piRNA ( piwi -interagující RNA, piRNA, piwiRNA , v některých zdrojích se vyskytuje jako piRNA [1] ) je největší třída malých nekódujících RNA exprimovaných v živočišných buňkách [2] ; nacházejí se v komplexech s proteiny z rodiny Piwi , pro kterou dostaly své jméno. piRNA jsou obvykle delší než miRNA a malé interferující RNA a mají délku 26–32 nukleotidů [3] , navíc na rozdíl od miRNA nejsou tak konzervativní [2] . Proteiny Piwi patří do velké skupiny proteinů Argonaute a jsou exprimovány téměř výhradně v zárodečných buňkách ; jsou vyžadovány pro udržování zárodečných kmenových buněk , spermatogenezi a represi transponovatelných prvků . Komplexy Piwi s piRNA se nejen podílejí na umlčování retrotranspozonů a dalších genetických prvků na posttranslační úrovni , ale mají také některé další převážně nepopsané účinky, například epigenetické [4] .
Zůstává nejasné, jak se piRNA tvoří, ale byly navrženy potenciální výzkumné metody pro tuto otázku a bylo zjištěno, že některé způsoby jejich tvorby se liší od způsobů miRNA a malých interferujících RNA. Současně jsou některé malé nekódující RNA jiné skupiny, rasiRNA , považovány za patřící k piRNA [3] [5] .
Počet detekovaných piRNA je asi 50 tisíc u savců a 13 tisíc u Drosophila melanogaster [ 6] , což je výrazně více než počet známých malých RNA jiných tříd. Vzhledem k tomu, že významná část piRNA, zejména u savců, není spojena s transponovatelnými prvky, lze předpokládat, že plní i další funkce, které dosud nebyly popsány [3] .
piRNA byly objeveny v roce 2006 [3] .
piRNA byly nalezeny jak u obratlovců , tak u bezobratlých , a přestože se vzorce biogeneze a typy interakce s cíli mohou mezi druhy lišit, existuje řada konzervovaných znaků společných všem piRNA. U piRNA nebyly nalezeny žádné výrazné motivy sekundární struktury [7] , jejich délka je 26–32 nt a v 80–90 % případů jak u obratlovců, tak u bezobratlých je první nukleotid na 5'-konci uridin (U). Nematoda Caenorhabditis elegans má fosfátovou skupinu na 5' konci a 2'-O- methylaci na 3' konci [8] . Tato modifikace byla také identifikována u Drosophila [9] , zebrafish [10] , myší [11] a potkanů [10] . Fosfátová skupina na 5' konci se také nachází v savčích piRNA [3] . Význam této modifikace nebyl dosud jednoznačně stanoven, ale předpokládá se, že zvyšuje stabilitu piRNA [3] [10] .
U myší rodina Piwi zahrnuje tři proteiny: Mili, Miwi a Miwi2 [3] ; u lidí HIWI (nebo PIWIL1), HILI (nebo PIWIL2), HIWI2 (nebo PIWIL4) a HIWI3 (nebo PIWIL3) [12] .
U savců přibližně 17 % genů piRNA odpovídá repetitivním sekvencím , včetně transponovatelných prvků. Je třeba poznamenat, že počet piRNA odpovídajících repeticím je menší než podíl repetic v genomu . U hlodavců jsou tedy tyto poměry 17 a ~42 %. Jiné piRNA jsou kódovány jedinečnými geny, přičemž geny kódující piRNA jsou umístěny ve shlucích po celém genomu. 90 % takových shluků se nachází v oblastech, které neobsahují anotované geny nebo repetice, ale někdy se mohou nacházet v intronech a exonech [3] . Zatímco u D. melanogaster a obratlovců se tedy tyto shluky nacházejí v oblastech, kde chybí geny kódující proteiny, u C. elegans se geny piRNA nacházejí mezi geny kódujícími proteiny [5] [8] [13] . Každý takový shluk může kódovat 10 až mnoho tisíc piRNA a jeho velikost se může lišit od 1 do 100 kilobází [14] . Někdy jsou shluky piRNA umístěny vedle sebe, ale kódovány různými řetězci; to může indikovat obousměrnou transkripci ze společného promotoru . Detekce a stručná anotace shluků piRNA v genomech se provádí pomocí bioinformatických metod , které jsou stále složitější [15] . Ačkoli je přítomnost shluků genů piRNA mezi druhy vysoce konzervovaná , totéž nelze říci o sekvencích těchto genů [16] . Například, ačkoli největší shluky piRNA hlodavců mají lidské ortology , podobnost sekvencí v tomto případě není pozorována [3] .
Dříve se věřilo, že u savců se piRNA a Piwi proteiny nacházejí pouze ve varlatech [3] . Nyní však bylo zjištěno, že specifický systém piRNA je také přítomen v oocytech savců [17] . Kromě toho se ukázalo, že další gen proteinu Piwi, PIWI-LIKE 3 (PIWIL3) , je exprimován v hovězích oocytech během meiózy . Navzdory tomu se zdá, že savčí piRNA fungují pouze u mužů [18] . U bezobratlých byly piRNA identifikovány v samčích i samičích zárodečných buňkách [10] .
Na buněčné úrovni byly piRNA nalezeny jak v jádře , tak v cytoplazmě , což naznačuje, že piRNA mohou fungovat v obou [5] , a tak mít více účinků [19] .
Úroveň exprese piRNA se mění během spermatogeneze. Začínají být detekovány v pachytenu ( profáze I meiotického dělení ) při dělení diploidních spermatocytů meiózou (i když tvorba piRNA začíná již v prepachytizovaných buňkách [20] ), při tvorbě haploidních spermatid však obsah piRNA v nich prudce klesá a ve zralých spermiích , soudě podle okolí, chybí [3] .
Mechanismy tvorby piRNA nejsou dosud plně objasněny, i když bylo navrženo několik možných mechanismů. V případech, kdy geny piRNA spadají do exonů, piRNA odpovídají pouze sense (sens-) řetězci mRNA , takže jsou tvořeny pouze jedním řetězcem DNA a pravděpodobně jsou deriváty dlouhých primárních prekurzorových transkriptů. Tento předpoklad je v souladu s údaji o přítomnosti EST specifických pro varlata a mRNA odpovídajících lokusům piRNA . Kromě toho nebyly v klastrech piRNA nalezeny žádné vyvinuté sekundární struktury charakteristické pro pri-miRNA. Proto se zpracování piRNA zdá být odlišné od zpracování mikroRNA a malých interferujících RNA. Absence dvouřetězcových prekurzorů, které jsou charakteristické zejména pro miRNA, je doložena přítomností pouze sense sekvencí v některých unikátních piRNA [3] .
U Drosophila a myší lze ve zpracování piRNA rozlišit dvě fáze: primární zpracování a cyklus „ping-pong“ (amplifikační smyčka) [20] .
Jak bylo uvedeno výše, piRNA se tvoří z dlouhých prekurzorových transkriptů. U Drosophila jsou primární transkripty zkráceny na malé RNA podobné piRNA. Faktory zapojené do tohoto procesu jsou stále špatně pochopeny, ale nedávné studie ukázaly, že je možné, že 5' konec takových RNA podobných piRNA je tvořen cuketovou endonukleázou . U myší je homologem cukety protein MitoPLD, který má také endonukleázové vlastnosti. Poté jsou RNA podobné piRNA navázány na proteiny Piwi, načež je jejich 3'-konec zkrácen dosud nepopsanou endonukleázou a RNA podobné piRNA získávají velikosti odpovídající primárním piRNA. Je možné, že proteinový komplex Hsp83/Shu hraje důležitou roli při nakládání piRNA na proteiny Piwi. Dále jsou piRNA 2'-O-methylovány komplexem HEN1/Pimet [20] .
PiRNA, která prošla primárním zpracováním, je ve stavu spojeném s proteiny Piwi. Takové primární piRNA jsou antisense piRNA, které jsou komplementární k transkriptům transponovatelných prvků. U Drosophila je rodina proteinů Piwi reprezentována třemi proteiny: Piwi, Lilek (Aub) a Ago3, ale pouze proteiny Piwi a Aub vážou primární piRNA. Komplexy Piwi s piRNA jsou přeneseny do jádra a neúčastní se „ping-pongového“ cyklu, který probíhá v cytoplazmě , ale účastní se jaderného umlčování. Aub-asociované piRNA vážou transkripty mobilních genetických elementů komplementárně. Aub, stejně jako ostatní proteiny skupiny Argonaute, je schopen štěpit fosfodiesterovou vazbu v cílové RNA umístěné naproti 10. a 11. nukleotidu vodící RNA (v tomto případě primární piRNA). V důsledku zlomu se vytvoří dva fragmenty transkriptu mobilního elementu, z nichž jeden je 5'-konec vzdálen 10 nukleotidů od 5'-konce primární piRNA. Tento fragment, sekundární piRNA, na rozdíl od primární piRNA, není komplementární k transkriptu mobilního elementu a je sense piRNA. Protože nejčastěji je prvním nukleotidem v primárních piRNA uridin, adeninový nukleotid je v sekundárních piRNA nejčastěji umístěn na 10. pozici od 5'-konce . Mechanismus zpracování 3'-konce sekundárních piRNA je stále nejasný. Sekundární piRNA se váže na protein Ago3 a je zaměřena na štěpení primárního transkriptu prekurzoru piRNA, ze kterého je vyříznuta antisense piRNA. Takové antisense piRNA mohou buď umlčet transponovatelné elementy, nebo řídit tvorbu nových sense piRNA. Cyklus ping-pongu tedy kombinuje zpracování piRNA a cytoplazmatické umlčování mobilních elementů na úrovni transkriptu. Umožňuje také posílit umlčování v důsledku tvorby nových antisense piRNA v reakci na zvýšenou expresi transponovatelných prvků [3] . U Drosophila může „ping-pongový“ cyklus zahrnovat nejen primární piRNA, ale také piRNA zděděné od matky. Cyklus ping-pongu Drosophila se nazývá heterotypický , protože zahrnuje 2 různé proteiny Piwi, Aub a Ago3 [20] .
U myší se primární piRNA vážou na proteiny Mili a Miwi, zatímco sekundární piRNA se vážou na protein Miwi2. PiRNA spojené s Miwi se účastní cytoplazmatického umlčování, ale jejich cíle jsou z velké části neznámé. Primární piRNA spojené s mili se účastní ping-pongového cyklu. Sekundární piRNA vzniklé v tomto cyklu se vážou na Miwi2 a komplex piRNA s Miwi2 je odeslán do jádra, kde se účastní jaderného umlčování. Cyklus myšího ping-pongu se nazývá homotypický , protože zahrnuje jeden protein Piwi, Mili. Proteinový komplex HSP90/FKBP6 hraje určitou roli při tvorbě sekundárních piRNA, které se vážou na Miwi2. 2'-O-methylaci sekundárních piRNA zajišťuje komplex HEN1/Pimet [20] .
U Drosophila, v somatických buňkách gonád (například ve folikulárních buňkách), jsou proteiny Piwi také exprimovány a váží se na primární piRNA, avšak proteiny Aub a Ago3 jsou zde exprimovány na nízké úrovni a nestačí nést ven z „ping-pongového“ cyklu [20] .
Zdá se, že podobný mechanismus represe mobilních prvků existuje u zebřiček [3] . Známky přítomnosti "ping-pongového" mechanismu byly nalezeny u nejprimitivnějších zvířat - houby a cnidarians , což naznačuje, že "ping-pongový" mechanismus se objevil v nejranějších větvích Metazoa a je konzervativním mechanismem represe. mobilních prvků [3] [21] .
Na biogenezi piRNA se podílejí i další proteiny, které nepatří do skupiny Piwi. Konkrétně se jedná o některé proteiny patřící do nadrodiny Tudorovců (TDRD). Obsahují doménu Tudor , která zajišťuje vazbu proteinu TDRD na jiný proteinový substrát díky přítomnosti symetrických nebo asymetrických dimethylargininových zbytků v substrátu. Piwi proteiny mají symetrické dimethylargininové zbytky blízko N-konce , takže proteiny TDRD se na ně mohou vázat a podílet se na umlčování RNA . Od roku 2011 bylo u Drosophila identifikováno 11 proteinů TDRD zapojených do biogeneze piRNA a 7 takových proteinů TDRD bylo identifikováno u myší [20] .
Bylo například zjištěno, že mouchy mutované v proteinu TDRD Tud jsou fenotypově konzistentní s mutanty v proteinu Aub. Protein Tud obsahuje 11 domén Tudor a je schopen se vázat na Aub i Ago3 prostřednictvím symetrických dimethylargininových zbytků, čímž slouží jako „platforma“ pro cyklus „ping-pong“. U mutantů Tud se proteiny Aub a Ago3 vážou na piRNA aktivněji než u much divokého typu , což způsobilo odchylky od normálního fenotypu [20] .
Je také známo několik proteinů, které se účastní biogeneze piRNA a nesouvisejí s proteiny Piwi ani TDRD. U Drosophila byl tedy takový účinek prokázán u následujících proteinů: Vasa (Vas), Maelstrom (Mael), Armi, Zuc, Squash (Squ) a Shu, z nichž všechny, s výjimkou Squ, mají homology v myši. Většina těchto faktorů se podílí na mechanismu „ping-pongu“ [20] .
Bylo zjištěno, že C. elegans má piRNA, ale postrádá „ping-pongový“ mechanismus [22] . Nedávné studie biogeneze piRNA u C. elegans však částečně vrhly světlo na otázku, jak přesně obranný systém zprostředkovaný piRNA proti parazitickým mobilním elementům rozpoznává „vlastní“ a „cizí“, jako je imunitní systém [20] .
PiRNA C. elegans jsou dlouhé 21 nukleotidů a jsou kódovány dvěma shluky na chromozomu IV, které jsou umístěny odděleně od genů kódujících protein. Ve vzdálenosti ~42 nukleotidů před každým shlukem se nachází sekvence CTGTTTCA, zjevně nezbytná pro transkripci shluku RNA polymerázou II. Syntetizované piRNA se vážou na Piwi protein PRG-1. Výsledné piRNA komplexy s PRG-1 skenem na cizí transkripty a neúplná komplementarita (až 4 neshody) je dostatečná pro vazbu na transkript. a spouštějí tvorbu RNA-dependentních RNA polymeráz, které zajišťují tvorbu a amplifikaci specifických malých interferujících RNA (22G-RNA). Ten se váže na protein WAGO, specifický protein C. elegans ze skupiny Argonaute . V cytoplazmě tyto komplexy zajišťují umlčení genu na úrovni mRNA, ničí cizí transkripty, zatímco v jádře blokují transponovatelné elementy na úrovni transkripce [20] .
Rozpoznávání „vlastních“ a „cizí“ a ochrana vlastních přepisů před zničením se zjevně provádí na několika úrovních:
Pro schopnost umlčet mobilní elementy a chránit před nimi genom byly piRNA nazývány „strážci genomu“ [20] . Zdá se, že u savců je aktivita piRNA pro umlčování transpozonu zvláště důležitá během vývoje embrya , navíc je jak u lidí, tak C. elegans nezbytná pro spermatogenezi [23] [24] . Mutace narušující piRNA-zprostředkovaný umlčovací systém transponovatelných prvků u myších samců snižují plodnost nebo dokonce vedou k sterilitě [3] [25] . Je také možné, že některá onemocnění lidského reprodukčního systému, jako je azoospermie, jsou způsobena defekty v systému piRNA [20] .
Bylo zaznamenáno určité působení piRNA na některé methyltransferázy , které provádějí metylaci nezbytnou pro rozpoznání a umlčení transposonů, ale tento vztah je stále špatně pochopen [23] .
piRNA mohou být přenášeny z matky a epigenetické účinky takové mateřské dědičnosti byly prokázány u Drosophila [13] . Aktivita specifických piRNA v epigenetických procesech také vyžaduje interakci piRNA s proteiny Piwi, HP1a a dalšími faktory [6] . Je možné, že piRNA se účastní epigenetické regulace karcinogeneze [20] .
U plže Aplysia ( mořský zajíc ) bylo prokázáno, že piRNA obsažené v neuronech CNS potlačují expresi genu CREB2 , paměťového represoru , tím, že indukují metylaci DNA v jeho oblasti a tím zajišťují fungování paměti. Kromě toho byly piRNA nedávno nalezeny v myších hipokampálních neuronech. Tyto piRNA se pravděpodobně podílejí na tvorbě dendritických trnů [20] .
Největších pokroků ve studiu piRNA bylo dosaženo použitím specifických sekvenačních technik , jako jsou Solexa a 454. Pomocí nich lze analyzovat heterogenní a komplexní populace RNA, jako jsou piRNA. Malá velikost těchto RNA vytváří určité obtíže při jejich umělé expresi a amplifikaci , nicméně k jejich překonání byly vyvinuty speciální techniky založené na polymerázové řetězové reakci [26] [27] .
| Typy RNA | |
|---|---|
| Biosyntéza bílkovin | |
| Zpracování RNA |
|
| Regulace genové exprese |
|
| cis-regulační prvky | |
| Parazitické prvky | |
| jiný |
|
| Typy nukleových kyselin | ||||
|---|---|---|---|---|
| Dusíkaté báze | ||||
| Nukleosidy | ||||
| Nukleotidy | ||||
| RNA | ||||
| DNA | ||||
| Analogy | ||||
| Vektorové typy |
| |||
| ||||