Syntéza oligonukleotidů

Syntéza oligonukleotidů  je chemická syntéza relativně krátkých fragmentů nukleových kyselin s danou chemickou strukturou (sekvencí). Metoda se používá v moderní laboratorní praxi k získání oligonukleotidů požadované sekvence rychlým a nenákladným způsobem.

Nejběžnější způsob syntézy oligonukleotidů je založen na použití amidofosfitů  , stavebních bloků , které jsou reaktivními deriváty deoxyribonukleosidů ( dA , dC , dG , T ) nebo ribonukleosidů ( A , C , G , U ) a umožňují syntézu krátké fragmenty DNA a RNA , v daném pořadí . Používají se i jiné amidofosfity, které umožňují zavést do produktového řetězce modifikované nukleosidy, různé značky a funkční skupiny . Během syntézy se tato činidla postupně přidávají v pořadí specifikovaném sekvencí cílového produktu k řetězci rostoucímu na nosiči v pevné fázi . Tento proces byl koncem 70. let plně automatizován a v současnosti se provádí ve vyhrazených počítačově řízených syntezátorech.

Po dokončení syntézy se oligonukleotid oddělí od nosiče, odstraní se ochranné skupiny použité během syntézy a výsledný produkt se přečistí elektroforézou nebo HPLC .

Syntetické oligonukleotidy jsou široce používány v molekulární biologii a medicíně, například jako antisense oligonukleotidy, primery pro sekvenování a amplifikaci DNA , sondy pro stanovení komplementárních sekvencí DNA a RNA, nástroje pro cílené zavádění mutací a restrikčních míst a pro syntézu umělé geny .

Historie

Během evoluce syntézy oligonukleotidů byly vyvinuty čtyři hlavní metody k vytvoření vazeb mezi nukleosidy . Tyto metody jsou podrobně rozebrány v podrobných přehledech literatury [1] [2] [3] .

Raná práce a moderní H-fosfonátová metoda

Na počátku 50. let položila skupina Alexandra Todda z Cambridge základ H-fosfonátových a fosfotriesterových metod syntézy oligonukleotidů [4] [5] syntézou chráněného chlorfosfátu 4 , jeho reakcí s 3'-chráněným thymidinem 5 a potvrzení struktury výsledného chráněného dinukleotidu 6 enzymatickým štěpením. Kupodivu žádná další práce v tomto směru nebyla v Cambridge provedena (Todd ve své autobiografii poznamenal, že syntéza oligonukleotidů ho nepřitahovala) [1] .

Návrat k Toddově práci nastal až o třicet let později, kdy dvě výzkumné skupiny upravily kondenzaci H-fosfonátu na syntézu na pevné fázi za použití nukleosidových H-fosfonátů jako stavebních bloků a pivaloylchloridu , 2,4,6-triisopropylbenzensulfonylchloridu (TIPS- Cl) a další sloučeniny - jako aktivátory [6] [7] . V praxi byla metoda organizována jako jednoduchý syntetický cyklus sestávající ze dvou fází: odstranění dimethoxytritylové ochrany a kondenzace.

Oxidace H-fosfonátové diesterové vazby mezi nukleosidy v této metodě se provádí po syntéze oligonukleotidového řetězce působením roztoku jodu ve vodném pyridinu . V případě potřeby lze oxidaci provést v bezvodém prostředí [8] . Metoda také umožňuje syntetizovat thiofosfátové [9] a selenofosfátové [10] analogy oligonukleotidů. Oxidace tetrachlormethanem v přítomnosti primárních a sekundárních aminů vede k analogům amidofosfátu [11] [12] .

Zpravidla je 5'-hydroxylová skupina ve všech 3'-H-fosfonátech nukleosidů a aminoskupina v H-fosfonátech nukleosidů s bázemi A, G a C chráněna před použitím při syntéze stejnými skupinami jako v amidofosfitové metodě . Ochrana aminoskupin však není striktně vyžadována [8] [13] .

Fosfodiesterová metoda

V 50. letech 20. století Har Gobind Korana a spolupracovníci vyvinuli fosfodiesterovou metodu, při které byl 3' - O -acetylnukleosid-5'- O - fosfát aktivován N , N' -dicyklohexylkarbodiimidem (DCC) nebo p -toluensulfonylchloridem ( TsCl ) . a poté injikován v reakci s 5'- O - chráněným nukleosidem za vzniku dinukleosidmonofosfátu [14] . Po odstranění ochranné acetylové skupiny v základním médiu bylo provedeno další prodlužování řetězce. Soubory tri- a tetramerních oligonukleotidů byly syntetizovány postupnou kondenzací. Kromě toho byla provedena kondenzace oligomerních fragmentů za účelem získání delších oligonukleotidů [1] .

Ochrana fosfátových skupin při syntéze fosfodiesterů nebyla použita, což zřejmě vedlo k vedlejším reakcím a snížilo výtěžek syntézy. Korana však věřil, že umístění ochrany na fosfátové skupiny by vedlo ke ztrátě hlavní výhody oligonukleotidů – jejich polyelektrolytové povahy, která, jak věřil, by mohla být účinně použita k čištění oligonukleotidů. Důležitým objevem Koránu bylo použití tritylových ochranných skupin k ochraně 5'-hydroxylových nukleosidů [1] .

Metoda fosfotrietheru

V 60. letech 20. století skupiny vedené R. Letsingerem ( eng.  R. Letsinger ) [15] [16] a K. Reese ( eng.  C. Reese ) [17] vyvinuly fosfotriesterovou metodu. Definujícím rozdílem od fosfodiesterového přístupu je předběžná ochrana fosfátu v reaktantu a produktu kyanoethylovou skupinou -CH2CH2CN . Tato změna eliminovala možnost větvení oligonukleotidů na fosfátových skupinách. Větší selektivita metody umožnila použít reaktivnější kondenzační činidla a katalyzátory [18] [19] , což výrazně zkrátilo dobu trvání syntézy. Fosfotriesterová metoda byla implementována jak v roztoku, tak v pevné fázi [1] .

Touto metodou bylo možné syntetizovat dva dvouvláknové oligonukleotidy o délce 77 a 104 párů bází, jejichž sekvence odpovídala řetězcům A a B inzulinu , což následně umožnilo úspěšnou expresi těchto genů [1] .

Fosfitová triesterová metoda

V 70. letech byla do praxe zavedena fosfittriesterová metoda tvorby internukleosidových vazeb, při které se používaly mnohem reaktivnější nukleosidové deriváty na bázi P(III), původně chlorofosfitů [20] . Později skupina vedená M. Caruthersem použila méně agresivní a selektivnější 1H- tetrazolidfosfity a implementovala metodu ve verzi na pevné fázi [21] . Krátce poté zaměstnanci ze stejné skupiny vylepšili metodu použitím stabilnějších nukleosidových amidofosfitů jako stavebních bloků . Nahrazením méně praktické methylfosfátové chránící skupiny [22] [23] [24] pohodlnější 2-kyanoethylovou skupinou [25] vznikla varianta nukleosidových amidofosfitů, která je dnes stále standardním činidlem pro syntézu oligonukleotidů. Četná další vylepšení metod syntézy monomerních bloků, syntetizátorů oligonukleotidů a protokolů sestavování a deblokování změnila amidofosforitanový přístup ve velmi spolehlivou a produktivní metodu získávání syntetických oligonukleotidů [26] .  

Syntéza amidofosfitovou metodou

Stavební bloky

Nukleosidové amidofosfity

V roce 1976 Letsinger a spolupracovníci zjistili, že sloučeniny trojmocného fosforu jsou mnohem aktivnějšími činidly než odpovídající deriváty pětimocného fosforu. Úloha sloučenin P(III) se stala evidentní po vývoji N,N -diisopropylamidfosfitových derivátů nukleosidů ( nukleosid amidofosfitů ) [1] [22] od M. Carrutherse , které stále hrají roli standardních stavebních bloků v amidu dnešní metoda syntézy fosfitu. Aby se zabránilo nežádoucím vedlejším reakcím, musí být funkční skupiny amidofosfitů blokovány ochrannými skupinami . Po dokončení sestavení oligonukleotidového řetězce jsou všechny chránící skupiny odstraněny, což vede k cílovému oligonukleotidu. Níže jsou uvedeny ochranné skupiny používané ve standardních komerčně dostupných nukleosidových amidofosfitech [27] :

  • Hydroxylová skupina v poloze 5' je chráněna 4,4'-dimethoxytritylovou (DMT) ochrannou skupinou, která se odstraní za kyselých podmínek.
  • Thymin a uracil , dusíkaté báze thymidinu a uridinu , v tomto pořadí, nemají exocyklické aminoskupiny, takže nepotřebují ochranné skupiny. Guanin má exocyklickou aminoskupinu s nízkou zásaditostí , takže za podmínek kondenzační reakce nereaguje postranně s amidofosfity. Amidofosforitanové činidlo na bázi N2-nechráněného 5' - 0 -DMT-2'-deoxyguanosinu je však špatně rozpustné v acetonitrilu  , rozpouštědle nejběžněji používaném při syntéze oligonukleotidů. Naopak N2-chráněné deriváty téže sloučeniny jsou vysoce rozpustné v acetonitrilu, a proto se používají mnohem více. Dusíkaté báze adenin a cytosin obsahují aminoskupiny, které mohou během syntézy reagovat s amidofosfity, a proto musí být tyto skupiny pro syntézu za standardních podmínek chráněny. Nicméně zavedením dalších stupňů do syntetického cyklu je možné dosáhnout použití nechráněných amidofosfitů dA a dC [28] . Chránící skupiny na dusíkatých bázích musí být zachovány během syntézy, proto se používají skupiny, jejichž reaktivita je opačná než reaktivita 4,4'-dimethoxytritylové skupiny, která se odstraňuje po každém cyklu. Níže jsou popsány dva nejpoužívanější přístupy.
    • V prvním standardním přístupu se k ochraně adeninu a cytosinu používá benzoylová ochrana (Bz) , zatímco guanin je chráněn isobutyrylovou skupinou ( iBu ) [29] . Později byla pro ochranu cytosinu navržena acetylová (Ac) skupina , kterou lze odstranit pomocí amoniaku nebo směsi amoniaku a methylaminu [30] .
    • Ve druhém, mírnějším, ochranném schématu je adenin chráněn isobutyrylovými [31] nebo fenoxyacetylovými (PAC) [32] skupinami. Cytosin obsahuje acetylovou ochrannou skupinu [30] , zatímco guanin je chráněn 4-isopropylfenoxyacetylovými ( i Pr-PAC) [33] nebo dimethylformamidinovými (dmf) [34] skupinami. Měkké ochranné skupiny se odstraňují snadněji než standardní, avšak amidofosfity s těmito skupinami jsou při skladování v roztoku méně stabilní.
  • Fosfitová skupina je chráněna 2-kyanoethylovou skupinou [25] . Přítomnost fosfitové ochrany je povinná pro amidofosfit a nově vytvořenou fosfitovou triesterovou skupinu předtím, než je fosfitová triesterová skupina oxidována na fosfotriester. Současně není přítomnost ochrany na fosfátových skupinách již sestaveného oligonukleotidového fragmentu nezbytná pro úspěšné další kondenzační cykly [35] .
  • Syntéza RNA využívá stavební bloky s "extra" 2'-hydroxylovou skupinou, která se syntézy neúčastní. Je chráněn terc - butyldimethylsilylovou (TBDMS) [36] [37] [38] nebo triisopropylsilyloxymethylovou (TOM) [39] [40] skupinou. Obě skupiny se odstraňují působením fluoridového iontu.
  • Fosfitová skupina také obsahuje diisopropylaminovou skupinu ( i - Pr2N ) reaktivní za kyselých podmínek. Po aktivaci působením kyselého katalyzátoru je tato skupina nahrazena 5'-hydroxylovou skupinou rostoucího řetězce [22] .
Nenukleosidové amidofosfity

Nenukleosidové amidofosfity jsou amidofosfitová činidla navržená pro zavedení různých funkčních skupin a značek na koncovou pozici oligonukleotidu nebo mezi nukleotidové zbytky uprostřed sekvence. Aby byl amidofosfit vhodný pro zavedení do střední části řetězce, musí obsahovat alespoň dvě hydroxylové skupiny, z nichž jedna je chráněna skupinou DMT a druhá nese reaktivní amidofosfitovou skupinu.

Nenukleosidové amidofosfity se používají k zavedení různých skupin, které se nenacházejí v přírodních nukleosidech, do oligonukleotidu. Byla syntetizována široká škála podobných činidel, sloužících například pro zavedení 5'-fosfátových [41] , aminoskupin [42] , merkaptoskupiny [ 43] , aldehydových [44] a karboxylových [45] skupin, alkynové fragmenty [46] , fluorescenční barviva [47] a zhášedla, hydrofilní [48] a hydrofobní [49] modifikace, biotin [50] atd.

Syntetický cyklus

Syntéza oligonukleotidů se provádí postupnou kondenzací stavebních bloků k 5'-konci rostoucího řetězce, dokud není sestavena cílová sekvence. Výskyt vedlejších reakcí omezuje délku syntetizovaného oligonukleotidu (až 200 nukleotidových zbytků), protože počet chyb se kumuluje s rostoucí délkou cílového produktu [26] . Soubor operací potřebných k prodloužení řetězce o jeden nukleotidový zbytek se nazývá cyklus syntézy a skládá se ze čtyř chemických reakcí.

Fáze 1: Odstranění tritylové ochrany

DMT chránící skupina se odstraní kyselým roztokem, jako je 2% kyselina trichloroctová nebo 3% kyselina dichloroctová v inertním rozpouštědle ( methylenchlorid nebo toluen ). Výsledný oranžový dimethoxytritylový kationt se vymyje ze systému. Výsledkem je vytvoření oligonukleotidového prekurzoru s volnou 5'-hydroxylovou skupinou fixovanou na nosiči v pevné fázi. Delší provádění procesu nebo použití koncentrovanějších kyselých roztoků vede k vedlejší reakci depurinace  - odstranění purinových bází z ribózového zbytku .

Fáze 2: Kondenzace

Roztok nukleosidového amidofosfitu (0,02–0,2 M) nebo směs několika amidofosfitů v acetonitrilu se aktivuje 0,2–0,7 M roztokem kyselého katalyzátoru na bázi azolu : 1H - tetrazol , 2-ethylthiotetrazol [51] , 2 -benzylthiotetrazol [52] , 4,5-dicyanimidazol [53] atd. Ke smíchání složek dochází v komunikačních linkách syntetizátoru při dodávání činidel do reaktoru obsahujícího nosič v pevné fázi. Aktivovaný amidofosfit v 1,5-20násobném přebytku se zavede do interakce s 5'-hydroxylovou skupinou, čímž se vytvoří fosfitová triesterová vazba. Kondenzace amidofosfitů 2'-deoxynukleosidů probíhá velmi rychle a v malém měřítku trvá zpravidla asi 20 sekund. Stéricky bráněné amidofosfity ribonukleosidů reagují mnohem pomaleji (5-15 min) [54] [55] [56] [57] . Reakce je poměrně citlivá na přítomnost vody, zejména při použití zředěných roztoků amidofosforitanů, proto se provádí v bezvodém rozpouštědle, obvykle acetonitrilu . S rostoucím rozsahem syntézy se používají menší přebytky a koncentrovanější roztoky amidofosforitanů. Po dokončení reakce se přebytečné reaktanty a vedlejší produkty odstraní z reaktoru promytím.

Fáze 3: Uzavření

Uzavírání se provádí tak, že se na pevný nosič působí směsí acetanhydridu a 1-methylimidazolu (méně často DMAP ) jako katalyzátoru . V rámci syntézy amidofosfitu slouží tento krok dvěma účelům:

  • Po dokončení kondenzační fáze zůstane malá část 5'-hydroxylových skupin (0,1-1 %) nezreagovaná a musí být odstraněna z procesu dalšího prodlužování řetězce, aby se zabránilo tvorbě oligonukleotidů s chybějícími nukleotidovými zbytky uvnitř řetěz. Za tímto účelem jsou zbývající hydroxylové skupiny chráněny acetylovými skupinami, které jsou odolné vůči kyselým roztokům používaným k odstranění ochrany DMT.
  • Bylo také popsáno, že amidofosfity aktivované 1H- tetrazolem reagují v nízkém výtěžku s karbonylovým kyslíkem v poloze O 6 guanosinu [ 58] . Při oxidaci směsí jódu a vody podléhá tento vedlejší produkt štěpení purinové báze. Výsledná apurinová místa se snadno hydrolyzují během konečné deprotekce oligonukleotidu, což vede k vytvoření dvou kratších oligonukleotidů a snížení výtěžku cílového produktu. O6 modifikace jsou rychle odstraněny působením zakončovacího činidla, pokud se zakrytí provádí před oxidačním krokem.
Fáze 4: Oxidace

Internukleosidová tříkoordinovaná fosfitová skupina získaná jako výsledek kondenzace není přirozená a má omezenou stabilitu za podmínek syntézy. Zpracování nosiče jódem a vodou v přítomnosti slabé báze ( pyridin , 2,6-lutidin nebo kollidin ) oxiduje fosfit na fosfotriester, prekurzor přirozené fosfodiesterové internukleosidové vazby. Oxidaci lze také provést za bezvodých podmínek za použití terc-butylhydroperoxidu [59] nebo vhodnějšího činidla, ( lS )-(+)-(10-kafrsulfonyl)oxaziridinu [60] .

Pevné nosiče

Během syntézy na pevné fázi je oligonukleotid kovalentně navázán na nosič na pevné fázi prostřednictvím 3'-hydroxylové skupiny. Nosič je obvykle umístěn ve sloupcích, jejichž velikost závisí na rozsahu syntézy. V posledních 10 letech se rozšířily vysoce výkonné syntetizátory oligonukleotidů, u kterých je nosič umístěn v jamkách destičky (96 nebo 384 jamek na destičku) [61] . Po skončení syntézy se oligonukleotid odštěpí od nosiče a přejde do roztoku.

Mediální materiál
Velikost pórů CPG, Å [62] Plnění,
umol/g		 Délka produktu,
základny
500 80-90 <50
1000 50-60 80
1500 35-45 100
2000 20-30 150
3000 200

Na rozdíl od syntézy na organické pevné fázi a syntézy peptidů probíhá syntéza oligonukleotidů lépe na nebobtnajících nebo slabě bobtnajících nosičích na pevné fázi. Nejčastěji používanými nosiči jsou sklo s kontrolovanými póry (CPG) a makroporézní polystyren (MPPS) [ 63] . 

  • Hlavní charakteristikou CPG je průměr pórů , který může být od 70 do 4000 Á , přičemž póry jsou velmi jednotné velikosti (odchylka je ±10 % pro 80 % pórů). Aby byl takový nosič vhodný pro syntézu, zpracuje se s (3-aminopropyl)triethoxysilanem (APTES) za vzniku aminopropyl CPG. Často se  také používá aminoalkyl CPG s dlouhým řetězcem , LCAA CPG [63] . Dvě klíčové charakteristiky syntézy závisí na velikosti pórů: měřítko, určené počtem aktivních funkčních skupin na hmotnostní jednotku nosiče, a maximální délka syntetizovaného oligonukleotidu. Údaje o nejběžnějších nosičích CPG jsou uvedeny v tabulce [62] .
  • Také při syntéze oligonukleotidů se používá makroporézní polystyren získaný kopolymerací styrenu a divinylbenzenu se zavedenou aminomethylovou modifikací. Tento polystyren umožňuje syntetizovat oligonukleotidy o délce menší než 40–50 bází. Pro malé syntézy lze použít polystyrenový nosič s náplní 10 až 45 µmol/g. Pro syntézy v měřítku 25–100 µmol se používá polystyren se zátěží 200 až 400 µmol/g. A konečně, polystyren je vhodnější než CPG pro syntézy ve velkém měřítku (větší než 100 µmol) [62] .
Chemie linkeru

Pro účely syntézy oligonukleotidů jsou nukleosidové sukcináty nebo nenukleosidové linkery kovalentně připojeny k aminoskupinám aminopropyl CPG, LCAA CPG nebo aminomethyl MPPS. Obvykle se používají tři různé typy médií.

  • Nukleosidové nosiče . V historicky prvním přístupu se syntéza oligonukleotidu provádí na nosiči, ke kterému je předem kovalentně připojen 3'-koncový startovací nukleosid prostřednictvím fragmentu kyseliny jantarové . V souladu s tím syntéza začíná přidáním amidofosfitu odpovídajícího nikoli prvnímu, ale druhému nukleotidu, počítáno od 3'-konce. Nevýhodou takového nosiče je, že před zahájením syntézy je nutné vybrat variantu nukleosidového nosiče odpovídající 3'-terminálnímu nukleosidu v syntetizovaném oligonukleotidu, což snižuje produktivitu syntetického procesu a zvyšuje pravděpodobnost lidské chyby. [64] . Pro rychlejší separaci produktu od nosiče byly také navrženy alternativní nosiče v pevné fázi s spacerem na bázi kyseliny diglykolové a šťavelové [63] .
  • Univerzální média . Při této metodě začíná syntéza univerzálním nosičem, ke kterému je připojen nenukleosidový linker [65] . Amidofosfit, odpovídající 3'-terminálnímu nukleosidu, je navázán na univerzální nosič podle standardních metod během prvního syntetického cyklu. Poté pokračuje sestavování požadované sekvence a poté je oligonukleotid odštěpen z povrchu nosiče. Výhodou tohoto přístupu je, že ve všech syntézách, bez ohledu na to, kterou sekvenci je třeba syntetizovat, lze použít jeden univerzální nosič [64] .
  • K připojení některé funkční nebo reportérové ​​skupiny na 3' pozici syntetických oligonukleotidů se používají speciální nosiče . Nosiče jsou komerčně dostupné pro zavedení aminoskupin [66] , merkaptoskupin [ 67] , zhášedel fluorescence [68] atd.

Thiofosfátové oligonukleotidy a jejich syntéza

Thiofosfátové oligonukleotidy jsou modifikované oligonukleotidy, ve kterých je jeden z atomů kyslíku ve fosfátovém zbytku nahrazen atomem síry . Široce se používají pouze ty thiofosfáty, ve kterých síra není spojnicí mezi nukleosidovým zbytkem a atomem fosforu. V tomto případě náhrada kyslíku sírou vede k vytvoření nového centra chirality na atomu P(V), proto v nejjednodušším případě dinukleotidu vznikají diastereomery SP- a RP- . V n - mer oligonukleotidu, ve kterém jsou všechny ( n - 1) internukleotidové vazby thiofosfátové, je počet diastereomerů 2 ( n - 1) . Jako nepřirozené analogy nukleových kyselin jsou oligonukleotidové thiofosfáty výrazně odolnější vůči hydrolýze nukleázami , což je třída enzymů , které štěpí nukleové kyseliny hydrolýzou PO-vazby fosfodiesterového můstku. Tato vlastnost určuje použití thiofosfátů jako antisense oligonukleotidů v aplikacích in vivo a in vitro , kde je nevyhnutelná expozice nukleázám. Podobně, aby se zvýšila stabilita malých interferujících RNA , alespoň jedna thiofosfátová vazba je často zavedena do 3' polohy sense a antisense řetězců. V opticky čistých oligonukleotidových thiofosfátech jsou diastereomery, ve kterých mají všechna fosforová centra konfiguraci SP , odolnější vůči enzymatické hydrolýze než jejich protějšky RP . Syntéza opticky čistých thiofosfátů je však obtížná [69] [70] .

Syntéza oligonukleotidthiofosfátů je podobná syntéze přirozených oligonukleotidů. Rozdíl je v tom, že oxidační krok je nahrazen sulfurizační reakcí. Pro zavedení síry se používají následující komerčně dostupná činidla:

  • 3-(Dimethylaminomethylidenamino)-3H-1,2,4-dithiazol-3-thion ( DDTT ) poskytuje vysokou rychlost sulfurizace a je stabilní v roztoku [71] .
  • Beaucageovo  činidlo má vyšší rozpustnost v acetonitrilu a umožňuje průběh reakce v kratším čase . Má však omezenou stabilitu v roztoku a je méně účinný při sulfurizaci vazeb RNA [72] .
  • N,N,N',N'-Tetraethylthiuramdisulfid ( TETD ) je rozpustný v acetonitrilu, avšak reakce sulfurizace internukleosidové vazby DNA trvá 15 minut, což je 10x pomaleji než v případě dvou předchozích sloučenin [ 73] .

Byla vyvinuta i jiná sířující činidla [74] .

Při syntéze thiofosfátových oligonukleotidů se krok uzavření provádí po síření. Pokud se zavíčkování provádí před sířením, potom po uzavření může pevný nosič obsahovat zbytková množství acetanhydridu a 1-methylimidazolu. Uzavírací směs brání reakci přenosu síry, což vede k tvorbě thiofosfátových oligonukleotidů se zvýšeným obsahem fosfátových jednotek. V tomto případě se doporučuje provést zavíčkování po sulfatační reakci [71] .

Automatizace

Dříve byla syntéza oligonukleotidů prováděna ručně v roztoku nebo na pevné fázi. Pro syntézu na pevné fázi byla přizpůsobena různá zařízení na bázi injekčních stříkaček s porézními membránami nebo miniaturních skleněných filtrů, které umožňují promýt nosič pevné fáze roztoky činidel a odstranit je pomocí vakua [76] .

V současnosti se syntéza na pevné fázi provádí automaticky v počítačově řízených syntetizátorech oligonukleotidů. Tato zařízení se skládají z řady ventilů připojených k nádobám na činidla a také ze solenoidů , které otevírají nebo zavírají jeden nebo druhý ventil. Solenoidy jsou zase řízeny počítačem, na kterém běží program syntézy. Když je ventil otevřený, určité činidlo je čerpáno přes kolonu obsahující nosič pevné fáze po dobu stanovenou programem. Doba a sekvence dodávky činidla jsou konstantní pro každý běh syntézy; jedinou proměnnou je monomerní reaktant, který musí být v daném cyklu kondenzován. Jeho výběr také provádí program v souladu se zadanou oligonukleotidovou sekvencí [77] .

Syntéza může být realizována ve formátu kolony, desky nebo čipu. Metoda kolonové syntézy je vhodná pro výzkum, případně pro velkosériovou syntézu těchto polymerů, kde není vyžadována vysoká výkonnost jejich syntézy. Formát destičky je speciálně navržen pro vysoce výkonnou syntézu v malém měřítku, aby uspokojil rostoucí poptávku v průmyslu a vědě po syntetických oligonukleotidech. Komerčně dostupné jsou různé druhy syntezátorů [78] [79] [80] .

Postsyntetické zpracování

Pro získání cílového oligonukleotidu je nutné odstranit všechny ochranné skupiny oligonukleotidu:

  • 5' DMT skupina;
  • acylové ochranné skupiny na dusíkatých bázích;
  • 2-kyanoethylové skupiny chránící internukleosid fosfátové skupiny.

5'-DMT skupina se obvykle odstraňuje kyselým roztokem během automatické syntézy. Odštěpení oligonukleotidu od nosiče, deprotekce bází a kyanoethylových ochranných skupin obvykle probíhá současně za působení anorganických bází nebo aminů . Obvykle se pro tyto účely používá vodný amoniak , roztok methylaminu , jejich směsi [30] , plynný amoniak nebo methylamin [81] , méně často roztoky jiných primárních aminů a alkálií při pokojové nebo zvýšené teplotě. Toto zpracování odstraní všechny chránící skupiny z 2'-deoxyoligonukleotidů a zanechá roztok konečného produktu. V případě 2'- 0 -silyl-chráněných oligoribonukleotidů je přidán krok k odstranění silylových chránících skupin působením fluoridového iontu [82] .

Použití této metody je omezeno tím, že při tomto zpracování vzniká jako vedlejší produkt akrylonitril . Za podmínek deprotekce může akrylonitril alkylovat dusíkaté báze, zejména polohu N3 thyminu a uracilu , za vzniku 2-kyanoethylderivátů Michaelovou reakcí . Tvorbě těchto vedlejších produktů se lze vyhnout zpracováním oligonukleotidů navázaných na nosič v pevné fázi roztoky bází v organickém rozpouštědle, jako je 50% triethylamin v acetonitrilu [83] nebo 10% diethylamin v acetonitrilu [84] .

Nechráněný oligonukleotid může být použit bez další purifikace nebo dále purifikován jednou z následujících metod [85] .

  • Nejhrubší metodou čištění oligonukleotidu je odsolování, tj. oddělení nečistot s nízkou molekulovou hmotností vzniklých při odstraňování ochranných skupin ( benzamid , isobutyramid , octan amonný atd.). Pro velká množství oligonukleotidů se odsolování běžně provádí vysrážením v ethanolu : v tomto případě se produkt vysráží, zatímco nečistoty a v některých případech kratší oligonukleotidy zůstávají v roztoku. Pro malá množství se používá gelová filtrace [86] .
  • Purifikaci zkrácených oligonukleotidů lze efektivně provést pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu , která je založena na separaci oligonukleotidů podle velikosti v důsledku jejich různé pohyblivosti v gelu pod vlivem elektrického pole. Po ultrafialové absorpční elektroforéze se určí fragment gelu obsahující cílový oligonukleotid, tato část se vyřízne a vyčištěný oligonukleotid se izoluje máčením nebo elektroelucí [87] .
  • Nejúplnějšího čištění je dosaženo pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). V této metodě je separace založena na hydrofobní (HPLC s reverzní fází) nebo nábojové (iontoměničové HPLC) interakci oligonukleotidů se sorbentem. Síla této interakce ovlivňuje pořadí a čas eluce produktu z chromatografické kolony, což umožňuje efektivně separovat produkty různých délek. Často se používá alternativní přístup, ve kterém se 5'-DMT skupina oligonukleotidu před čištěním neodstraní. V tomto případě se v důsledku přítomnosti hydrofobní ochranné skupiny výrazně zvyšuje její hydrofobnost a síla interakce s hydrofobním sorbentem a klesá chromatografická mobilita, což zefektivňuje izolaci produktu. Skupina DMT se poté odstraní v kyselém prostředí a roztok se odpaří a odsolí [88] .

Charakterizace

Stejně jako u jiných organických látek je užitečné charakterizovat oligonukleotid poté, co byl připraven. Ve složitějších případech (výzkum nebo syntéza ve velkém měřítku) se to provádí dvakrát: po deprotekci a po čištění. Ačkoli nejsprávnějším přístupem k charakterizaci oligonukleotidu je sekvenování , relativně levný a rutinní postup, ekonomické úvahy brání jeho zavedení do produkce oligonukleotidů. V každodenní praxi stačí získat molekulovou hmotnost oligonukleotidu záznamem jeho hmotnostního spektra . Používají se dvě metody hmotnostní spektrometrie: elektrosprej a hmotnostní spektrometrie MALDI . Pro získání informativního spektra je důležité nahradit všechny kovové ionty, které mohou být ve vzorku přítomny, za amoniové nebo trialkylamoniové ionty.

  • Když je oligonukleotid ionizován elektrosprejem, produkuje sadu iontů, které odpovídají různým stupňům ionizace sloučeniny. Oligonukleotid s molekulovou hmotností M dává ionty o hmotnostech ( M  - n H) / n , kde M  je molekulová hmotnost oligonukleotidu v kyselé formě (všechny záporné náboje fosfodiesterových vazeb jsou kompenzovány přítomností protonů), n  je stupeň ionizace, H je atomová hmotnost atomu vodíku (1 Ano). Pro charakterizaci jsou nejužitečnější ionty s n od 2 do 5. Software dodávaný s moderními přístroji je schopen automaticky vyhledávat iontové píky patřící konkrétnímu oligonukleotidu a vypočítat jeho molekulovou hmotnost.
  • Pro získání podrobnějších informací o nečistotách v oligonukleotidu se používají analytické metody, které kombinují HPLC a hmotnostní spektrometrii [89] nebo kapilární elektroforézu a hmotnostní spektrometrii [90] .

Viz také

Poznámky

  1. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Reese CB Oligo- a polynukleotidy: 50 let chemické syntézy   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - Sv. 3 , ne. 21 . - S. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .
  2. ↑ Brown DM Stručná historie syntézy oligonukleotidů // Protokoly pro oligonukleotidy a analogy: Syntéza a vlastnosti. - Springer, 1993. - S. 1-17. — (Metody v molekulární biologii). - doi : 10.1385/0-89603-281-7:1 .
  3. ↑ Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Syntéza oligonukleotidů // Komplexní chemie přírodních produktů. - Elsevier, 1999. - S. 105-152.
  4. ↑ Michelson AM, Todd AR Nukleotidy část XXXII. Syntéza dithymidin dinukleotidu obsahujícího 3': 5'-internukleotidovou vazbu  (anglicky)  // J. Chem. soc. - 1955. - S. 2632-2638 . - doi : 10.1039/JR9550002632 .
  5. ↑ Hall RH, Todd A., Webb RF 644. Nukleotidy. Část XLI. Smíšené anhydridy jako meziprodukty při syntéze dinukleosidfosfátů  //  J. Chem. soc. - 1957. - S. 3291-3296 . - doi : 10.1039/JR9570003291 .
  6. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD Syntéza DNA přes deoxynukleosid H-fosfonátové meziprodukty   // Nucl . Acids Res. - 1986. - Sv. 14 , č. 13 . - S. 5399-5407 . doi : 10.1093 / nar/14.13.5399 . Archivováno z originálu 6. května 2022.
  7. ↑ Garegg PJ, Lindh I., Regberg T., Stawinski J., Strömberg R. Nukleosid H-fosfonáty. III. Chemická syntéza oligodeoxyribonukleotidů hydrogenfosfonátovým přístupem  (anglicky)  // Tetrahedron Lett. - 1986. - Sv. 27 , č. 34 . - str. 4051-4054 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)84908-4 .
  8. ↑ 1 2 Wada T., Sato Y., Honda F., Kawahara S., Sekine M. Chemická syntéza oligodeoxyribonukleotidů pomocí N-nechráněných H-fosfonátových monomerů a karboniových a fosfoniových kondenzačních činidel: O-selektivní fosfonylace a kondenzace J .Amer. Chem. soc. - 1997. - T. 119 , č. 52 . - S. 12710-12721 . - doi : 10.1021/JA9726015 .
  9. ↑ Agrawal S., Tang JY Efektivní syntéza oligoribonukleotidu a jeho fosforothioátového analogu pomocí H-fosfonátového přístupu // Tetrahedron Lett. - 1990. - T. 31 , č. 52 . - S. 7541-7544 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)97293-9 .
  10. ↑ Tram K., Wang X., Yan H. Snadná syntéza oligonukleotid-fosforoselenoátů // Org. Lett. - 2007. - T. 9 , č. 24 . - S. 5103-5106 . - doi : 10.1021/ol702305v .
  11. ↑ Froehler BC Deoxynukleosid H-fosfonátové diesterové meziprodukty při syntéze internukleotidových fosfátových analogů // Tetrahedron Lett. - 1986. - T. 27 , č. 46 . - S. 5575-5578 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)85269-7 .
  12. ↑ Froehler BC, Ng PG, Matteucci MD Fosforamidátové analogy DNA: syntéza a tepelná stabilita heteroduplexů // Nucl. Acids Res. - 1988. - T. 16 , č. 11 . - S. 4831-4839 . doi : 10.1093 / nar/16.11.4831 .
  13. ↑ Kung PP, Jones RA H-fosfonátová syntéza DNA bez ochrany amino // Tetrahedron Lett. - 1992. - T. 33 , č. 40 . - S. 5869-5872 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)61075-4 .
  14. ↑ Gilham PT, Khorana HG Studie o polynukleotidech. I. Nová a obecná metoda chemické syntézy C5″-C3″ internukleotidové vazby. Syntheses of Deoxyribo-dinucleotides  (anglicky)  // J. Am. Chem. soc. - 1958. - Sv. 80 , č. 23 . - S. 6212-6222 . - doi : 10.1021/ja01556a016 .
  15. ↑ Letsinger RL, Mahadevan V. Postupná syntéza oligodeoxyribonukleotidů na nerozpustném polymerním nosiči  //  J. Am. Chem. soc. - 1966. - Sv. 88 , č. 22 . - S. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.
  16. ↑ Letsinger RL, Ogilvie KK Nukleotidová chemie. XIII. Syntéza oligothymidylátů prostřednictvím fosfotriesterových meziproduktů  (anglicky)  // J. Am. Chem. soc. - 1969. - Sv. 91 , č. 12 . - S. 3350-3355 . - doi : 10.1021/ja01040a042 .
  17. ↑ Reese CB Chemická syntéza oligo- a polynukleotidů fosfotriesterovým přístupem   // Tetrahedron . - 1978. - Sv. 34 , č. 21 . - str. 3143-3179 . - doi : 10.1016/0040-4020(78)87013-6 .
  18. ↑ Efimov VA, Buryakova AA, Reverdatto SV, Chakhmakhcheva OG, Ovchinnikov Yu. A. Rychlá syntéza deoxyribooligonukleotidů s dlouhým řetězcem metodou N-methylimidazolid fosfotriester   // Nucl . Acids Res. - 1983. - Sv. 11 , č. 23 . - S. 8369-8387 . doi : 10.1093 / nar/11.23.8369 . Archivováno z originálu 6. května 2022.
  19. ↑ Efimov VA, Molchanova NS, Chakhmakhcheva OG Přístup k syntéze přirozených a modifikovaných oligonukleotidů fosfotriesterovou metodou s využitím O-nukleofilní intramolekulární katalýzy  //  Nukleosidy, nukleotidy a nukleové kyseliny. - 2007. - Sv. 26 , č. 8-9 . - S. 1087-1093 . - doi : 10.1080/15257770701516268 . — PMID 18058542 .
  20. ↑ Letsinger RL, Finnan JL, Heavner GA, Lunsford WB Nucleotide chemistry. XX. Postup fosfitové vazby pro generování internukleotidových vazeb  //  J. Am. Chem. soc. - 1975. - Sv. 97 , č. 11 . - str. 3278-3279 . - doi : 10.1021/ja00844a090 . — PMID 1133350 .
  21. ↑ Matteucci MD, Caruthers MH Syntéza deoxyoligonukleotidů na polymerním nosiči  //  J. Am. Chem. soc. - 1981. - Sv. 103 , č. 11 . - str. 3185-3191 . - doi : 10.1021/ja00401a041 .
  22. ↑ 1 2 3 Beaucage SL, Caruthers MH Deoxynukleosidové fosforamidity—Nová třída klíčových meziproduktů pro syntézu deoxypolynukleotidů  //  Tetrahedron Lett. - 1981. - Sv. 22 , č. 20 . - S. 1859-1862 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)90461-7 .
  23. ↑ McBride LJ, Caruthers MH Nukleotidová chemie. X. Výzkum několika deoxynukleosidových fosforamiditů užitečných pro syntézu deoxyoligonukleotidů // Tetrahedron Lett. - 1983. - T. 24 , č. 3 . - S. 245-248 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)81376-3 .
  24. ↑ Adams SP, Kavka KS, Wykes EJ, Holder SB, Galluppi GR Brzdná dialkylaminonukleosidová fosfitová činidla při syntéze dvou 51-merů DNA // J. Amer. Chem. soc. - 1983. - T. 105 , č. 3 . - S. 661-663 . - doi : 10.1021/ja00341a078 .
  25. ↑ 1 2 Sinha ND, Biernat J., McManus J., Köster H. Syntéza oligonukleotidů na polymerním nosiči XVIII1.2): použití β-kyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morfolinofosforamiditu deoxynukleosidů pro syntézu DNA fragmenty zjednodušující deprotekci a izolaci konečného produktu   // Nucl . Acids Res. - 1984. - Sv. 12 , č. 11 . - S. 4539-4557 . doi : 10.1093 / nar/12.11.4539 .
  26. ↑ 1 2 Beaucage SL, Iyer RP Pokroky v syntéze oligonukleotidů pomocí fosforamiditového přístupu   // Tetrahedron . - 1992. - Sv. 48 , č. 12 . - S. 2223-2311 . - doi : 10.1016/S0040-4020(01)88752-4 .
  27. ↑ Glen Research. Reagencie syntetizátoru DNA a RNA společnosti Biosystems  . Získáno 2. prosince 2012. Archivováno z originálu 16. ledna 2013.
  28. ↑ Gryaznov SM, Letsinger RL Syntéza oligonukleotidů prostřednictvím monomerů s nechráněnými bázemi  //  J. Am. Chem. soc. - 1991. - Sv. 113 , č. 15 . - S. 5876-5877 . doi : 10.1021 / ja00015a059 .
  29. ↑ Virta P. Syntéza oligonukleotidů citlivých na báze na pevné fázi   // ARKIVOC . - 2009. - S. 54-83 . - ISSN 1551-7012 . Archivováno z originálu 11. října 2015.
  30. ↑ 1 2 3 Reddy MP, Hanna NB, Farooqui F. Ultrarychlé štěpení a deprotekce oligonukleotidů Syntéza a použití derivátů  C Ac //  Nukleosidy a nukleotidy. - 1997. - Sv. 16 , č. 7-9 . - S. 1589-1598 . - doi : 10.1080/07328319708006236 .
  31. ↑ McMinn DL, Greenberg MM Syntéza oligonukleotidů obsahujících 3'-alkylaminy pomocí N-isobutyrylem chráněného deoxyadenosin fosforamiditu  //  Tetrahedron Lett. - 1997. - Sv. 38 , č. 18 . - str. 3123-3126 . - doi : 10.1016/S0040-4039(97)00568-6 .
  32. ↑ Schulhof JC, Molko D., Teoule R. Konečný krok deprotekce v syntéze oligonukleotidů je redukován na mírné a rychlé působení amoniakem pomocí labilních skupin chránících báze   // Nucl . Acids Res. - 1987. - Sv. 15 , č. 2 . - str. 397-416 . doi : 10.1093 / nar/15.2.397 . — PMID 3822812 . Archivováno z originálu 14. března 2022.
  33. ↑ Zhu Q., Delaney MO, Greenberg MM Pozorování a eliminace N-acetylace oligonukleotidů připravených pomocí rychle deprotekčních fosforamiditů a ultra mírné deprotekce   // Bioorg . Med. Chem. Lett. - 2001. - Sv. 11 , č. 9 . - S. 1105-1107 . - doi : 10.1016/S0960-894X(01)00161-5 . — PMID 11354354 .
  34. ↑ McBride LJ, Kierzek R., Beaucage SL, Caruthers MH Nukleotidová chemie. 16. Amidinové ochranné skupiny pro syntézu oligonukleotidů  (anglicky)  // J. Am. Chem. soc. - 1986. - Sv. 108 , č. 8 . - str. 2040-2048 . doi : 10.1021 / ja00268a052 .
  35. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. Fosforamiditová vazba na oligonukleotidy nesoucí nechráněné internukleosidové fosfátové skupiny  //  J. Org. Chem. - 2001. - Sv. 66 , č. 5 . - S. 1798-1804 . - doi : 10.1021/jo001591e . — PMID 11262130 .
  36. ↑ Ogilvie KK, Theriault N., Sadana KL Syntéza oligoribonukleotidů  //  J. Am. Chem. soc. - 1977. - Sv. 99 , č. 23 . - str. 7741-7743 . - doi : 10.1021/ja00465a073 .
  37. ↑ Usman N., Pon RT, Ogilvie KK Příprava ribonukleosid 3′-O-fosforamiditů a jejich aplikace na automatizovanou syntézu oligonukleotidů na pevné fázi  //  Tetrahedron Lett. - 1985. - Sv. 26 , č. 38 . - S. 4567-4570 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)98753-7 .
  38. ↑ Scaringe SA, Francklyn C., Usman N. Chemická syntéza biologicky aktivních oligoribonukleotidů pomocí β-kyanoethyl chráněných ribonukleosid fosforamiditů   // Nucl . Acids Res. - 1990. - Sv. 18 , č. 18 . - S. 5433-5441 . doi : 10.1093 / nar/18.18.5433 .
  39. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Wu X., Ackermann D., Honegger T. Rychlá a spolehlivá automatizovaná syntéza RNA a částečně 2′-O- chráněných prekurzorů („RNA v kleci“) na základě dvou nových, ortogonálních 2′- O-Protecting Groups, předběžná komunikace   // Helv . Chem. acta. - 1999. - Sv. 82 , č. 10 . - S. 1753-1761 . - doi : 10.1002/(SICI)1522-2675(19991006)82:10<1753::AID-HLCA1753>3.0.CO;2-Y .
  40. ↑ Pitsch S., Weiss PA, Jenny L., Stutz A., Wu X. Spolehlivá chemická syntéza oligoribonukleotidů (RNA) s 2′-O-[(triisopropylsilyl)oxy]methyl(2'-O-tom)-chráněna Phosphoramidites  (anglicky)  // Helv. Chem. acta. - 2001. - Sv. 84 , č. 12 . - str. 3773-3795 . - doi : 10.1002/1522-2675(20011219)84:12<3773::AID-HLCA3773>3.0.CO;2-E .
  41. ↑ Guzaev A., Salo H., Azhayev A., Lönnberg H. Nový přístup k chemické fosforylaci oligonukleotidů na 5′-konci   // Tetrahedron . - 1995. - Sv. 51 , č. 34 . - S. 9375-9384 . - doi : 10.1016/0040-4020(95)00544-I .
  42. ↑ Sinha ND, Cook RM Příprava a aplikace funkcionalizovaných syntetických oligonukleotidů: III. Použití H-fosfonátových derivátů chráněného aminohexanolu a merkaptopropanolu nebo -hexanolu  //  Nucl. Acids Res. - 1988. - Sv. 16 , č. 6 . - S. 2659-2670 . doi : 10.1093 / nar/16.6.2659 . Archivováno z originálu 6. května 2022.
  43. ↑ Ede NJ, Tregear GW, Haralambidis J. Rutinní příprava thiolových oligonukleotidů: Aplikace na syntézu oligonukleotid-peptidových hybridů  //  Bioconjugate Chem. - 1994. - Sv. 5 , č. 4 . - str. 373-378 . doi : 10.1021 / bc00028a016 . — PMID 7948105 .
  44. ↑ Podyminogin MA, Lukhtanov EA, Reed MW Připojení benzaldehydem modifikovaných oligodeoxynukleotidových sond na sklo potažené semikarbazidem   // Nucl . Acids Res. - 2001. - Sv. 29 , č. 24 . - S. 5090-5098 . doi : 10.1093 / nar/29.24.5090 .
  45. ↑ Lebedev AV, Combs D., Hogrefe RI Preactivated Carboxyl Linker for the Rapid Conjugation of Alkylamines to Oligonucleotides on Solid Support  //  Bioconjugate Chem. - 2007. - Sv. 18 , č. 5 . - S. 1530-1536 . doi : 10.1021 / bc0603891 . — PMID 17877414 .
  46. ↑ Alvira M., Eritja R. Syntéza oligonukleotidů nesoucích 5'-5' vazby pomocí mědí katalyzovaných cykloadičních reakcí   // Chem . biodiverzita. - 2007. - Sv. 4 , ne. 12 . - str. 2798-2809 . - doi : 10.1002/cbdv.200790229 . — PMID 18081090 .
  47. ↑ Kvach MV, Tsybulsky DA, Ustinov AV, Stepanova IA, Bondarev SL, Gontarev SV, Korshun VA, Shmanai VV 5(6 ) -Carboxyfluorescein Revisited: Nová ochranná skupina, Separace izomerů a jejich spektrální vlastnosti biokonjugátů   // Oligoconjugate . - 2007. - Sv. 18 , č. 5 . - S. 1691-1696 . - doi : 10.1021/bc7001874 . — PMID 17696491 .
  48. ↑ Jäschke A., Fürste JP, Nordhoff E., Hillenkamp F., Cech D., Erdmann VA Syntéza a vlastnosti oligodeoxyribonukleotid-polyethylenglykolových konjugátů   // Nucl . Acids Res. - 1994. - Sv. 22 , č. 22 . - S. 4810-4817 . doi : 10.1093 / nar/22.22.4810 . — PMID 7984434 .
  49. ↑ Musumeci D., Montesarchio D. Syntéza derivátu cholesteryl-HEG fosforamiditu a jeho aplikace na lipidové konjugáty Anti-HIV 5'TGGGAG3' Hotodovy sekvence   // Molekuly . - 2012. - Sv. 17 . - S. 12378-12392 . - doi : 10,3390/molekuly171012378 . — PMID 23090019 . Archivováno z originálu 2. listopadu 2015.
  50. ↑ Kayushin A., Demekhina A., Korosteleva M., Miroshnikov A., Azhayev A. Syntéza fosforamiditového linkeru obsahujícího biotin s polyetherovým spacerovým ramenem  //  Nukleosidy, nukleotidy a nukleové kyseliny. - 2011. - Sv. 30 , č. 7-8 . - S. 490-502 . doi : 10.1080 / 15257770.2011.587702 . — PMID 21888541 .
  51. ↑ Sproat B., Colonna F., Mullah B., Tsou D., Andrus A., Hampel A., Vinayak R. Efektivní metoda pro izolaci a purifikaci oligoribonukleotidů  //  Nukleosidy a nukleotidy. - 1995. - Sv. 14 , č. 1-2 . - str. 255-273 . - doi : 10.1080/15257779508014668 .
  52. ↑ Welz R., Müller S. 5-(Benzylmerkapto)-1H-tetrazol jako aktivátor pro 2'-O-TBDMS fosforamiditové stavební bloky v syntéze RNA  //  Tetrahedron Lett. - 2002. - Sv. 43 , č. 5 . - str. 795-797 . - doi : 10.1016/S0040-4039(01)02274-2 .
  53. ↑ Vargeese C., Carter J., Yegge J., Krivjansky S., Settle A., Kropp E., Peterson K., Pieken W. Efektivní aktivace nukleosidových fosforamiditů 4,5-dikyanimidazolem během syntézy oligonukleotidů   // Nucl. Acids Res. - 1998. - Sv. 26 , č. 4 . - S. 1046-1050 . - doi : 10.1093/nar/26.4.1046 . Archivováno z originálu 6. května 2022.
  54. ↑ Usman N., Ogilvie KK, Jiang MY, Cedergren RJ Automatizovaná chemická syntéza dlouhých oligoribunkleotidů pomocí 2'-O-silylovaných ribonukleosid 3'-O-fosforamiditů na skleněné podložce s kontrolovanými póry: syntéza 43-nukleotidové sekvence podobná na 3'-polovinu molekuly formylmethionin tRNA Escherichia coli // J. Amer. Chem. soc. - 1987. - T. 109 , č. 25 . - S. 7845-7854 . doi : 10.1021 / ja00259a037 .
  55. ↑ Ogilvie KK, Usman N., Nicoghosian K., Cedergren RJ Celková chemická syntéza 77-nukleotidové sekvence RNA s aktivitou akceptace methioninu  // Proc. Natl. Akad. sci. USA. - 1988. - T. 85 , č. 16 . - S. 5764-5768 . - doi : 10.1073/pnas.85.16.5764 . — PMID 3413059 .
  56. ↑ Wu T., Ogilvie KK, Perreault JP, Cedergren RJ Pohodlný postup pro přípravu specifických směsných polymerů DNA-RNA // J. Amer. Chem. soc. - 1989. - T. 111 , č. 22 . - S. 8531-8533 . - doi : 10.1021/ja00204a043 .
  57. ↑ Pon RT Zvýšená vazebná účinnost pomocí 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) a buď tetrazolu, 5-(o-nitrofenyl)tetrazolu nebo 5-(p-nitrofenyl)tetrazolu při syntéze oligoribonukleotidů na pevné fázi fosforamiditovým postupem // Tetrahedron Lett . - 1987. - T. 28 , č. 32 . - S. 3643-3646 . - doi : 10.1016/S0040-4039(00)96344-5 .
  58. ↑ Pon RT, Usman N., Damha MJ, Ogilvie KK Prevence modifikace guaninu a štěpení řetězce během syntézy oligonukleotidů na pevné fázi pomocí derivátů fosforamiditu   // Nucl . Acids Res. - 1986. - Sv. 14 , č. 16 . - S. 6453-6470 . doi : 10.1093 / nar/14.16.6453 . — PMID 3748816 . Archivováno z originálu 6. května 2022.
  59. ↑ Alul RH, Singman CN, Zhang G., Letsinger RL Oxalyl-CPG: labilní podpora pro syntézu citlivých oligonukleotidových derivátů  // Nucl. Acids Res. - 1991. - T. 19 , č. 7 . - S. 1527-1532 . - doi : 10.1093/nar/19.7.1527 . — PMID 2027761 . Archivováno z originálu 6. května 2022.
  60. ↑ Nový produkt : 0,5M CSO pro nevodnou oxidaci při syntéze DNA  . glenres.com. Datum přístupu: 28. ledna 2013. Archivováno z originálu 4. února 2013.
  61. ↑ Bioautomatizace. Syntetizátor oligonukleotidů DNA/RNA: MerMade 384 (nedostupný odkaz) . Získáno 3. prosince 2012. Archivováno z originálu dne 30. září 2011. 
  62. ↑ 1 2 3 Guzaev AP, Pon RT Připojení nukleosidů a dalších linkerů k nosičům na pevné fázi pro syntézu oligonukleotidů // Současné protokoly v chemii nukleových kyselin . Wiley, 2013.
  63. ↑ 1 2 3 Pon RT podpěry na pevné fázi pro syntézu oligonukleotidů // Současné protokoly v chemii nukleových kyselin. — Wiley, 2001.
  64. ↑ 1 2 Vaijayanthi B., Kumar P., Ghosh PK, Gupta KC Nedávné pokroky v syntéze oligonukleotidů a jejich aplikace  //  Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. - 2003. - Sv. 40 , č. 6 . - str. 377-391 . — PMID 22900365 . Archivováno z originálu 14. srpna 2017.
  65. ↑ Guzaev AP, Manoharan M. Konformačně předem organizovaný univerzální pevný nosič pro účinnou syntézu oligonukleotidů  //  J. Am. Chem. soc. - 2003. - Sv. 125 , č. 9 . - str. 2380-2381 . - doi : 10.1021/ja0284613 . — PMID 12603111 .
  66. ↑ Petrie ČR, Reed MW, Adams AD, Meyer Jr. RB Vylepšená CPG podpora pro syntézu oligonukleotidů zakončených 3'-aminem  //  Bioconjugate Chem. - 1992. - Sv. 3 , ne. 1 . - str. 85-87 . - doi : 10.1021/bc00013a014 . — PMID 1616954 .
  67. ↑ Link Technologies. 3'-Thiol Modifier C3 SS CPG (nedostupný odkaz) . Datum přístupu: 4. prosince 2012. Archivováno z originálu 29. června 2013. 
  68. ↑ Lumiprobe. Black Hole 1 (BHQ-1) zhášeč CPG (nedostupný odkaz) . Datum přístupu: 4. prosince 2012. Archivováno z originálu 23. listopadu 2010. 
  69. ↑ Wilk A., Grajkowski A., Phillips LR, Beaucage SL Deoxyribonukleosidové cyklické N-acylfosforamidity jako nová třída monomerů pro stereořízenou syntézu oligothymidylyl- a oligodeoxycytidylyl-fosforothioátů // J. Chem. soc. - 2000. - T. 122 , č. 10 . - S. 2149-2156 . doi : 10.1021 / ja991773u .
  70. ↑ Lebedev AV, Wickstrom E. Problém chirality v P-substituovaných oligonukleotidech  //  Perspectives in Drug Discovery and Design. - 1996. - Sv. 4 , ne. 1 . - str. 17-40 . - doi : 10.1007/BF02172106 .
  71. ↑ 1 2 Guzaev AP Reaktivita 3H-1,2,4-dithiazol-3-thionů a 3H-1,2-dithiol-3-thionů jako sulfurizačních činidel pro syntézu oligonukleotidů  (anglicky)  // Tetrahedron Lett. - 2011. - Sv. 52 , č. 3 . - str. 434-437 . - doi : 10.1016/j.tetlet.2010.11.086 .
  72. ↑ Iyer RP, Egan W., Regan JB, Beaucage SL 3H-1,2-Benzodithiole-3-on 1,1-dioxid jako zlepšené sulfurizační činidlo při syntéze oligodeoxyribonukleosid-fosforothioátů v pevné fázi  //  J .Am. Chem. soc. - 1990. - Sv. 112 , č. 3 . - S. 1253-1254 . - doi : 10.1021/ja00159a059 .
  73. ↑ Vu H., Hirschbein BL Suluritizace internukleotidů fosfitem tetraethylthiuramdisulfidem. Syntéza fosforothioátových oligonukleotidů pomocí fosforamiditové chemie  (anglicky)  // Tetrahedron Lett. - 1991. - Sv. 32 , č. 26 . - S. 3005-3008 . - doi : 10.1016/0040-4039(91)80672-S .
  74. ↑ Efimov VA, Kalinkina AL, Chakhmakhcheva OG, Hill TS, Jayaraman K. Nová účinná sulfurizační činidla pro přípravu oligodeoxyribonukleotidových fosforothioátových analogů (ut) // Nucl. Acids Res. - 1995. - T. 23 , č. 20 . - S. 4029-4033 . doi : 10.1093 / nar/23.20.4029 . — PMID 7479060 .
  75. ↑ Ito H., Ike Y., Ikuta S., Itakura K. Syntéza polynukleotidů na pevné fázi. VI. Další studie o polystyrenových kopolymerech pro pevný nosič   // Nucl . Acids Res. - 1982. - Sv. 10 , č. 5 . - S. 1755-1769 . doi : 10.1093 / nar/10.5.1755 .
  76. ↑ Tanaka T., Letsinger RL Injekční metoda pro postupnou chemickou syntézu oligonukleotidů   // Nucl . Acids Res. - 1982. - Sv. 10 , č. 10 . - str. 3249-3259 . doi : 10.1093 / nar/10.10.3249 . — PMID 7099961 . Archivováno z originálu 6. května 2022.
  77. ↑ Alvarado-Urbina G., Sathe GM, Liu WC, Gillen MF, Duck PD, Bender R., Ogilvie KK Automatizovaná syntéza genových fragmentů   // Věda . - 1981. - Sv. 214 , č.p. 4518 . - str. 270-274 . - doi : 10.1126/science.6169150 .
  78. ↑ Bioautomatizace. Syntetizátor oligonukleotidů DNA/RNA: MerMade . Datum přístupu: 11. prosince 2012. Archivováno z originálu 16. ledna 2013.
  79. ↑ BIOSSET (nepřístupný odkaz) . Získáno 11. prosince 2012. Archivováno z originálu dne 3. listopadu 2012. 
  80. ↑ Azco Biotech Inc. Azco DNA/RNA syntetizéry (nedostupný odkaz) . Získáno 11. prosince 2012. Archivováno z originálu 15. září 2011. 
  81. ↑ Boal JH, Wilk A., Harindranath N., Max EE, Kempe T., Beaucage SL Štěpení oligodeoxyribonukleotidů ze skleněných nosičů s řízenými póry a jejich rychlá deprotekce plynnými aminy   // Nucl . Acids Res. - 1996. - Sv. 24 , č. 15 . - str. 3115-3117 . doi : 10.1093 / nar/24.15.3115 . Archivováno z originálu 20. ledna 2016.
  82. ↑ Westman E., Strömberg R. Odstranění t-butyldimethylsilylové ochrany při syntéze RNA. Triethylamintrihydrofluorid (TEA, 3HF) je spolehlivější alternativou k tetrabutylamoniumfluoridu (TBAF  )  // Nucl. Acids Res. - 1994. - Sv. 22 , č. 12 . - str. 2430-2431 . - doi : 10.1093/nar/22.12.2430 . — PMID 7518583 .
  83. ↑ Capaldi DC, Gaus H., Krotz AH, Arnold J., Carty RL, Moore MN, Scozzari AN, Lowery K., Cole DL, Ravikumar VT Synthesis of High-Quality Antisense Drugs. Přidání akrylonitrilu k fosforothioátovým oligonukleotidům: Charakterizace aduktu a zamezení   // Org . Proč. Res. dev. - 2003. - Sv. 7 , č. 6 . - S. 832-838 . - doi : 10.1021/op020090n .
  84. ↑ Glen Research. Deprotekce - svazek 5 - Deprotekce oligonukleotidů v organických rozpouštědlech na koloně . Datum přístupu: 11. prosince 2012. Archivováno z originálu 16. ledna 2013.
  85. ↑ Applied Biosystems. Vyhodnocení a izolace syntetických oligonukleotidů. Kompletní průvodce (2002). Získáno 15. dubna 2013. Archivováno z originálu 19. dubna 2013.
  86. ↑ Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides, 2002 , pp. 2-5-2-6.
  87. ↑ Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides, 2002 , pp. 3-1-3-19.
  88. ↑ Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides, 2002 , pp. 4-1-4-15.
  89. ↑ Krotz AH, Gaus H., Hardee GE Tvorba oligonukleotidových aduktů ve farmaceutických formulacích // Farmaceutický vývoj a technologie. - 2005. - T. 10 , č. 2 . - S. 283-90 . - doi : 10.1081/PDT-54464 . — PMID 15926677 .
  90. ↑ Willems A., Deforce DL, Van Bocxlaer J. Analýza oligonukleotidů pomocí kapilární zónové elektroforézy a elektrosprejové hmotnostní spektrometrie // Methods in Molecular Biology. - Springer, 2008. - T. 384. Kapilární elektroforéza. - S. 401-414. — ISBN 978-1-59745-376-9 . - doi : 10.1007/978-1-59745-376-9_14 .

Literatura

Hlavní původní díla

  • Caruthers MH Chemická syntéza DNA a analogů DNA   // Acc . Chem. Res. - 1991. - Sv. 24 , č. 9 . - str. 278-284 . doi : 10.1021 / ar00009a005 .
  • Letsinger RL, Mahadevan V. Kroková syntéza oligodeoxyribonukleotidů na nerozpustném polymerním nosiči  //  J. Am. Chem. soc. - 1966. - Sv. 88 , č. 22 . - S. 5319-5324 . - doi : 10.1021/ja00974a053 . — PMID 10.1021/ja00974a053.

Recenze

  • Burtscher H., Berner S., Seibl R., Mühlegger K. Nucleic Acids // Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. - Wiley, 2000. - doi : 10.1002/14356007.a18_001 .
  • Iyer RP, Beaucage SL 7.05 Syntéza oligonukleotidů // Komplexní chemie přírodních produktů . - Elsevier, 1999. - S. 105-152.
  • Reese CB Oligo- a polynukleotidy: 50 let chemické syntézy   // Org . Biomol. Chem. - 2005. - Sv. 3 , ne. 21 . - S. 3851-3868 . doi : 10.1039 / b510458k . — PMID 16312051 .

Metody

Odkazy