Malé interferující RNA

Malá interferující RNA nebo krátká interferující RNA ( anglicky  siRNA, small interfering RNA ) je třída dvouvláknové RNA o délce 20-25 nukleotidů . Interakce malých interferujících RNA s messenger RNA (mRNA) cílového genu vede k degradaci cílového genu (v procesu RNA interference ), čímž se zabrání translaci mRNA na ribozomech do proteinu, který kóduje . V konečném důsledku je účinek malých interferujících RNA totožný s účinkem pouhého snížení genové exprese .

V buňce je interference RNA důležitou součástí antivirových obranných mechanismů a udržování struktury chromatinu . V současnosti jsou zkoumány molekulární mechanismy těchto interakcí, konkrétně byla navržena hypotéza účasti malých RNA na RNA-dependentní metylaci DNA [1] .

Historie

Malé interferující RNA byly objeveny v roce 1999 skupinou Davida Bolcomba ve Velké Británii jako součást post-transkripčního systému umlčování genů v rostlinách. Skupina zveřejnila své poznatky v časopise Science [2] .

V roce 2001 skupina Thomase Tuschla ukázala, že syntetické malé interferující RNA mohou vyvolat interferenci RNA v savčích buňkách. Odpovídající výsledky byly publikovány v časopise Nature [3] . Tento objev vedl k rostoucímu zájmu o využití RNA interference pro biomedicínský výzkum a vývoj léků.

Struktura

Malé interferující RNA jsou krátké (typicky dlouhé 21 nukleotidů) dvouvláknové RNA se dvěma nepárovými přesahy na 3' koncích.

Každý ze dvou řetězců RNA má fosfátovou skupinu na 5' konci a hydroxylovou skupinu na 3' konci. Krátké interferující RNA s touto strukturou vznikají jako výsledek aktivity enzymu Dicer , jehož substráty jsou dlouhé dvouvláknové RNA nebo krátké RNA obsahující vlásenky [4] . Malé interferující RNA mohou být uměle zavedeny do buněk, aby srazily konkrétní gen. V tomto případě lze cíleně změnit expresi téměř jakéhokoli genu se známou nukleotidovou sekvencí. Tato vlastnost dělá z krátkých interferujících RNA vhodný nástroj pro studium genových funkcí a studium cílů léků.

Indukce RNA interference

Cílená suprese genové exprese transfekcí exogenní interferující RNA do buněk je spojena s určitými obtížemi, protože knockdown genu je v tomto případě dočasný, zejména u rychle se dělících buněk. Jedním ze způsobů, jak tyto obtíže překonat, je zavést do buňky vektor , který zajistí expresi odpovídající malé interferující RNA na delší dobu [5] . Takový vektor typicky obsahuje U6 nebo H1 promotor , který umožňuje transkripci RNA polymerázou III , která přepisuje malé jaderné RNA . Za promotorem následuje krátká sekvence nukleotidů kódujících malou interferující RNA (19–29 nukleotidů) a k ní komplementární sekvence, které jsou odděleny 4–11 nukleotidy, které tvoří smyčku v sekundární struktuře malé interferující RNA. Obecně se odpovídající transkript podobá tvaru vlásenky v důsledku komplementárního párování sekvencí na svém začátku a konci. Existuje hypotéza (ačkoli není spolehlivě prokázána), že takové vlásenky jsou poté pomocí enzymu Dicer přeměněny na krátké interferující RNA .

Aktivace genu závislá na RNA

Dvouřetězcová RNA může zvýšit genovou expresi mechanismem nazývaným aktivace genu závislá na RNA ( RNAa  , malá aktivace genu vyvolaná RNA ). Bylo ukázáno, že dvouvláknové RNA komplementární k promotorům cílových genů způsobují aktivaci odpovídajících genů. Aktivace závislá na RNA po podání syntetických dvouvláknových RNA byla prokázána v lidských buňkách. Není známo, zda podobný systém existuje v buňkách jiných organismů. [6]

Vyloučení nespecifických vlivů

Protože interference RNA se protíná s mnoha dalšími řetězci reakcí, experimentální zavedení malých interferujících RNA může zapnout nespecifické účinky. Výskyt dvouřetězcových RNA v savčích buňkách může být důsledkem infekce virem, a proto vede ke spuštění imunitní reakce. Navíc, protože strukturně podobné mikroRNA mění genovou expresi nesprávným párováním s cílovou mRNA, zavedení malých interferujících RNA může způsobit nežádoucí vedlejší účinek.

Vrozená imunita

Zavedení značného množství malých interferujících RNA může způsobit vedlejší účinky v důsledku skutečnosti, že je zapnutá vrozená imunitní odpověď. Je to pravděpodobně způsobeno aktivací proteinkinázy R, která je citlivá na malé interferující RNA, možná také zapojením genu RIG I ( retinoic acid inducible gene I ) .  Byla také popsána indukce cytokinů prostřednictvím receptoru TLR 7 ( toll-like receptor 7 ) . Jednou slibnou metodou pro snížení vedlejších účinků je přeměna malých interferujících RNA na miRNA. MikroRNA jsou normálně syntetizovány, a proto relativně nízká koncentrace vytvořených malých interferujících RNA může vést k efektu knockdown genu srovnatelné síly. To by mělo minimalizovat vedlejší účinky.  

Vedlejší účinky

Selhání cíle je další obtíž při použití malých interferujících RNA jako nástroje k dosažení genového knockdownu. Geny s neúplnou komplementaritou jsou blokovány malými interferujícími RNA (tj. ve skutečnosti se malé interferující RNA chovají jako miRNA), což vede k potížím při interpretaci výsledků experimentů a přináší riziko toxicity. Tomu se však lze vyhnout navržením vhodných kontrol a navržením algoritmů pro konstrukci malých interferujících RNA, jejichž výsledkem jsou takové RNA, které neselhávají v cíli. Genová exprese pak může být analyzována napříč genomem, například pomocí technologie microarray , pro kontrolu selhání cíle a pro další vyladění algoritmů .  Článek laboratoře Dr. Khvorové z roku 2006 zkoumá fragmenty o 6 nebo 7 párech bází začínajících na pozici 2 v malé interferující RNA odpovídající oblasti 3'UTR v genech, kde cíl selže [7] .

Možné aplikace v terapii a překážky k tomu

Díky schopnosti libovolně vypnout v podstatě jakýkoli gen vyvolala interference RNA založená na malých interferujících RNA obrovský zájem o základní [8] a aplikovanou biologii. Počet rozsáhlých testů založených na RNAi k identifikaci důležitých genů v biochemických drahách neustále roste. Vzhledem k tomu, že vývoj onemocnění je dán také aktivitou genů, očekává se, že v některých případech může mít vypnutí genu s malou interferující RNA terapeutický účinek.

Aplikace RNA interference založené na malých interferujících RNA na zvířata, a zejména na lidi, však čelí mnoha obtížím. Experimenty ukázaly, že účinnost malých interferujících RNA je různá pro různé typy buněk: některé buňky snadno reagují na působení malých interferujících RNA a vykazují pokles genové exprese, zatímco u jiných to není pozorováno, navzdory účinné transfekci . Důvody tohoto jevu jsou stále špatně pochopeny.

Výsledky prvních dvou fázových zkoušek prvních dvou terapeutických léků interferujících s RNA (určených pro léčbu makulární degenerace ), publikovaných na konci roku 2005, ukazují, že léky založené na malých interferujících RNA jsou pacienty snadno tolerovány a mají přijatelné farmakokinetické vlastnosti [9] .

Předběžné klinické studie malých interferujících RNA zaměřených na virus Ebola naznačují, že mohou být účinné pro postexpoziční profylaxi onemocnění. Tento lék umožnil přežití celé skupiny experimentálních primátů, kteří dostali smrtelnou dávku zairského ebolaviru [10] .

V roce 2021 si Ústav imunologie Federální lékařské a biologické agentury Ruska patentoval kombinovaný lék MIR-19 na bázi malé interferující RNA určený pro použití u COVID-19 [11] .

Viz také

• miRNA

Poznámky

1. ↑ Galitsky V.A. Hypotéza o mechanismu iniciace de novo metylace DNA a alelické exkluze malými RNA  (rusky)  // Tsitol. - 2008. - T. 50 (4) . - S. 277-286 .
2. ↑ Hamilton A., Baulcombe D. Druh malé antisense RNA v posttranskripčním umlčování genů v rostlinách  //  Science : journal. - 1999. - Sv. 286 , č.p. 5441 . - S. 950-952 . - doi : 10.1126/science.286.5441.950 . — PMID 10542148 .
3. ↑ Elbashir S., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. Duplexy 21-nukleotidových RNA zprostředkovávají RNA interferenci v kultivovaných savčích buňkách  //  Nature : journal. - 2001. - Sv. 411 , č.p. 6836 . - str. 494-498 . - doi : 10.1038/35078107 . — PMID 11373684 .
4. ↑ Bernstein E., Caudy A., Hammond S., Hannon G. Role pro bidentátní ribonukleázu v iniciačním kroku RNA interference  //  Nature : journal. - 2001. - Sv. 409 , č.p. 6818 . - str. 363-366 . - doi : 10.1038/35053110 . — PMID 11201747 .
5. ↑ Miyagishi M., Taira K. Vývoj a aplikace expresního vektoru siRNA  //  Nucleic Acids Research Supplement : deník. - 2002. - Sv. 2 . - str. 113-114 . — PMID 12903131 .
6. ↑ Li LC Malá aktivace genu zprostředkovaná RNA // RNA a regulace genové exprese: Skrytá vrstva  složitosti . – Caister Academic Press, 2008.
7. ↑ Birmingham A., Anderson E., Reynolds A., Ilsley-Tyree D., Leake D., Fedorov Y., Baskerville S., Maksimova E., Robinson K., Karpilow J., Marshall W., Khvorova A. 3' Shody semena UTR, ale ne celková identita, jsou spojeny s RNAi mimo cíle  // Nat Methods  : journal  . - 2006. - Sv. 3 , ne. 3 . - str. 199-204 . - doi : 10.1038/nmeth854 . — PMID 16489337 .
8. ↑ Alekseev OM, Richardson RT, Alekseev O., O'Rand MG Analýza profilů genové exprese v buňkách HeLa v reakci na nadměrnou expresi nebo depleci NASP zprostředkovanou siRNA  //  Reprodukční biologie a endokrinologie: časopis. - 2009. - Sv. 7 . — S. 45 . - doi : 10.1186/1477-7827-7-45 . — PMID 19439102 .
9. ↑ Tansey B. Léčba makulární degenerace zasahuje do zpráv RNA , San Francisco Chronicle (11. srpna 2006). Archivováno z originálu 6. března 2009. Staženo 13. července 2022.
10. ↑ Postexpoziční ochrana subhumánních primátů proti smrtelnému napadení virem Ebola s interferencí RNA: studie prokazující koncepci Prof. Thomas W Geisbert PhD, Amy CH Lee MSc, Marjorie Robbins PhD, Joan B Geisbert, Anna N Honko PhD, Vandana DOI: 10.1016/S0140-6736(10)60357-1
11. ↑ FMBA patentovala nosní sprej pro COVID-19 Archivní kopii ze dne 24. června 2021 na Wayback Machine // Článek z 11. dubna 2021 „ RBC “. M. Kotlyar, A. Batmanová.

Literatura

• Shen, W., Wang, Q., Shen, Y., Gao, X., Li, L., Yan, Y., ... & Cheng, Y. (2018). Katechin ze zeleného čaje dramaticky podporuje RNAi zprostředkovanou nízkomolekulárními polymery . Ústřední věda ACS, 4(10), 1326-1333. PMC 6202644 doi : 10.1021/accentsci.8b00363
• Charbe, NB, Amnerkar, ND, Ramesh, B., Tambuwala, MM, Bakshi, HA, Aljabali, AA, ... & Zacconi, FC (2020). Malá interferující RNA pro léčbu rakoviny: překonávání překážek při porodu. Acta Pharmaceutica Sinica B. PMC 7714980 doi : 10.1016/j.apsb.2020.10.005
• Zhang, M., & Huang, Y. (2022). siRNA modifikace a dodání pro vývoj léčiv . Trendy v molekulární medicíně. doi : 10.1016/j.molmed.2022.08.003

Slovníky a encyklopedie	Skvělý norský Britannica (online) Brockhaus