Vektor (molekulární biologie)

Vektor ( v genetice a molekulární biologii ) je molekula nukleové kyseliny, nejčastěji DNA , používaná v genetickém inženýrství k přenosu genetického materiálu do buňky, včetně do buňky živého mnohobuněčného organismu in vivo [1] .

Stávající vektory:

Příklad klonování DNA

Jako příklad uveďme proces klonování části cizí DNA bakterií E. coli pomocí plazmidu pBR322 .

pBR322  je umělý plazmid, který vytvořili Francisco Bolivar a Raymond Rodriguez za účelem klonování genetického materiálu. Jde o cyklický fragment DNA o délce 4361 nukleotidových párů (obr. 1). Plazmid obsahuje gen tet rezistence na tetracyklin získaný z přirozeného plazmidu pSC 101; gen ampicilinové rezistence amp odebraný z Tn3 transpozonu ; a počátek replikace ori , vypůjčený z plazmidu pMB 1. Tetracyklin a ampicilin jsou silná antibiotika . Přítomnost genů rezistence (aktivních nebo blokovaných) v plazmidu hraje zásadní roli při izolaci bakterií s vloženou oblastí cizí DNA. Plazmid také obsahuje restrikční místa Pstl , BamHI a SalI , přičemž první je v genu amp a další dvě v genu tet. Tato důležitá okolnost pomáhá modifikovat plazmid.

Předpokládejme, že fragment, který byl předtím vyříznut z jiné DNA restrikčním enzymem BamHI (to znamená, že má nukleotidovou sekvenci charakteristickou pro restrikční místo BamHI ), je třeba vložit do plazmidu. K tomu se plazmidy zpracují s BamHI (který rozřízne kruhovou molekulu v restrikčním místě a vytvoří lineární oblast DNA) a přidají se oblasti cizí DNA. Protože na koncích všech fragmentů DNA jsou komplementární nukleotidové sekvence, začnou se „slepovat dohromady“ a jsou možné dvě možnosti slepení (obr. 2):

Protože cílem procesu jsou plazmidy s vloženým fragmentem, je nutné takové plazmidy izolovat a klonovat. Proces probíhá takto:

  1. Plazmidy jsou zavedeny do buněk E. coli . Za tímto účelem jsou buňky ošetřeny ionty Ca2 + , díky nimž jsou jejich membrány propustné pro DNA.
  2. Výsledné bakterie se vysévají na médium obsahující ampicilin. V tomto médiu kolonie bakterií obsahujících plazmidy rostou normálně, zbytek kolonií je inhibován. Na tomto základě lze rozlišit bakterie obsahující plazmidy;
  3. Kolonie obsahující plazmidy se přetisknou na médium obsahující tetracyklin. Protože cizí DNA vklíněná do genu tet , deaktivuje jej, jsou kolonie bakterií s modifikovanými plazmidy inhibovány tetracyklinem. Jsou tedy vizuálně odlišitelné od bakteriálních kolonií s rekonstituovanými plazmidy.
  4. V důsledku těchto akcí se izolují kolonie E. coli , do jejichž plazmidů je vložena část cizí DNA. Pro další klonování se naočkují do normálního média.

Klonovací postup lze také provést pomocí restriktáz Sal I a Pst I. V prvním případě bude postup podobný, v druhém případě budou bakterie s modifikovanými plazmidy naopak citlivé na ampicilin a necitlivé na tetracyklin.

Viz také

Poznámky

  1. ↑ Viz virové vektory .

Literatura

Odkazy

  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie
 Typy nukleových kyselin
Dusíkaté báze
Nukleosidy
Nukleotidy
RNA
DNA
Analogy
Vektorové typy