Epigenomika

Epigenomika je odvětví  molekulární biologie , které studuje souhrn epigenetických modifikací genetického materiálu buňky ( epigenom ) pomocí vysoce výkonných metod . Epigenomika je podobná genomice a proteomice , které studují genom a proteom buňky [1] .

Epigenetické modifikace jsou reverzibilní kovalentní chemické modifikace buněčné DNA a histonů , které ovlivňují genovou expresi beze změny nukleotidové sekvence DNA [2] . Mechanismy tvorby kovalentních modifikací DNA a histonů a jejich vliv na genovou expresi jsou předmětem studia epigenetiky a epigenomika studuje výsledek - epigenetické modifikace a jejich distribuci v celém genomu pomocí molekulárních metod jako je ChIP-seq , bisulfitové sekvenování , a další.

Nejvíce studovanými epigenetickými modifikacemi jsou metylace DNA a modifikace histonů. Studium epigenomu na globální úrovni se stalo možným teprve relativně nedávno díky vývoji vysoce výkonných metod pro studium genomu [3] [4] .

Epigenetické modifikace

Genomové modifikace, které mění genovou expresi , ale nejsou spojeny se změnou primární sekvence DNA ( nukleotidové sekvence) a jsou přenášeny během mitotického a meiotického buněčného dělení , se nazývají epigenetické modifikace. Nejvíce studovanými epigenetickými modifikacemi jsou metylace DNA a modifikace histonů [2] . Souhrn všech epigenetických modifikací DNA v buňce se nazývá epigen. Buňka si udržuje svůj epigenom po celý život, protože stabilita epigenomu přímo souvisí se stabilitou genomu, protože epigenom se účastní nejdůležitějších buněčných procesů, například opravy DNA [5] [6] . Změny v epigenomu buňky mohou vést k její přeměně na maligní [7] [4] [8] . Změny v epigenomu mohou být spojeny s rozvojem dalších lidských onemocnění, kromě různých typů rakoviny , jako je diabetes mellitus 2. typu , Alzheimerova choroba , Parkinsonova choroba , syndrom fragilního X a Prader-Williho syndrom [9] .

Methylace DNA

První známou epigenetickou modifikací byla metylace DNA. Methylace DNA je přidání methylové skupiny k nukleotidům v DNA. Enzymy , které katalyzují tuto reakci , jsou známé jako DNA methyltransferázy . Ačkoli je methylace DNA stabilní a dědičná modifikace, existují enzymy, které odstraňují methylové značky z DNA ( DNA demetylázy ). U eukaryot se methylová skupina nejčastěji váže na pátý atom uhlíku dusíkaté báze cytosinu v DNA za vzniku 5-methylcytosinu , neboli 5mC (zpravidla jako součást CpG ostrůvků , ve kterých cytosin zbytky sousedí s guaninovými zbytky ) [3] [10] .

Polohy nukleotidů podléhající methylaci se značně liší mezi druhy a dokonce i mezi buňkami stejného organismu. Zvířata používají methylaci DNA různými způsoby; Úroveň metylace DNA u obratlovců je tedy velmi vysoká, zatímco u bezobratlých má průměrné hodnoty. U některých organismů, jako je háďátko Caenorhabditis elegans , 5mC a DNA methyltransferázy zcela chybí. Pravděpodobně v těchto případech hrají roli metylace DNA jiné mechanismy [11] .

V rámci stejného organismu se může úroveň metylace DNA výrazně lišit v různých fázích vývoje a v závislosti na oblasti genomu. Například u myší zárodečné primordiální buňky procházejí demetylací v celém genomu, ale ve fázi implantace embrya se methylové značky vracejí do pozic, ve kterých byly přítomny v somatických buňkách [11] . Když methylace DNA ovlivní oblast promotoru , je potlačena transkripce odpovídajícího genu. Naproti tomu aktivně exprimované geny mívají nemethylované promotory [3] .

Mechanismus represe genové exprese prostřednictvím methylace DNA zahrnuje několik kroků. Různé proteiny vázající DNA interagují s methylovanými a nemethylovanými cytosinovými zbytky . Jejich prostřednictvím jsou histondeacetylázy přitahovány k místům 5mC , která spouští remodelaci chromatinu , v důsledku čehož se DNA stává nedostupnou pro interakci se složkami transkripčního aparátu, jako je RNA polymeráza , což vede k účinné represi genové exprese [12] .

Histonové modifikace

U eukaryot je genomová DNA spojena s proteiny za vzniku chromatinu . Nejpočetnějšími chromatinovými proteiny jsou histony, na kterých je navinutá dvoušroubovice DNA . Histony jsou obohaceny o kladně nabité aminokyseliny , což usnadňuje jejich vazbu na záporně nabitou cukr -fosfátovou kostru prostřednictvím elektrostatických interakcí. Hlavní opakující se strukturní jednotky chromatinu - nukleozomy  - jsou oktamer , včetně dvou molekul jádrových histonů H2A , H2B , H3 a H4 , na kterých je řetězec DNA dlouhý 146 párů bází . rána (p. asi.). Nukleozomy a kolem nich navinutá DNA tvoří chromatinovou fibrilu o průměru 10 nm , která může podléhat další kondenzaci [13] [14] .

Stupeň zhutnění chromatinu závisí na fázi buněčného cyklu a může být v různých částech genomu odlišný [15] . Stupeň kondenzace chromatinu souvisí s jeho transkripční aktivitou. Nekondenzovaný chromatin je transkripčně aktivnější než hustě zabalený chromatin, protože je lépe přístupný transkripčnímu aparátu. Proto může být genová exprese modulována remodelací chromatinu a regulací jeho hustoty sbalení [14] .

Remodelace chromatinu se provádí zavedením posttranslačních modifikací na N-terminální konce histonů jádra [16] . Sada histonových modifikací v dané buňce se nazývá histonový kód . Existuje mnoho typů modifikací histonů: acetylace , methylace, fosforylace , ubikvitinylace , SUMOylace , ADP-ribosylace , deaminace a izomerizace prolinu . Acetylace, methylace, fosforylace a ubikvitinylace jsou často spojeny s aktivací genové exprese, zatímco methylace, ubikvitinylace, SUMOylace, deaminace a izomerizace prolinu mohou vést ke genové represi. Je třeba poznamenat, že některé modifikace, jako je methylace, fosforylace a ubiquinitylace, mohou ovlivnit transkripční aktivitu genů v závislosti na specifických aminokyselinových zbytcích modifikovaných genomů. Navíc přispívá i modifikovatelná oblast genomu. Methylace lysinu 36 histonu H3 (H3K36me) v kódující oblasti genu tedy vede k jeho aktivaci, zatímco v promotoru naopak k inaktivaci [14] .

Histonové modifikace ovlivňují genovou expresi prostřednictvím dvou hlavních mechanismů: zničením kontaktů mezi nukleozomy a rekrutováním ATPáz , které remodelují chromatin. První mechanismus je realizován acetylací lysinových zbytků na histonových koncích, která je katalyzována histonacetyltransferázami . Histonové acetyltransferázy jsou součástí multiproteinových komplexů , které se rekrutují do chromatinu po navázání na DNA aktivátorových proteinů. Acetylace neutralizuje kladný náboj lysinového zbytku, který stabilizuje interakci nukleozomů s negativně nabitou páteří DNA. Acetylované lysinové zbytky v histonech podporují disociaci nukleozomů a dekompaktizaci chromatinu. V dekompaktovaném chromatinu je DNA lépe přístupná transkripčnímu aparátu, takže gen se stává aktivnějším. Deacetylázy mohou odstranit acetylové skupiny z histonových konců [14] [16] .

Druhý mechanismus zahrnuje nábor komplexů remodelujících chromatin prostřednictvím vazby aktivátorových proteinů na jejich příslušné enhancery . Chromatinové remodelační komplexy mění polohu nukleozomů několika způsoby, což může buď zvýšit nebo snížit dostupnost DNA pro transkripční aparát. Příkladem komplexu remodelace chromatinu je kvasinkový komplex SWI/SNF ; reguluje expresi několika genů přes chromatinové přestavby [14] [17] .

Metody

Cílem epigenomiky je hledat a popisovat epigenetické znaky na globální úrovni, stejně jako genomika studuje totalitu genetického materiálu buňky a proteomika studuje totalitu všech buněčných proteinů [1] . Stejně jako genomika a proteomika jsou nejdůležitější metodologickou součástí epigenomiky bioinformatické přístupy [18] .

Analýza modifikací histonů

Procesy transkripce, replikace a opravy DNA vyžadují interakci genomové DNA s jadernými proteiny. Je známo, že některé oblasti genomu jsou zvláště citlivé na působení DNázy I , která nespecificky štěpí DNA, která není chráněna proteiny. Taková hypersenzitivní místa byla považována za transkripčně aktivní oblasti genomu, což bylo potvrzeno jejich asociací s RNA polymerázou, stejně jako topoizomerázami I a II [19] . V hypersenzitivních místech je hustota balení DNA snížena. Nejčastěji hypersenzitivní místa odpovídají promotorům, ve kterých musí být DNA otevřená, aby se na ni mohly vázat složky transkripčního aparátu [20] .

Nejprve bylo provedeno celogenomové pátrání po epigenetických modifikacích pomocí metody Chromatin immunoprecipitation ( anglicky  Chromatin immunoprecipitation, ChIP ) spolu s DNA microarrays (tato technologie je známá jako ChIP-on-chip ) [13] . V případě ChIP-on-chip se chromatinovou imunoprecipitací izolují spíše modifikované histony než transkripční faktory a proteiny aktivátoru vázající DNA . Za prvé, histony jsou kovalentně spojeny s DNA in vivo ošetřením buněk formaldehydem . Dále jsou buňky podrobeny lýze , která umožňuje extrakci a fragmentaci chromatinu. Fragmentace chromatinu se provádí pomocí sonikace nebo restrikční endonukleázy . V průběhu tohoto ošetření jsou oblasti chromatinu, které nejsou spojeny s proteiny, zničeny, takže zůstanou pouze komplexy DNA-protein. Dále se pomocí protilátek specifických pro histony s určitými modifikacemi provádí imunoprecipitace komplexů DNA s takovými histony [14] . Po imunoprecipitaci se DNA a histony oddělí, DNA fragmenty se amplifikují polymerázovou řetězovou reakcí a označí fluorescenční značkou (např . Cy3 nebo Cy5). V konečné fázi se fluorescenčně značená DNA hybridizuje s fragmenty genomové DNA imobilizované na mikročipu DNA. Podle intenzity signálu odpovídajícímu každému fragmentu se usuzuje, který z nich interaguje s histony s epigenetickou značkou zájmu [21] [22] .

Pomocí ChIP-on-chip byl studován epigenom pekařských kvasnic , na základě čehož byly vyvozeny závěry o funkcích určitých modifikací histonů. Bylo ukázáno, které epigenetické znaky jsou spojeny s represí či aktivací transkripce a ve kterých částech genomu se vyskytují. Ačkoli ChIP-on-chip byl schopen studovat kvasinkové epigenomy s téměř úplným pokrytím, jeho aplikace na organismy s většími genomy, jako je člověk , je omezená [13] [14] .

Pro celogenomové studium epigenetických značek na velkých genomech se spolu s chromatinovou imunoprecipitací používají vysoce výkonné metody, jako je SAGE (z angl.  Serial Analysis of Gene Expression ), paired-end sekvenování (PET z tag Paired  -end ) a vysoce výkonné sekvenování (tato metoda je známá jako ChIP-seq ). ChIP-seq zahrnuje standardní protokol pro imunoprecipitaci chromatinu, ale místo amplifikace izolované DNA a její hybridizace na mikročipu je sekvenována pomocí vysoce výkonných metod. ChIP-seq se ukázal jako účinná metoda pro analýzu modifikací histonů na globální úrovni, identifikující vazebná místa pro proteiny interagující s DNA a s vyšším rozlišením než poskytují jiné metody [13] [21] .

Analýza metylace DNA

Metody pro stanovení nukleotidové sekvence DNA nejsou vhodné pro detekci methylovaných nukleotidů v DNA. Zejména během polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo klonování bakterií se při duplikaci DNA nezachovávají methylové značky a dochází ke ztrátě epigenetických informací. Vhodné nejsou ani metody hybridizace DNA, které využívají radioaktivní sondy ke stanovení sekvence studovaných fragmentů DNA a jejich polohy v genomu, protože nerozlišují mezi methylovanou a nemethylovanou DNA [23] [3] .

První vyvinutá metoda pro detekci metylovaných nukleotidů je založena na použití restrikčních endonukleáz (restrikčních enzymů). Při této metodě je genomová DNA ošetřena dvěma restrikčními enzymy, které rozpoznávají stejnou sekvenci, ale jeden z nich je citlivý na methylaci a druhý ne. Myšlenka metody spočívá v tom, že methylované místo může být rozpoznáno a štěpeno pouze restrikčním enzymem, který není citlivý na methylaci. Porovnáním fragmentů získaných zpracováním DNA restrikčním enzymem citlivým na methylaci a necitlivým k ní je možné identifikovat místa podléhající methylaci. Tento krok zahrnuje amplifikaci fragmentů získaných jako výsledek působení restrikčních enzymů pomocí PCR, jejich separaci gelovou elektroforézou a analýzu Southern blotem [23] [3] .

Výše popsaná metoda byla použita k analýze methylace DNA na lokusu lidského hemoglobinu . Různé geny tohoto lokusu (γ-, δ- a β-globiny) jsou exprimovány v různých fázích vývoje organismu [24] . Studie potvrdila, že ty geny, které nebyly exprimovány, byly obohaceny o 5mC [25] .

Metoda založená na použití restriktáz neumožňuje studovat metylaci na úrovni celého genomu, tedy methylomu. Ani v rámci lokusu nedává úplný obrázek o počtu a umístění methylových značek, protože informace o methylaci lze získat pouze z těch oblastí, které obsahují rozpoznávací místa pro použité restrikční enzymy. V tomto ohledu metoda poskytuje velké množství falešně negativních výsledků [3] .

Poprvé byla methylace v celém genomu studována pomocí metody známé jako Restriction Landmark Genomic Scanning (RLGS, doslova „skenování genomu pro restrikční místa“). Tato metoda využívá i enzymy, které štěpí DNA a jsou citlivé na její metylaci, nicméně k separaci fragmentů dochází při dvourozměrné gelové elektroforéze , což umožňuje podrobněji studovat umístění methylových značek [3] .

Bylo však možné získat úplné pochopení methylace genomové DNA ve vysokém rozlišení až s příchodem mikročipů DNA a metod sekvenování nové generace [26] . Stejně jako u RLGS nové přístupy zahrnují štěpení DNA endonukleázami. V případě diferenciální  methylační hybridizace (DMH ) je jeden vzorek genomové DNA zpracován restrikčními enzymy citlivými na metylaci a druhý enzymy necitlivými na metylaci. Dále jsou fragmenty obou vzorků amplifikovány a označeny různými fluorescenčními značkami , načež jsou fragmenty z obou vzorků aplikovány na jeden mikročip. Úroveň methylace DNA na daném lokusu je určena jako rozdíl mezi relativní intenzitou luminiscence dvou barviv. Použití vysoce výkonného sekvenování umožňuje dosáhnout vyššího rozlišení než použití DNA microarrays. Microarray pro tuto metodu musí být normalizován podle hustoty CpG ostrůvků, aby byly získány spolehlivé výsledky. Sekvenováním lze zejména odhalit alelově specifickou metylaci, navíc tento přístup umožňuje práci s většími genomy a nevyžaduje vytváření normalizovaných mikročipů [3] .

Bisulfitové sekvenování zahrnuje chemickou transformaci nemethylovaných cytosinových zbytků, takže je lze dále identifikovat pomocí konvenčního sekvenování. Při ošetření hydrogensiřičitanem sodným a alkálií se nemethylovaný cytosin přemění na uracil a methylovaný cytosin zůstane nedotčen. Další amplifikace a sekvenování DNA neošetřené bisulfitem sodným a upravené DNA umožňuje identifikaci methylačních míst. Stejně jako klasické metody založené na použití restriktáz citlivých na metylaci bylo bisulfitové sekvenování nejprve použito ke studiu metylace v rámci jednotlivých lokusů, ale nástup celogenomových sekvenačních metod umožnil jeho použití k analýze metylace na úrovni genomu. Na rozdíl od metod založených na použití restriktáz však bisulfitové sekvenování umožňuje identifikovat methylační místo s přesností jednoho nukleotidu. Mezi omezení bisulfitové metody patří neúplná konverze metylovaného cytosinu na uracil, což vede k falešně pozitivním výsledkům. Kromě toho může během bisulfitového sekvenování dojít k degradaci DNA a protokol metody zahrnuje krok odstranění hydrogensiřičitanu sodného [23] [3] .

Pro analýzu methylace v celém genomu spárovanou s bisulfitovým sekvenováním se používají technologie sekvenování nové generace. Kombinace těchto metod umožňuje identifikovat metylační místa s nejvyšší možnou metylací, ve fázi sestavování čtení do genomu však nastává řada obtíží kvůli snížené složitosti sekvence DNA ošetřené bisulfitem. Pro boj s tímto efektem můžete zvýšit délku čtení; Na tomto přístupu je založeno celogenomové sekvenování bisulfitového bisulfitu (WGBS ) .  Metoda WGBS využívající platformu Illumina Genome Analyzer již byla použita k analýze methylomu Arabidopsis thaliana [3] . Existují také omezené možnosti reprezentace pro bisulfitové sekvenování [27] [28] , které jsou zvláště důležité v případě organismů s velkými genomy [29] .

Analýza přístupnosti chromatinu

Dostupnost chromatinu je chápána jako míra rozsahu, v jakém je odpovídající oblast genomu otevřena pro interakci s transkripčními faktory a dalšími složkami transkripčního aparátu. Nepřístupné oblasti, hustě naplněné nukleozomy, neprocházejí aktivní transkripcí, na rozdíl od otevřených oblastí [30] . Změny v dostupnosti chromatinu jsou důležitým epigenetickým regulačním procesem, který dosahuje kontextově specifických nebo buněčně specifických úrovní exprese určitých genů [31] . Ke studiu dostupnosti chromatinu v buňce se používají různé metody, jako je MNase-seq , DNase-seq , ATAC-seq a FAIRE-seq . Klíčovým rysem těchto přístupů je jejich schopnost oddělit DNA vázanou na histon od volné DNA. Tyto sekvence jsou poté zarovnány s referenčním genomem , což umožňuje určit jejich umístění [32] .

MNase-seq a DNase-seq jsou založeny na stejném principu, totiž nukleázovém štěpení volné DNA nevázané na histony nebo jiné proteiny. Současně zůstávají fragmenty DNA, které interagují s proteiny, neporušené, takže je lze od proteinů oddělit a dále analyzovat. Protože tyto metody zahrnují destrukci aktivních oblastí genomu, jejich poloha může být stanovena pouze nepřímo sekvenováním přežívajících fragmentů DNA a jejich přiřazením k referenčnímu genomu. Metoda MNase-seq využívá mikrokokovou nukleázu , která zavádí jednovláknový zlom do vlákna komplementárního k cílové sekvenci [33] . Metoda DNase-seq využívá DNasu I, která nespecificky zavádí dvouvláknové zlomy do DNA [34] . DNase-seq se tak rozšířila, že místa bez nukleozomů byla označována jako DHS ( Nase  I hypersensitive sites ) [35] a konsorcium ENCODE zvolilo tuto metodu pro analýzu dostupnosti chromatinu v rámci celého genomu [36] . Hlavním problémem DNase-seq je to, že přestávky mohou být zavedeny nenáhodně, což snižuje kvalitu výsledků [37] .

Metoda  FAIRE-seq ( Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements ) začíná zesíťováním DNA s nukleozomy a následným štěpením DNA pomocí ultrazvuku. Volné a vázané fragmenty jsou izolovány standardní extrakcí fenol - chloroformem , zatímco proteinová frakce tvoří viskózní interfázi a volná DNA je ve vodné fázi, odkud ji lze odebrat pro další analýzu [38] . Sonikace zavádí náhodné zlomy, takže nenáhodný faktor je zde zcela vyloučen a fragmenty získané po sonikaci jsou delší než při enzymatickém ošetření (200–700 bp) [32] . Díky tomu lze FAIRE-seq použít k analýze velkých částí genomu, ale nedává rozlišení jednoho nukleozomu. Na rozdíl od metod využívajících nukleázy umožňuje FAIRE-seq přímo identifikovat aktivní oblasti genomu a zahrnuje jednodušší krok přípravy vzorku [39] .

Metoda ATAC-seq je založena na použití Tn5 transposázy . Transposáza vkládá adaptéry do genomu pro sekvenování a s větší frekvencí v těch oblastech genomu, které jsou bez proteinů. Adaptéry vložené transpozázou se dále používají při PCR a následném sekvenování [40] .

Přímá detekce epigenetických známek

Citlivost DNA polymerázy , používaná při sekvenování jedné molekuly v reálném čase , umožňuje přímo detekovat epigenetické značky, jako jsou methylové skupiny, jak se polymeráza pohybuje podél sekvenované molekuly DNA [41] . Několik projektů prokázalo použitelnost tohoto přístupu k získání celogenomové epigenetické informace u bakterií [42] [43] [44] [45] .

Sekvenování nanopórů je založeno na detekci změn síly elektrického proudu při setkání s modifikovanými nukleotidy (například metylovanými). DNA polymeráza zajišťuje vložení jednořetězcové DNA do póru miniaturní komůrky naplněné roztokem elektrolytu , ve kterém se vlivem přiloženého napětí generuje elektrický proud . Průchod určitých nukleotidů pórem snižuje jeho průřez dostupný pro ionty elektrolytu , což vede ke snížení intenzity proudu [46] . Zaznamenáním takových změn v síle proudu je možné identifikovat CpG ostrůvky v DNA procházející pórem. Sekvenování nanopórů může dokonce rozlišovat mezi hydroxymethylací a methylací. Sekvenátor MinION, vyvinutý společností Oxford Nanopore Technologies , umožňuje odlišit nemethylovaný cytosin od metylovaného bez předchozí chemické úpravy [47] . Technologie sekvenování Nanopore je také implementována v zařízeních Nanopolish a SignaAlign: první umožňuje odhadnout frekvenci metylace ve čteních a druhá její pravděpodobnost [48] .

Sekvenování jedné molekuly v reálném čase zahrnuje použití vlnovodu nulovým režimem . Na spodní část vlákna je připojena jediná molekula DNA polymerázy, jejíž templátem je také jediná molekula DNA. Každý ze čtyř nukleotidů DNA je označen jedním ze čtyř různých fluorescenčních barviv. Když DNA polymeráza přidá další nukleotid, odstraní se z ní fluorescenční značka a její světelný signál se zaznamená detektorem. Když DNA polymeráza narazí během sekvenování na modifikovaný nukleotid v templátu, změní se její kinetika : zrychlí nebo zpomalí způsobem jedinečným pro tuto modifikaci. Během sekvenování jsou fluorescenční záblesky hodnoceny nejen podle jejich emisních spekter , ale také podle doby trvání a intervalů mezi záblesky. Tyto parametry, známé jako šířka pulzu a interval mezi pulzy, umožňují vyhodnotit kinetiku DNA polymerázy v daném časovém okamžiku. Šířka pulzu je funkcí všech kinetických kroků od připojení nukleotidu po uvolnění fluoroforu a interval mezi pulzy je určen kinetikou vazby nukleotidů a translokací DNA polymerázy. V roce 2010 se ukázalo, že sekvenování jedné molekuly v reálném čase detekuje modifikované nukleotidy, jako je N6 - methyladenosin , 5-methylcytosin a 5-hydroxylcytosin. Tyto modifikace mění kinetiku DNA polymerázy různými způsoby, což umožňuje jejich vzájemné odlišení [49] .  

V roce 2017 byla navržena kombinovaná metoda zahrnující bisulfitovou konverzi nemethylovaných cytosinových zbytků a sekvenování jedné molekuly v reálném čase. Tento přístup je známý jako bisulfitové sekvenování v reálném čase s jednou molekulou (SMRT-BS ) a je metodou pro cílenou analýzu metylace CpG ostrovů [ 50] . 

Teoretické modely

První matematické modely pro různé stavy nukleozomů ovlivňující genovou expresi byly navrženy v 80. letech 20. století. Následně byly tyto myšlenky téměř úplně zapomenuty, dokud se neobjevila experimentální data o kovalentních modifikacích histonů a histonového kódu [51] . Následně vysokovýkonné metody ukázaly širokou distribuci epigenetických modifikací, což přispělo k vývoji nových teoretických modelů, které popisují vzhled, údržbu a změnu těchto značek [52] . Většina navrhovaných modelů popisuje epigenetické modifikace ve smyslu jednorozměrné mřížky [53] .

Editace epigenomu

Existuje mnoho výzkumných metod zaměřených na úpravu epigenomu. Změny v epigenomu se také vyskytují v klasických genetických experimentech, což vede k knockoutu nebo knockdownu cílového genu, deleci proteinových domén , výskytu bodových mutací , akvizičních mutací nebo ztrátě funkce. Epigenom je také ovlivněn zavedením umělých sekvencí s indukovatelnou expresí do genomu , stejně jako zavedením ektopicky exprimovaných vektorů do buňky . Epigenom může být modifikován biologicky aktivními malými molekulami , které inhibují enzymy, které jsou zodpovědné za začlenění nebo odstranění epigenetických značek. Příklady jsou azacitidin a decitabin , které nevratně inhibují DNA methyltransferázy 1 a 3, stejně jako romidepsin , který inhibuje histon deacetylázu. Cílená editace epigenomu zahrnuje aplikaci technik cílené editace genomu , které využívají nukleázy zinkových prstů , TALEN nukleázy a také systém CRISPR / Cas9 . Editační efekt je spojen s efektem na enzymy, které se přímo či nepřímo podílejí na odstraňování nebo zavádění epigenetických značek [9] .

Historie

Termín „epigenetika“ poprvé použil Conrad Hal Waddington v roce 1942 k označení molekulárních mechanismů, které určují fenotypovou expresi genu. Během následujících 50 let byly tyto mechanismy pečlivě studovány a byl prokázán jejich vliv na zajištění plasticity jednotlivých buněk i organismu jako celku [54] .

Termín epigenomika byl navržen v roce 1997 [55] , kdy vývoj vysoce výkonných metod umožnil studovat epigenetické modifikace na úrovni celého genomu. V roce 2000 začaly práce na mapování lidského epigenomu ( anglicky  Human Epigenome Project ) [56] . V roce 2003 byl zahájen projekt ENCODE , který se stal prvním mezinárodním projektem využívajícím epigenomická data k hledání regulačních prvků v lidském genomu. V roce 2010 bylo založeno International Human Epigenome Consortium (IHEC) s cílem získat  1000 referenčních epigenomů různých typů buněk [54] .

Poznámky

  1. ↑ 12 Russell , 2010 , str. 217, 230.
  2. ↑ 12 Russell , 2010 , str. 475.
  3. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Laird PW Principy a výzvy analýzy metylace genomové DNA.  (anglicky)  // Nature Reviews. genetika. - 2010. - březen ( roč. 11 , č. 3 ). - S. 191-203 . - doi : 10.1038/nrg2732 . — PMID 20125086 .
  4. ↑ 1 2 Zhu J. , Adli M. , Zou JY , Verstappen G. , Coyne M. , Zhang X. , Durham T. , Miri M. , Deshpande V. , De Jager PL , Bennett DA , Houmard JA , Muoio DM , Onder TT , Camahort R. , Cowan CA , Meissner A. , ​​Epstein CB , Shoresh N. , Bernstein BE Přechody chromatinového stavu v celém genomu spojené s vývojovými a environmentálními podněty.  (anglicky)  // Cell. - 2013. - 31. ledna ( roč. 152 , č. 3 ). - S. 642-654 . - doi : 10.1016/j.cell.2012.12.033 . — PMID 23333102 .
  5. ↑ Alabert C. , Groth A. Replikace chromatinu a údržba epigenomu.  (anglicky)  // Nature Reviews. Molekulární buněčná biologie. - 2012. - 23. února ( roč. 13 , č. 3 ). - S. 153-167 . - doi : 10.1038/nrm3288 . — PMID 22358331 .
  6. ↑ Ghosh S. , Sinha JK , Raghunath M. Epigenomická údržba prostřednictvím dietního zásahu může usnadnit proces opravy DNA a zpomalit postup předčasného stárnutí.  (anglicky)  // IUBMB Life. - 2016. - září ( roč. 68 , č. 9 ). - str. 717-721 . - doi : 10.1002/iub.1532 . — PMID 27364681 .
  7. ↑ Potenciální epigenetická a protirakovinná síla dietních flavonů (11. října 2016).
  8. ↑ Russell, 2010 , str. 597.
  9. ↑ 1 2 Holtzman L. , Gersbach CA Editace epigenomu: Přetvoření genomické krajiny.  (anglicky)  // Annual Review Of Genomics And Human Genetics. - 2018. - 31. srpna ( vol. 19 ). - str. 43-71 . - doi : 10.1146/annurev-genom-083117-021632 . — PMID 29852072 .
  10. ↑ Russell, 2010 , str. 531-532.
  11. ↑ 1 2 Pták A. Vzorce metylace DNA a epigenetická paměť.  (anglicky)  // Genes & Development. - 2002. - 1. ledna ( roč. 16 , č. 1 ). - str. 6-21 . - doi : 10.1101/gad.947102 . — PMID 11782440 .
  12. ↑ Russell, 2010 , str. 532-533.
  13. ↑ 1 2 3 4 Barski A. , Cuddapah S. , Cui K. , Roh TY , Schones DE , Wang Z. , Wei G. , Chepelev I. , Zhao K. Profilování histonových metylací s vysokým rozlišením v lidském genomu.  (anglicky)  // Cell. - 2007. - Sv. 129, č.p. 4 . - S. 823-837. - doi : 10.1016/j.cell.2007.05.009 . — PMID 17512414 .
  14. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Kouzarides T. Modifikace chromatinu a jejich funkce.  (anglicky)  // Cell. - 2007. - 23. února ( roč. 128 , č. 4 ). - S. 693-705 . - doi : 10.1016/j.cell.2007.02.005 . — PMID 17320507 .
  15. ↑ Russell, 2010 , str. 24-27.
  16. ↑ 12 Russell , 2010 , str. 529-530.
  17. ↑ Russell, 2010 , str. 530.
  18. ↑ Russell, 2010 , str. 218.
  19. ↑ Gross DS , Garrard WT nukleázová hypersenzitivní místa v chromatinu.  (anglicky)  // Annual Review Of Biochemistry. - 1988. - Sv. 57 . - S. 159-197 . - doi : 10.1146/annurev.bi.57.070188.001111 . — PMID 3052270 .
  20. ↑ Russell, 2010 , str. 529.
  21. ↑ 12 Gibson , Muse, 2009 , str. 229-232.
  22. ↑ Russell, 2010 , str. 532.
  23. ↑ 1 2 3 Eads CA , Danenberg KD , Kawakami K. , Saltz LB , Blake C. , Shibata D. , Danenberg PV , Laird PW MethyLight: vysoce výkonný test pro měření metylace DNA.  (anglicky)  // Výzkum nukleových kyselin. - 2000. - Sv. 28, č. 8 . - S. 32. - PMID 10734209 .
  24. ↑ Russell, 2010 , str. 552-553.
  25. ↑ van der Ploeg LH , Flavell RA DNA metylace v lidském gama delta beta-globinovém lokusu v erytroidních a neerytroidních tkáních. (anglicky)  // Cell. - 1980. - Duben ( roč. 19 , č. 4 ). - S. 947-958 . - doi : 10.1016/0092-8674(80)90086-0 . — PMID 6247075 .
  26. ↑ Johannes F. , Colot V. , Jansen RC Epigenome dynamics: a quantitative genetics perspective.  (anglicky)  // Nature Reviews. genetika. - 2008. - Listopad ( roč. 9 , č. 11 ). - S. 883-890 . doi : 10.1038 / nrg2467 . — PMID 18927581 .
  27. ↑ Trucchi E. , Mazzarella AB , Gilfillan GD , Lorenzo MT , Schönswetter P. , Paun O. BsRADseq: screening metylace DNA v přirozených populacích nemodelových druhů.  (anglicky)  // Molecular Ecology. - 2016. - Duben ( vol. 25 , č. 8 ). - S. 1697-1713 . - doi : 10.1111/mec.13550 . — PMID 26818626 .
  28. ↑ van Gurp TP , Wagemaker NC , Wouters B. , Vergeer P. , Ouborg JN , Verhoeven KJ epiGBS: bezreferenční redukovaná reprezentace bisulfitového sekvenování.  (anglicky)  // Nature Methods. - 2016. - Duben ( roč. 13 , č. 4 ). - str. 322-324 . - doi : 10.1038/nmeth.3763 ​​​​. — PMID 26855363 .
  29. ↑ Paun O. , Verhoeven KJF , Richards CL Příležitosti a omezení sníženého zastoupení bisulfitového sekvenování v rostlinné ekologické epigenomice.  (anglicky)  // The New Phytologist. - 2019. - Leden ( roč. 221 , č. 2 ). - str. 738-742 . - doi : 10.1111/nph.15388 . — PMID 30121954 .
  30. ↑ Kundaje A. , Meuleman W. , Ernst J. , Bilenky M. , Yen A. , Heravi-Moussavi A. , Kheradpour P. , Zhang Z. , Wang J. , Ziller MJ , Amin V. , Whitaker JW , Schultz MD , Ward LD , Sarkar A. , Quon G. , Sandstrom RS , Eaton ML , Wu YC , Pfenning AR , Wang X. , Claussnitzer M. , Liu Y. , Coarfa C. , Harris RA , Shoresh N. , Epstein CB , Gjoneska E. , Leung D. , Xie W. , Hawkins RD , Lister R. , Hong C. , Gascard P. , Mungall AJ , Moore R. , Chuah E. , Tam A. , Canfield TK , Hansen RS , Kaul R. , Sabo PJ , Bansal MS , Carles A. , Dixon JR , Farh KH , Feizi S. , Karlic R. , Kim AR , Kulkarni A. , Li D. , Lowdon R. , Elliott G. , Mercer TR , Neph SJ , Onuchic V. , Polak P. , Rajagopal N. , Ray P. , Sallari RC , Siebenthall KT , Sinnott-Armstrong NA , Stevens M. , Thurman RE , Wu J. , Zhang B. , Zhou X. , Beaudet AE . , Boyer LA , De Jager PL , Farnham PJ , Fisher SJ , Haussler D. , Jones SJ , Li W. , Marra MA , McManus MT , Sunyaev S. , Thomson JA , Tlsty TD , Tsai LH , Wang W. , Waterland . , Zhang MQ , Chadwick LH , Bernstein BE , Costello JF , Ecker JR , Hirst M. , Meissner A. , ​​Milosavljevic A. , Ren B. , Stamatoyannopoulos JA , Wang T. , Kellis M. Integrativní analýza 111 referenčních lidských epigenomů.  (anglicky)  // Nature. - 2015. - 19. února ( roč. 518 , č. 7539 ). - S. 317-330 . - doi : 10.1038/příroda14248 . — PMID 25693563 .
  31. ↑ Pennacchio L.A. , Bickmore W. , Dean A. , Nobrega M.A. , Bejerano G. Enhancers: pět zásadních otázek.  (anglicky)  // Nature Reviews. genetika. - 2013. - Duben ( roč. 14 , č. 4 ). - str. 288-295 . doi : 10.1038 / nrg3458 . — PMID 23503198 .
  32. ↑ 1 2 Zhang Z. , Pugh BF Mapování primární struktury chromatinu v celém genomu s vysokým rozlišením.  (anglicky)  // Cell. - 2011. - 21. ledna ( roč. 144 , č. 2 ). - S. 175-186 . - doi : 10.1016/j.cell.2011.01.003 . — PMID 21241889 .
  33. ↑ Axel R. Štěpení DNA v jádrech a chromatinu stafylokokovou nukleázou.  (anglicky)  // Biochemie. - 1975. - Červenec ( roč. 14 , č. 13 ). - S. 2921-2925 . - doi : 10.1021/bi00684a020 . — PMID 1148185 .
  34. ↑ Deoxyribonukleáza I (2013). Datum přístupu: 26. listopadu 2018.
  35. ↑ Zhou W. , Sherwood B. , Ji Z. , Xue Y. , Du F. , Bai J. , Ying M. , Ji H. Celogenomová predikce hypersenzitivity DNázy I pomocí genové exprese.  (anglicky)  // Nature Communications. - 2017. - 19. října ( roč. 8 , č. 1 ). - S. 1038-1038 . - doi : 10.1038/s41467-017-01188-x . — PMID 29051481 .
  36. ↑ Integrovaná encyklopedie prvků DNA v lidském genomu.  (anglicky)  // Nature. - 2012. - Sv. 489, č.p. 7414 . - S. 57-74. - doi : 10.1038/příroda11247 . — PMID 22955616 .
  37. ↑ He HH , Meyer CA , Hu SS , Chen MW , Zang C. , Liu Y. , Rao PK , Fei T. , Xu H. , Long H. , Liu XS , Brown M. Rafinovaný protokol DNase-seq a analýza dat odhaluje vnitřní zaujatost v identifikaci stopy transkripčního faktoru.  (anglicky)  // Nature Methods. - 2014. - Leden ( roč. 11 , č. 1 ). - str. 73-78 . - doi : 10.1038/nmeth.2762 . — PMID 24317252 .
  38. ↑ Tsompana M. , Buck MJ Přístupnost chromatinu: okno do genomu.  (anglicky)  // Epigenetics & Chromatin. - 2014. - Sv. 7 , č. 1 . — S. 33 . - doi : 10.1186/1756-8935-7-33 . — PMID 25473421 .
  39. ↑ Giresi PG , Kim J. , McDaniell RM , Iyer VR , Lieb JD FAIRE (formaldehydem asistovaná izolace regulačních prvků) izoluje aktivní regulační prvky z lidského chromatinu.  (anglicky)  // Genome research. - 2007. - Sv. 17, č. 6 . - S. 877-885. - doi : 10.1101/gr.5533506 . — PMID 17179217 .
  40. ↑ Buenrostro JD , Giresi PG , Zaba LC , Chang HY , Greenleaf WJ Transpozice nativního chromatinu pro rychlé a citlivé epigenomické profilování otevřeného chromatinu, DNA-vazebných proteinů a pozice nukleozomů.  (anglicky)  // Nature Methods. - 2013. - prosinec ( roč. 10 , č. 12 ). - S. 1213-1218 . - doi : 10.1038/nmeth.2688 . — PMID 24097267 .
  41. ↑ Schadt EE , Banerjee O. , Fang G. , Feng Z. , Wong WH , Zhang X. , Kislyuk A. , Clark TA , Luong K. , Keren-Paz A. , Chess A. , Kumar V. , Chen- Plotkin A. , Sondheimer N. , Korlach J. , Kasarskis A. Modelování změn kinetické rychlosti v datech sekvenování DNA třetí generace pro detekci domnělých modifikací bází DNA.  (anglicky)  // Genome Research. - 2013. - Leden ( roč. 23 , č. 1 ). - S. 129-141 . - doi : 10.1101/gr.136739.111 . — PMID 23093720 .
  42. ↑ Davis BM , Chao MC , Waldor MK Vstup do éry bakteriální epigenomiky se sekvenováním DNA v reálném čase s jednou molekulou.  (anglicky)  // Current Opinion In Microbiology. - 2013. - Duben ( roč. 16 , č. 2 ). - S. 192-198 . - doi : 10.1016/j.mib.2013.01.011 . — PMID 23434113 .
  43. ↑ Lluch-Senar M. , Luong K. , Lloréns-Rico V. , Delgado J. , Fang G. , Spittle K. , Clark TA , Schadt E. , Turner SW , Korlach J. , Serrano L. Komplexní methylomová charakterizace Mycoplasma genitalium a Mycoplasma pneumoniae v rozlišení jedné báze.  (anglicky)  // PLoS Genetics. - 2013. - Sv. 9 , č. 1 . - P. e1003191-1003191 . - doi : 10.1371/journal.pgen.1003191 . — PMID 23300489 .
  44. ↑ Murray IA , Clark TA , Morgan RD , Boitano M. , Anton BP , Luong K. , Fomenkov A. , Turner SW , Korlach J. , Roberts RJ Methylomy šesti bakterií.  (anglicky)  // Výzkum nukleových kyselin. - 2012. - Sv. 40, č. 22 . - S. 11450-11462. - doi : 10.1093/nar/gks891 . — PMID 23034806 .
  45. ↑ Fang G. , Munera D. , Friedman DI , Mandlik A. , Chao MC , Banerjee O. , Feng Z. , Losic B. , Mahajan MC , Jabado OJ , Deikus G. , Clark TA , Luong K. , Murray IA , Davis BM , Keren-Paz A. , Chess A. , Roberts RJ , Korlach J. , Turner SW , Kumar V. , Waldor MK , Schadt EE Celogenomové mapování methylovaných adeninových zbytků v patogenní Escherichia coli pomocí jedné molekuly real - časové posloupnosti.  (anglicky)  // Nature Biotechnology. - 2012. - prosinec ( roč. 30 , č. 12 ). - S. 1232-1239 . - doi : 10.1038/nbt.2432 . — PMID 23138224 .
  46. ↑ Simpson JT , Workman RE , Zuzarte PC , David M. , Dursi LJ , Timp W. Detekce methylace cytosinu DNA pomocí sekvenování nanoporů.  (anglicky)  // Nature Methods. - 2017. - Duben ( roč. 14 , č. 4 ). - str. 407-410 . - doi : 10.1038/nmeth.4184 . — PMID 28218898 .
  47. ↑ Laszlo AH , Derrington IM , Brinkerhoff H. , Langford KW , Nova IC , Samson JM , Bartlett JJ , Pavlenok M. , Gundlach JH Detekce a mapování 5-methylcytosinu a 5-hydroxymethylcytosinu s nanopóry MspA.  (anglicky)  // Proceedings Of The National Academy of Sciences Of The United States Of America. - 2013. - 19. listopadu ( roč. 110 , č. 47 ). - S. 18904-18909 . - doi : 10.1073/pnas.1310240110 . — PMID 24167255 .
  48. ↑ Jain M. , Koren S. , Miga KH , Quick J. , Rand AC , Sasani TA , Tyson JR , Beggs AD , Dilthey AT , Fiddes IT , Malla S. , Marriott H. , Nieto T. , O'Grady J , Olsen HE , Pedersen BS , Rhie A. , Richardson H. , Quinlan AR , Snutch TP , Tee L. , Paten B. , Phillippy AM , Simpson JT , Loman NJ , Loose M. Nanopore sekvenování a sestavení lidského genomu s ultra dlouhým čtením.  (anglicky)  // Nature Biotechnology. - 2018. - Duben ( vol. 36 , č. 4 ). - str. 338-345 . - doi : 10.1038/nbt.4060 . — PMID 29431738 .
  49. ↑ Flusberg BA , Webster DR , Lee JH , Travers KJ , Olivares EC , Clark TA , Korlach J. , Turner SW Přímá detekce metylace DNA během jedné molekuly, sekvenování v reálném čase.  (anglicky)  // Nature Methods. - 2010. - Červen ( vol. 7 , č. 6 ). - str. 461-465 . - doi : 10.1038/nmeth.1459 . — PMID 20453866 .
  50. ↑ Yang Y., Scott SA DNA methylation Profiling using Long-read Single Molecule Real-Time Bisulfite Sequencing (SMRT-BS  ) . - 2017. - Sv. 1654. - S. 125-134. — (Metody v molekulární biologii). - ISBN 978-1-4939-7230-2 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7231-9_8 .
  51. ↑ Strahl BD , Allis CD Jazyk kovalentních histonových modifikací.  (anglicky)  // Nature. - 2000. - 6. ledna ( roč. 403 , č. 6765 ). - str. 41-45 . - doi : 10.1038/47412 . — PMID 10638745 .
  52. ↑ Dodd IB , Micheelsen MA , Sneppen K. , Thon G. Teoretická analýza epigenetické buněčné paměti modifikací nukleozomů.  (anglicky)  // Cell. - 2007. - 18. května ( roč. 129 , č. 4 ). - S. 813-822 . - doi : 10.1016/j.cell.2007.02.053 . — PMID 17512413 .
  53. ↑ Teif VB , Rippe K. Statisticko-mechanické mřížkové modely pro vazbu protein-DNA v chromatinu.  (anglicky)  // Journal of Physics. Condensed Matter: An Institute Of Physics Journal. - 2010. - 20. října ( roč. 22 , č. 41 ). — S. 414105 . - doi : 10.1088/0953-8984/22/41/414105 . — PMID 21386588 .
  54. ↑ 1 2 Stricker Stefan H. , Köferle Anna , Beck Stephan. Od profilů k funkci v epigenomice  //  Nature Reviews Genetics. - 2016. - 21. listopadu ( roč. 18 , č. 1 ). - str. 51-66 . — ISSN 1471-0056 . - doi : 10.1038/nrg.2016.138 .
  55. ↑ Merriam Webster: Epigenomika .
  56. ↑ Callinan Pauline A. , Feinberg Andrew P. Vznikající věda o epigenomice  //  Molekulární genetika člověka. - 2006. - 15. dubna ( roč. 15 , č. suppl_1 ). - P.R95-R101 . — ISSN 1460-2083 . doi : 10.1093 / hmg/ddl095 .

Literatura

  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie