účinnost hybridizace v DNA i RNA . Zlepšená výkonnost FISH se zahrnutím LNA vedla k FISH analýze lidských chromozomů, několika nehumánních buněčných typů a mikročipů [22] .

Byly také provedeny testy genotypizace LNA, konkrétně k detekci mutací v apolipoproteinu B [23] .

Kvůli své vysoké schopnosti rozlišovat mezi nekonzistencemi byla LNA studována pro její použití v diagnostických nástrojích. Imobilizované sondy LNA byly zavedeny do multiplexních testů genotypizace SNP [24] .

Editace genů

LNA-modifikované ssODN (syntetické jednořetězcové DNA oligonukleotidy) mohou být použity, jako běžné ssODN, k úpravě genů s jednou bází. Použití LNA na zamýšleném místě modifikace nebo v jeho blízkosti zabraňuje opravě chybného párování DNA díky vyšší termodynamické stabilitě, kterou má [25] .

Reference

1. ↑ Elayadi, Anissa N. (srpen 2002). „Důsledky vysokoafinitní hybridizace pomocí oligomerů uzamčených nukleových kyselin pro inhibici lidské telomerázy †“ . biochemie _ _ ]. 41 (31): 9973-9981. DOI : 10.1021/bi025907j . ISSN  0006-2960 . PMID  12146961 .
2. ↑ Kurreck, J. (2002-05-01). „Návrh antisense oligonukleotidů stabilizovaných uzamčenými nukleovými kyselinami“. Výzkum nukleových kyselin . 30 (9): 1911-1918. DOI : 10.1093/nar/30.9.1911 . PMID  11972327 .
3. ↑ Frieden, M. (2003-11-01). „Rozšíření horizontu návrhu antisense oligonukleotidů s alfa-L-LNA“. Výzkum nukleových kyselin ]. 31 (21): 6365-6372. DOI : 10.1093/nar/gkg820 . ISSN  1362-4962 . PMID  14576324 .
4. ↑ Frieden, Miriam (říjen 2003). „Nukleázová stabilita LNA oligonukleotidů a chimér LNA-DNA“ . Nukleosidy, nukleotidy a nukleové kyseliny ]. 22 (5-8): 1041-1043. DOI : 10.1081/NCN-120022731 . ISSN  1525-7770 . PMID  14565339 .
5. ↑ Morita, K. (2001-11-01). „2'-O, 4'-C-Ethylenem přemostěné nukleové kyseliny (ENA) s nukleázovou rezistencí a vysokou afinitou k RNA“. Cyklus Symposium Nucleic Acids ]. 1 (1): 241-242. DOI : 10.1093/nass/1.1.241 . ISSN  0261-3166 . PMID  12836354 .
6. ↑ Medicinální chemie nukleových kyselin . - Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 2011. - 1 online zdroj str. - ISBN 978-1-118-09280-4 , 1-118-09280-5 , 978-1-118-09283-5 , 1-118-09283-X 283-23990-5, 1-118-09281 , 978-1-118-09281-1.
7. ↑ 1 2 Obika, Satoshi (1997-12-15). „Syntéza 2'-0,4'-C-methylenuridinu a -cytidinu. Nové bicyklické nukleosidy s pevným cukerným zvrásněním C3, -endo“ . Tetrahedron Letters [ anglicky ] ]. 38 (50): 8735-8738. DOI : 10.1016/S0040-4039(97)10322-7 . ISSN  0040-4039 .
8. ↑ Orum, Miriam Frieden a Henrik (2008-03-31). „Uzamčená nukleová kyselina je příslibem v léčbě rakoviny“ . Současný farmaceutický design ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Staženo 2020-10-06 . 
9. ↑ Zámečník, PC (1978-01-01). „Inhibice replikace viru Rousova sarkomu a transformace buněk specifickým oligodeoxynukleotidem“. Proceedings of the National Academy of Sciences ]. 75 (1): 280-284. Bibcode : 1978PNAS...75..280Z . DOI : 10.1073/pnas.75.1.280 . ISSN 0027-8424 . PMID 75545 .  
10. ↑ Koškin, Alexej A. (2001-12-01). „Zjednodušená a účinná cesta k bicyklickým ribonukleosidům vázaným na 2'-O, 4'-C-methylenovou vazbu (uzamčená nukleová kyselina)“ . The Journal of Organic Chemistry . 66 (25): 8504-8512. doi : 10.1021/ jo010732p . ISSN 0022-3263 . PMID 11735531 .  
11. ↑ 1 2 Orum, Miriam Frieden a Henrik (2008-03-31). „Uzamčená nukleová kyselina je příslibem v léčbě rakoviny“ . Současný farmaceutický design ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Staženo 2020-10-06 . Orum, Miriam Frieden a Henrik (2008-03-31). „Uzamčená nukleová kyselina je příslibem v léčbě rakoviny“ . Současný farmaceutický design . 14 (11): 1138-1142. doi : 10.2174/138161208784246234 . PMID  18473860 . Staženo 2020-10-06 .
12. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). „Enzymatická inkorporace nukleotidů LNA do řetězců DNA“ . ChemBioChem [ anglicky ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . 
13. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). „Enzymatická inkorporace nukleotidů LNA do řetězců DNA“ . ChemBioChem [ anglicky ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (2007-03-26). „Enzymatická inkorporace nukleotidů LNA do řetězců DNA“ . ChemBioChem . 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/cbic.200600501 . PMID  17315250 . S2CID  10206060 .
14. ↑ Breaker, R. R. (prosinec 1994). „DNA enzym, který štěpí RNA“ . Chemie a biologie . 1 (4): 223-229. DOI : 10.1016/1074-5521(94)90014-0 . ISSN  1074-5521 . PMID  9383394 .
15. ↑ Vester, Birte (listopad 2002). „LNAzymy: Začlenění monomerů typu LNA do DNAzymů výrazně zvyšuje štěpení RNA“ . Journal of the American Chemical Society ]. 124 (46): 13682-13683. DOI : 10.1021/ja0276220 . ISSN 0002-7863 . PMID 12431091 .  
16. ↑ Schubert, Steffen (květen 2004). "Získání cílového přístupu pro deoxyribozymy." Journal of Molecular Biology ]. 339 (2): 355-363. DOI : 10.1016/j.jmb.2004.03.064 . PMID 15136038 . 
17. ↑ „LNA: všestranný nástroj pro terapii a genomiku“. Trendy v biotechnologii . 21 (2): 74-81. únor 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
18. ↑ Dürig, J. (duben 2011). "Nový antisense inhibitor Bcl-2 SPC2996 způsobuje rychlou clearance leukemických buněk a imunitní aktivaci u chronické lymfocytární leukémie." leukémie [ anglicky ] ]. 25 (4): 638-647. DOI : 10.1038/leu.2010.322 . ISSN  1476-5551 . PMID21358717  . _
19. ↑ Gebert, Luca F. R. (2014-01-01). "Miravirsen (SPC3649) může inhibovat biogenezi miR-122." Výzkum nukleových kyselin . 42 (1): 609-621. doi : 10.1093/nar/ gkt852 . ISSN 0305-1048 . PMID24068553 . _  
20. ↑ Bonneau, E. (24. 6. 2019). „Jak blízko jsou miRNA od klinické praxe? Pohled na diagnostický a terapeutický trh“. EJIFCC . 30 (2): 114-127. ISSN  1650-3414 . PMID  31263388 .
21. ↑ Bonetta L (2005). „Prime time for real-time PCR“. Nat. Metody . 2 (4): 305-312. DOI : 10.1038/nmeth0405-305 .
22. ↑ 1 2 Kubota, Kengo (srpen 2006). „Vylepšená účinnost hybridizace in situ se sondami DNA se začleněnými uzamčenými nukleovými kyselinami“. Aplikovaná a environmentální mikrobiologie . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .
23. ↑ Kubota, Kengo (srpen 2006). „Vylepšená účinnost hybridizace in situ se sondami DNA se začleněnými uzamčenými nukleovými kyselinami“. Aplikovaná a environmentální mikrobiologie . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (srpen 2006). „Vylepšená účinnost hybridizace in situ se sondami DNA začleněnými do uzamčené nukleové kyseliny“ . Aplikovaná a environmentální mikrobiologie . 72 (8): 5311-5317. doi : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMC  1538721 . PMID  16885281 .
24. ↑ „LNA: všestranný nástroj pro terapii a genomiku“. Trendy v biotechnologii . 21 (2): 74-81. únor 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .Petersen M, Wengel J (únor 2003). „LNA: všestranný nástroj pro terapii a genomiku“. Trendy v biotechnologii . 21 (2): 74-81. doi : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
25. ↑ van Ravesteyn, TW (12. dubna 2016). "Modifikace LNA jednořetězcových DNA oligonukleotidů umožňuje jemnou genovou modifikaci v buňkách schopných opravy chybného párování." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 113 (15): 4122-7. DOI : 10.1073/pnas.1513315113 . PMID  26951689 .