Kruhová RNA ( angl. Circular RNA, circRNA ) je druh molekul RNA , jejichž konce jsou vzájemně uzavřeny pomocí kovalentní vazby mezi koncovými nukleotidy . CircRNA mohou být vytvořeny z intronů nebo ze smyčky z různých oblastí zrajícího transkriptu . Ačkoli kruhové RNA jsou obvykle klasifikovány jako nekódující RNA , nyní se hromadí důkazy, že mohou kódovat peptidy [1] . Specifické funkce cirkulárních RNA nejsou plně pochopeny, ale pravděpodobně se podílejí na regulaci genové exprese . Cirkulární RNA jsou zvláště hojné v mozku a volně cirkulují v krevní plazmě . Možná se v budoucnu budou kruhové RNA používat jako biomarkery pro různé typy rakoviny .
Teoreticky lze cRNA získat třemi různými způsoby. Za prvé, během sestřihu jsou introny odstraněny ze zrajícího transkriptu nikoli jako lineární fragment, ale jako laso. Pokud tomuto lasu odříznete „ocásek“, získáte kruhovou RNA. Takové intronové kruhové molekuly se hromadí hlavně v jádře a jsou označovány jako ciRNA (z anglického circle intronic long non-coding RNAs ). Za druhé, v dozrávacím transkriptu mohou jednotlivé exony smyčkovat a takové smyčky mohou být vyříznuty spliceosomem a kovalentně uzavřeny do kruhu. Tak vznikají kruhové RNA, skládající se pouze z jednoho exonu. Kruhové RNA, které se skládají výhradně z exonů - jednoho nebo více, se sdružují do skupiny ecircRNA (z anglického exonic circRNAs ) a obvykle se nacházejí v cytoplazmě . Zatřetí, oblast obsahující několik intronů a exonů se může vysmykat. Když je taková smyčka vyříznuta a uzavřena spliceosomem, vytvoří se kruhové RNA obsahující exony i introny. Jsou lokalizovány hlavně v jádře a jsou označovány jako EIciRNA (z anglického exon-intron circRNAs ). Tyto molekuly mohou pokračovat ve spojování a po odstranění intronů budou produkovat kruhové RNA sestávající z několika exonů [2] .
Proces excize sestřihem smyčkových úseků přepisu se nazývá backsplicing . Introny obklopující jeden exon často obsahují vzájemně komplementární invertované repetice , které tvoří vodíkové vazby a tvoří „stopku“ smyčky. Smyčka může nastat za účasti speciálních proteinů : dva monomery takového proteinu se navážou na dva konce budoucí smyčky, dimerizují a spojí konce dohromady, takže je spliceosom může kovalentně zesíťovat. Dosud jsou známy tři proteiny, které regulují tvorbu určitých kruhových RNA: Quaking (QKI), Muscleblind (Mbl/MBNL1-3) a Fusedinsarcoma ( FUS ). Muscleblind tedy reguluje tvorbu circRNA vlastního genu vazbou na specifická místa v intronech nezralého transkriptu. Kromě toho je tvorba circRNA závislá na proteinech, které se vážou na nezralou mRNA v místech excize cRNA, což je činí nedostupnými pro spliceosom. Shrneme-li, můžeme říci, že biogeneze cRNA je komplexní proces regulovaný kombinací mnoha faktorů, včetně umístění invertovaných repetic a interakcí s proteiny, které zprostředkovávají smyčkování nebo naopak znemožňují backsplicing [2] .
Zajímavé je, že u některých archaea tvorba rRNA probíhá přes fázi kruhové prekurzorové molekuly, která je pak rozřezána na jednotlivé rRNA [3] .
Úroveň syntézy cRNA se liší v závislosti na typu buňky . V průměru jsou odpovídající kruhové RNA detekovány u 5–20 % aktivních genů a jednotlivá buňka současně obsahuje 5000–25 000 cirRNA. Tvoří však velmi malou část transkriptomu : až na vzácné výjimky tvoří circRNA 5–10 % množství lineárních messengerových RNA syntetizovaných ze stejného genu. Z jednoho genu se zpravidla transkribuje několik izoforem kruhové RNA a do circRNA je nejčastěji zahrnut druhý exon genu, zatímco první a poslední exon téměř nikdy nezůstávají v kruhové formě. Tvorba jedné nebo druhé izoformy může být regulována. Úroveň syntézy circRNA obecně se během diferenciace buněk velmi mění , ale obvykle trvá několik dní nebo dokonce týdnů, než se významně změní [2] .
Bez volných konců nemohou být cirkulární RNA degradovány exonukleázovými enzymy , které degradují mnoho transkriptů trvalým štěpením koncových nukleotidů. V tomto ohledu je průměrná kruhová RNA stabilnější než lineární mRNA: circRNA žije 19–24 hodin (někdy až 48 hodin), což je 2–5 (až 10)krát déle než životnost lineárních molekul. Existuje několik hypotéz o tom, jak jsou cirkulární RNA degradovány. Kruhové RNA mohou štěpit endonukleázy , které neničí nukleové kyseliny od konců, ale zavádějí zlomy do vnitřních částí molekuly. Pravděpodobně je v tomto případě za destrukci zodpovědný komplex obsahující miRNA , které „indukují“ endonukleázy skupiny Argonaute k cílovým molekulám. V circRNA, které mají být degradovány, mohou být některé adenosinové zbytky specificky methylovány . Takto metylované RNA jsou rozpoznávány speciálními proteiny, které je přenášejí do míst degradace ribonukleových kyselin – tzv. P-body . Na destrukci circRNA se mohou podílet speciální organely - autofagozomy , mimo jiné obsahující endonukleázy. Buňky mohou uvolňovat přebytečnou circRNA do krve jako součást extracelulárních vezikul . Pokud existují nějaká experimentální potvrzení pro první hypotetickou cestu pro destrukci cirkulárních RNA, pak zbývající modely stále čekají na své experimentální ověření [2] .
Jsou popsány biologické účinky jak samotných cirkulárních RNA, tak proces jejich vzniku. Kruhové RNA mohou navíc kódovat peptidy, které také vykonávají určité buněčné funkce. Přestože je zpětný sestřih vedoucí ke vzniku circRNA 100x vzácnější než běžný lineární sestřih, je pravděpodobné, že tyto dva procesy spolu soutěží a jsou vzájemně potlačeny. Je možné, že potlačení lineárního sestřihu během tvorby cirkulárních RNA je hlavní buněčnou funkcí těchto molekul. Smyčka z oblasti nezralého transkriptu v důsledku komplementární vazby invertovaných repetic v intronech může sama o sobě účinně potlačit lineární sestřih. Navíc jak zpětný sestřih, tak lineární sestřih vyžadují stejné oblasti transkriptu; obvykle jsou zapojeny do lineárního procesu, který ve většině případů potlačuje backsplicing. Skutečně se ukázalo, že cirkulární RNA a běžné lineární mRNA ze stejného genu nejsou syntetizovány současně. Experimentální důkazy však naznačují složitější vztah mezi lineárním a zpětným sestřihem než konvenční kompetitivní potlačení. Je možné, že důležitou roli může hrát rychlost transkripce , ve které bude RNA načtena z genu – mRNA nebo cirkulární. Alternativní sestřih tedy často vede k vytvoření lasa obsahujícího introny (tj. možné prekurzory cirkulární RNA), a k tomu často dochází, když je transkripce urychlena. Volba mezi zpětným sestřihem a lineárním sestřihem může být také založena na složitějších mechanismech. Předpokládá se například, že kruhová RNA, která se čte z genu mbl, přebírá celý proteinový produkt tohoto genu, Muscleblind. Je známo, že tento protein je nezbytný pro tvorbu lineárních mbl-mRNA, proto cirkulární mbl-RNA (circMbl) tím, že se na něj naváže a zabrání jeho fungování, inhibují syntézu svých lineárních „bratrů“. Není vyloučena ani možnost komplementární vazby cirkulárních RNA na oblasti genů, které je daly vzniknout, tedy na DNA [2] .
Řada experimentů naznačuje, že EIciRNA (exon-intron) a ciRNA (intron) ovlivňují transkripci svých vlastních genů stimulací RNA polymerázy II . Vědcům se podařilo vysrážet komplex EIciRNA s RNA polymerázou II pomocí protilátek a ukázalo se, že ke stimulaci polymerázy je potřeba další složka – malá jaderná RNA U1 . Možná, že při interakci s EIciRNA je U1 umístěn takovým způsobem, že stimuluje polymerázu. Zároveň se zdá, že ciRNA se dokážou přímo vázat na chromatin v oblasti „rodičovských“ genů a zvyšují rychlost jejich transkripce. Podařilo se vysrážet např. ciRNA zvanou ci-ankrd52 v komplexu s aktivně pracující RNA polymerázou II (aktivní forma enzymu se vyznačuje speciální fosforylací C-terminální domény ). Vzhledem k tomu, že ciRNA se mohou také vázat na „cizí“ sekvence DNA, jejich role v kontrole genové exprese může být významná [2] .
U dvou ecircRNA (exonových, lokalizovaných v cytoplazmě) byla experimentálně prokázána schopnost ovlivňovat syntézu proteinů . circANRIL narušuje komplex proteinů, které zpracovávají rRNA, čímž snižuje počet funkčních ribozomů a výtěžek proteinů. circPABPN1 zároveň potlačuje práci proteinu HuR , který je nezbytný pro translaci řady mRNA [2] .
Kruhové RNA mohou sloužit jako strukturní základ pro sestavování proteinových komplexů a tak poskytovat interakce protein- protein . Například prostřednictvím circ-Foxo3 interaguje cyklin-dependentní kináza 2 (Cdk2) se svým inhibitorem p21 , což vede k zástavě buněčného cyklu . Kromě toho mohou kruhové RNA sekvestrovat proteiny, což omezuje jejich pohyb na pracovní místa. Výše zmíněný circ-Foxo3 tedy dokáže „uzamknout“ transkripční faktor E2F1 a některé další proteiny v cytoplazmě [3] .
Některé exonové kruhové RNA obsahují vazebná místa pro negativní regulátory genové exprese, mikroRNA. V anglické literatuře jsou takové circRNA často označovány jako mikroRNA houby nebo houby, které absorbují mikroRNA. Vazbou na ně mikroRNA již nemohou interagovat s komplementárními cílovými mRNA a interferovat s jejich translací. Například CDR1as cRNA obsahuje 74 miR-7 vazebných míst pro mikroRNA a myší cRNA čtená z genu Sry (důležité pro určení pohlaví ) obsahuje 16 vazebných míst miR-138. Je však třeba poznamenat, že bylo prokázáno, že pouze několik kruhových RNA se váže na mikroRNA, tj. toto je spíše výjimka než pravidlo. Zajímavé je, že circRNA byly nalezeny v některých jednobuněčných eukaryotech , které mikroRNA vůbec nemají, konkrétně v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae a malarickém plasmodium Plasmodium falciparum . Vazba na mikroRNA tedy nemůže být hlavní funkcí cirkulárních RNA [2] .
V antivirové imunitě hraje důležitou roli řada cirkulárních RNA . Například kuřata , která jsou odolná vůči viru ptačí leukémie produkují 12 circRNA ve větším množství než normální kuřata. Mnoho z těchto molekul se váže na mikroRNA, které regulují expresi genů, které jsou spojeny s imunitními procesy, jako je aktivace B-lymfocytů a prezentace antigenu . Je zvláštní, že imunitní systém také ovlivňuje syntézu cirkulárních RNA. Například imunitní faktory NF90 a NF110 (sestřihové varianty genu ILF3 ) stimulují tvorbu circRNA ze zrajícího transkriptu v jádře. Za podmínek virové infekce jdou tyto proteiny do cytoplazmy, kde se vážou na virovou mRNA a inhibují životní cyklus viru ; množství jaderné circRNA klesá, což může modulovat genovou expresi. CircRNA se také mohou podílet na potlačení infekce vazbou na virové nebo buněčné miRNA, které interferují s imunitní odpovědí [3] .
Je známo, že většina událostí zpětného sestřihu zahrnuje exony a vyskytuje se v RNA genů kódujících protein. Translace většiny mRNA začíná tím, že ribozom rozpozná modifikovaný nukleotid na 5' konci mRNA, tzv. cap . CircRNA nemají volný 5' konec, takže nemohou mít čepici. Některé buněčné a virové RNA však mohou být translatovány v nepřítomnosti čepičky za účasti speciální sekvence - IRES . Totéž by se mohlo stát s kruhovými RNA [2] [3] .
Umělé circRNA obsahující IRES a kódující nějaký peptid by skutečně mohly být translatovány. Ukázalo se však, že většina cirkulárních RNA v živých buňkách není spojena s ribozomy, takže jejich translace pravděpodobně nebude rozšířená. Dosud jsou známy dvě kruhové RNA, které pravděpodobně syntetizují proteiny in vivo , jsou to circMbl a circZNF609. Stojí za zmínku, že tyto molekuly jsou tvořeny poněkud nestandardně: v prvním případě zpětný sestřih ovlivňuje první exon, který, jak si pamatujeme, obvykle není součástí cirkulárních RNA, a ve druhém případě fragment 5' -netranslatovaná oblast původního transkriptu vstupuje do circRNA, která má vlastnosti IRES. Je možné, že syntéza proteinů pomocí circRNA je možná pouze za zvláštních podmínek, například při stresu — tepelném šoku nebo hladovění [2] .
Pokud předpokládáme, že nějaká kruhová RNA obsahuje otevřený čtecí rámec s počtem nukleotidů, který je násobkem tří, pak teoreticky může translace takové RNA probíhat podle mechanismu rotujícího kruhu . Výsledkem takové translace by teoreticky byl nekonečný řetězec opakujících se bloků aminokyselin a jeho růst by byl omezen procesivitou ribozomů. Podobné případy u buněčných cRNA zatím nejsou známy, ale k něčemu podobnému dochází u viroidní cRNA spojené s virem rýžové žluté skvrny [2] .
Nedávné pokroky v detekci cRNA jsou způsobeny zlepšením technologie sekvenování RNA , jako je zvýšení délky jednotlivých čtení zdokonalení algoritmů pro porovnávání RNA se známými geny a rozšiřování knihoven RNA Cirkulární RNA lze odlišit od lineárních RNA pomocí bioinformatického přístupu (na základě výsledků sekvenování) nebo „mokrou“ metodou využívající exonukleázy. Jak bylo uvedeno výše, tyto enzymy rychle štěpí lineární RNA, ale ponechávají cirkulární RNA nedotčené. Pomocí exonukleáz byly identifikovány tisíce cirkulárních RNA, ale většina circRNA byla popsána díky vysoce výkonnému sekvenování pomocí speciálních algoritmů [4] .
V současné době existuje několik databází věnovaných cirkulárním RNA a online nástrojům pro práci s nimi. Mezi nimi [5] :
Cirkulární RNA se nacházejí v různém množství v krevní plazmě a v periferní krvi jsou ještě četnější než v orgánových buňkách . Důvody pro to nejsou jasné, zvláště vezmeme-li v úvahu skutečnost, že ve 25% séru jsou circRNA degradovány již po 30 sekundách (průměrná kruhová RNA existuje v buňce 1-2 dny). Ať je to jakkoli, přítomnost a množství určitých kruhových RNA v krevní plazmě může sloužit jako důležitý ukazatel zdraví těla. Jinými slovy, cRNA mohou být použity jako biomarkery pro diagnostiku a staging patologií , jako je koronární srdeční onemocnění , různé typy rakoviny (včetně leukémie ), diabetes a roztroušená skleróza [2] .
Některé kruhové RNA jsou spojeny s buněčným stárnutím . CirPVT1 tedy působí jako inhibitor stárnutí proliferujících fibroblastů [4] . Řada cirkulárních RNA je spojena se změnami v těle souvisejícími s věkem: byly například identifikovány molekuly spojené se stárnutím svalů u opic [6] .
Dosud je známo 10 cirkulárních RNA, které se podílejí na rozvoji kardiovaskulárních a metabolických onemocnění (například diabetes mellitus). Již zmíněný circANRIL může chránit před aterosklerózou tím, že inhibuje zrání rRNA a tím inhibuje buněčné dělení , jehož nadměrná proliferace vede k tvorbě aterosklerotických plátů . Kruhová RNA zvaná MICRA může signalizovat dysfunkci levé komory v důsledku infarktu myokardu . Při hypertrofii srdce a srdečním selhání je pozorován pokles syntézy řady cirkulárních RNA [2] .
Bylo prokázáno, že některé buněčné RNA jsou spojeny s diabetes mellitus. Je známo, že nadprodukce mikroRNA miR-7 v β-buňkách pankreatu přispívá k rozvoji diabetu, zatímco nadprodukce ciRS-7, kruhové RNA, která váže miR-7, v těchto buňkách naopak zlepšuje sekreci inzulínu [ 4] .
V nervových tkáních různých organismů (od ovocných mušek po člověka) se nachází zejména mnoho kruhových RNA. Možná je to kvůli většímu rozšíření alternativního sestřihu v neuronech . Kruhové RNA v nich navíc mohou vykonávat speciální funkce související s vedením nervových vzruchů . Protein Qki , zapojený do tvorby circRNA, se podílí na vývoji oligodendrocytů a reguluje myelinizaci a také inhibuje tvorbu dendritů v centrálním nervovém systému . Mutace v genu pro tento protein jsou spojeny s ataxií a schizofrenií [2] . Existují také důkazy o spojení cirkulárních RNA s Alzheimerovou chorobou [4] [6] .
Více než 20 cRNA bylo spojeno s rozvojem různých druhů rakoviny, jako je kolorektální rakovina , rakovina vaječníků , močového měchýře , prsu , jater , žaludku , ledvin a prostaty . Onkologické procesy jsou často doprovázeny translokacemi , které vedou ke vzniku nádorově specifických druhů circRNA. Nejčastěji cRNA spojené s rakovinou fungují jako houby pro miRNA [2] .