CRISPR

CRISPR (z anglického  clustered regular interspaced short palindromic repeats  - krátké palindromické repetice pravidelně uspořádané ve skupinách [1] ) jsou speciální lokusy bakterií a archeí [2] skládající se z přímo se opakujících sekvencí , které jsou odděleny jedinečnými sekvencemi ( spacery ). Spacery jsou vypůjčeny z cizích genetických prvků , se kterými se buňka setkává ( bakteriofágy , plazmidy ). RNA transkribovaná _z CRISPR lokusů spolu s asociovanými Cas proteiny poskytují adaptivní imunitu díky komplementární vazbě RNA na nukleové kyseliny cizích prvků a jejich následné destrukci proteiny Cas. K dnešnímu dni však existuje mnoho důkazů o zapojení CRISPR do procesů, které nesouvisejí s imunitou .

Použití metod CRISPR-Cas pro řízenou editaci genomu je slibným směrem v moderním genetickém inženýrství . Pro rok 2016 vědci široce využívají přístupy založené na systémech CRISPR-Cas; možná v budoucnu budou tyto přístupy využívány v medicíně pro léčbu dědičných onemocnění [3] .

CRISPR-Cas je také důležitý pro cílené podávání léků a jejich uvolňování pod vnějšími vlivy – k tomu se používají materiály, které obsahují úseky DNA [4] .

Historie studia

První lokus CRISPR byl objeven v bakterii Escherichia coli v roce 1987 skupinou japonských vědců vedených Yoshizumi Isino . Všimli si opakujících se prvků v genomu této bakterie, oddělených neopakujícími se sekvencemi ( spacery ) [5] ; jejich pozorování však vědci nepřikládali velký význam. Rozsáhlou studii CRISPR zahájil španělský badatel Francisco Mojica , který v roce 1993 objevil opakované sekvence oddělené mezerami v genomu archaea Haloferax mediterranei . Všiml si, že repetice v genomech této archaea a E. coli mají velmi podobnou strukturu, ale nemají nic společného v nukleotidových sekvencích . Podle Mojice musí repetice tak podobné strukturou, což jsou systematicky velmi vzdálené skupiny prokaryot , plnit nějakou velmi důležitou funkci. Zpočátku nazval novou třídu repetic „short regular spaced repeats, SRSRs “  , ale později na jeho návrh byl tento název změněn na „short palindromic repeats regular in groups“ ( anglicky clustered regular interspaced short palindromic repeats, CRISPR ) . . Mojica pokračoval v hledání CRISPR v genomech jiných mikrobů a do roku 2000 je našel ve 20 mikroorganismech, včetně morového bacilu Yersinia pestis a dalších patogenů [6] . V roce 2002 byly objeveny geny cas  — geny pro lokusy CRISPR, které kódují proteiny Cas [7] .  

Navzdory objevu systémů CRISPR-Cas v široké škále prokaryot bylo o funkcích CRISPR až do roku 2005 známo jen málo. V roce 2005 Mojica a kolegové publikovali [8] výsledky svých nových studií, ve kterých bylo zjištěno, že spacery odpovídají sekvencím z genomů bakteriofágů a také oblastem plazmidů. Zjistili také, že kmeny E. coli , jejichž lokusy CRISPR obsahují spacer odpovídající fágu P1 , jsou vůči tomuto fágu rezistentní a dospěli k závěru, že lokusy CRISPR jsou spojeny s adaptivní imunitou prokaryot. Ve stejném roce se objevily publikace [9] [10] dalších dvou výzkumných skupin, které došly ke stejnému závěru [6] .

V roce 2006 byla vyvinuta klasifikace známých CRISPR a navržen možný mechanismus adaptivní imunity na bázi CRISPR [11] . V roce 2007 výzkumná skupina vedená Philippem Horvathem konečně prokázala a experimentálně prokázala [6] účast CRISPR na zajištění práce adaptivní imunity specifické pro cílové sekvence; zároveň byla odhalena klíčová role Cas proteinů v tomto procesu [12] . Za tento úspěch mu byla v roce 2015 spolu s dalšími vědci, kteří významně přispěli ke studiu CRISPR ( Jennifer Doudna a Emmanuelle Charpentier ) udělena Massry Prize [13] .  V roce 2008 se ukázalo, že systém CRISPR vyžaduje ke svému fungování speciálně zpracovanou CRISPR RNA (crRNA) a byla prokázána i schopnost systému CRISPR provádět DNA interferenci . Interference, zacílení na RNA a zacílení proti specifickým sekvencím DNA jsou tři objevy v letech 2007-2008, které odstartovaly vývoj metod genetického inženýrství založených na CRISPR [14] .

Řada následných důležitých objevů týkajících se návrhu systémů CRISPR typu II (zejména potřeba proteinu Cas9 a další malé RNA, zvané tracrRNA, kromě crRNA), umožnila v roce 2012 experimentálně otestovat první uměle vyvinutý systém CRISPR typu II. Na začátku roku 2013 (asi dva týdny od sebe) několik skupin ukázalo, že umělé systémy CRISPR-Cas mohou fungovat nejen v bakteriálních a in vitro buňkách, ale také v eukaryotických buňkách [14] .

Následujících dva a půl roku došlo k rozvoji metod CRISPR a aplikaci této metody v různých skupinách organismů . V dubnu 2015 skupina vědců z Číny zveřejnila výsledky své studie, ve které byly pomocí CRISPR-Cas9 editovány genomy lidských embryí [15] . Přesnost editace v tomto experimentu však byla velmi nízká [15] a samotný experiment byl vědeckou komunitou vnímán nejednoznačně [16] . Začátkem roku 2016 vědci z USA oznámili, že se jim podařilo snížit počet chyb při provozu CRISPR-Cas9 téměř na nulu [17] . K dnešnímu dni je CRISPR považován za nejdůležitější technologickou inovaci v biologických vědách od vynálezu polymerázové řetězové reakce (PCR), objevené o tři desetiletí dříve [14] . Za zavedení technik úpravy genů pomocí CRISPR-Cas9 obdržely Jennifer Doudna a Emmanuelle Charpentier Nobelovu cenu za chemii za rok 2020 [18] .

V roce 2016 skupina vědců zjistila, že systémy CRISPR-Cas vznikly z transposonů , které ztratily svou pohyblivost a fixovaly se v genomu [19] [20] . Fylogenetická studie ukázala, že všechny endonukleázy Cas pocházejí z jednoho transpozonu všech transposonů nesoucích endonukleázu IscB [19] .

Obecné zásady

Systémy CRISPR-Cas se liší jak konstrukčně, tak funkčně. Všechny systémy CRISPR-Cas však mají řadu společných znaků [14] .

Lokusy CRISPR mohou plnit funkci imunity pouze v přítomnosti genů cas , které se obvykle nacházejí v těsné blízkosti CRISPR. Sada genů cas určuje typ systému CRISPR-Cas. Lokusy CRISPR jsou krátké (obvykle asi 30–40 nukleotidů dlouhé) přímé repetice, které jsou od sebe odděleny neopakujícími se spacery odvozenými z DNA těch cizích genetických elementů, se kterými se buňka nebo její prekurzory setkává. Délka distančních vložek je obvykle srovnatelná s délkou repetic. Před řadou repetic a spacerů je vedoucí sekvence obsahující zpravidla promotor , od kterého začíná jednosměrná transkripce repetic a spacerů CRISPR. Spacery jsou plně integrovány do buněčného genomu a během dělení jsou přenášeny na jeho potomky [14] . U bakterií je integrace nových spacerů do genomu kombinována se ztrátou nadbytečných a cizích genů; proto se bakteriím daří vyhýbat se výraznému zvětšení velikosti genomu – na rozdíl od vyšších eukaryot , u nichž opakující se sekvence odvozené z exogenních genetických elementů tvoří podstatnou část genomu [21] .

Kromě strukturální podobnosti různé systémy CRISPR-Cas kombinují tři klíčové fáze imunity zprostředkované CRISPR: akvizici ( anglická  akvizice ) nebo adaptaci ( angl .  adaptace ) [21] , výraz ( anglický  výraz ) a interferenci ( anglická  interference ) . Ve fázi akvizice je do CRISPR vložen nový spacer, vytvořený z cizího genetického prvku, který vstoupil do buňky. Ve fázi exprese probíhá CRISPR transkripce a zpracování krátkých CRISPR RNA (crRNA) zacílených na specifický cíl. Při interferenci crRNA-Cas ribonukleoproteinový komplex rozpoznává cílovou nukleovou kyselinu díky komplementárnímu párování bází cíle s crRNA, načež štěpí cíl díky endo- a/nebo exonukleázové aktivitě Cas proteinů [14] [22] .

Je zajímavé, že práce systémů CRISPR-Cas má mnoho základních bodů společných s prací imunitního systému savců . I defektní bakteriofág tedy může způsobit imunizaci CRISPR (tedy vložení nového spaceru), stejně jako se může vyvinout imunitní odpověď savců při zavedení usmrceného patogenu [21] .

Systémy CRISPR-Cas lze přenést z mikroorganismu na mikroorganismus pomocí horizontálního přenosu genů . Boj proti invazi cizích genetických prvků do bakterie není pro bakterii vždy prospěšný. Například u bakterie Staphylococcus epidermidis může dojít ke snížení rezistence na antibiotika v důsledku zničení systémem CRISPR-Cas těch konjugativních plazmidů, které tuto rezistenci poskytovaly. U Staphylococcus aureus vede snížený počet lokusů CRISPR ke zvýšení počtu profágů , plazmidů a transponovatelných genetických prvků v buňce, což zvyšuje virulenci bakterie. Mohou však vymizet lokusy CRISPR-Cas, které brání šíření mobilních genetických elementů užitečných za daných podmínek [21] [23] .

Nákup distančních podložek

Protože adaptivní imunita zprostředkovaná CRISPR je kódována v DNA, proces imunizace zahrnuje kopírování a vkládání cizích genetických elementů do CRISPR jako nových spacerů. Spacery tvoří imunologickou paměť, která uchovává informace o minulých infekcích , a právě ta je základem reakce na opakovanou invazi podobných genetických prvků. Většina dat o molekulárních mechanismech získávání nových spacerů byla získána studiem systému CRISPR Escherichia coli typu I a Streptococcus thermophilus typu II . Ke správné orientaci a vložení nového spaceru dochází za účasti sekvence bezprostředně nad prvním opakováním; tak jsou na 5'konec lokusu CRISPR přidány nové spacery. Integrace nového spaceru mezi vedoucí sekvenci a první repetice se provádí komplexem Cas1-Cas2-protospacer. V některých systémech CRISPR-Cas se tohoto procesu účastní další proteiny. Při vložení nového spaceru dochází ke zdvojení repetice, díky čemuž je zachována správná struktura lokusu, která by měla začínat repeticí [14] [24] .

Vzhledem k tomu, že spacery jsou předány z předků na potomky během buněčného dělení, v přítomnosti podobných spacerů lze vytvořit fylogenetické vztahy mezi kmeny , které mají společné předkové spacery, a také kmeny, které mají nové, nedávno získané spacery [14] .

V systémech typu I a II může k inzerci spaceru dojít pouze z těch cizích prvků, ve kterých k protospaceru sousedí speciální sekvence PAM (  protospacer sousední  motiv) [24] . Bakterie navíc musí odlišit cizí genetický materiál od vlastního, aby nevložila fragment vlastního chromozomu jako spacer a nezacílila systém CRISPR-Cas do svého genomu, což by bylo pro buňku fatální. Systém E. coli typ I CRISPR-Cas odlišuje svou DNA přítomností Chi-sites  — 8-nukleotidových motivů , které se v jeho genomu opakují v průměru každých 5 tisíc párů bází [25] . Ačkoli mnoho spacerů může být vytvořeno ze stejného cizího genetického prvku, v genetickém prvku se některé motivy ukazují jako výhodnější při výběru budoucího spaceru. Pravděpodobně byly takové motivy fixovány jako výsledek přirozeného výběru spojeného s účinností spacerů; například některé spacery dávají vzniknout crRNA, které cílí proteiny Cas na částečně komplementární sekvence [14] .

Když jsou konfrontovány se stejným fágem, různé buňky vloží mírně odlišné fragmenty svého genomu jako spacer, takže velké populace , které mají velké množství spacerů proti stejnému fágu, nabízejí účinnější rezistenci: pokud fág zmutuje tak, že jeden z existujících spacery v populaci se stanou neúčinnými, jiné budou stále poskytovat ochranu [26] .

Exprese a tvorba crRNA

Po integraci částí cizích genetických elementů do CRISPR je nutné je transformovat do formy schopné zacílit Cas proteiny na cílové sekvence pro jejich rozpoznání a zničení. Tato forma je vodicí crRNA, která obsahuje jedinečnou sekvenci, která je komplementární ke specifickému cíli. Nejprve je řada repetic a spacerů CRISPR přepsána do jediného dlouhého transkriptu, pre-crRNA, který je poté rozřezán na krátké crRNA. Většina repetic v CRISPR jsou palindromy , takže jejich odpovídající pre-crRNA oblasti tvoří vlásenky . V mnoha případech jsou to právě tyto vlásenky, které jsou rozpoznávány proteiny Cas, které zpracovávají pre-crRNA na crRNA [14] .

Typicky je transkripce CRISPR závislá na vedoucí sekvenci a probíhá nepřetržitě, ale pomalou rychlostí. Rychlost se však výrazně zvyšuje ve stresových podmínkách nebo když se buňka srazí s fágy, což jí poskytuje rychlou a účinnou ochranu. Promotorové prvky byly nalezeny nejen ve vedoucí sekvenci, ale také v repeticích. Ačkoli celý lokus může být transkribován najednou, ukázalo se, že některé spacery v lokusu jsou transkribovány častěji než jiné, jako je několik prvních spacerů po vedoucí sekvenci a první repetice. Pro buňku je totiž daleko výhodnější mít silnější obranu proti invazivním prvkům, se kterými se setkala v nedávné minulosti, než proti těm, se kterými se setkala již dávno [14] .

Rušení

Ve fázi interference se crRNA vážou na své cíle pomocí párování bází, a tak nasměrují Cas endonukleázy , aby rozřezaly a zničily cíl. Tvorba komplexu crRNA a Cas proteinů poskytuje endonukleolytickou destrukci komplementárních crRNA NA sekvencí. Ačkoli cíle jsou primárně dvouvláknová DNA (dsDNA), některé systémy CRISPR-Cas mohou degradovat komplementární jednovláknové RNA (ssRNA). Systémy CRISPR-Cas, které rozpoznávají dsDNA, jsou náročné s ohledem na sekvence sousedící s protospacerem: zejména v systémech typu I a II jsou rozpoznávány pouze cíle obsahující motiv PAM (požadavek na přítomnost PAM může sloužit k ochraně proti řezání buněčný genom systémem CRISPR-Cas). Systémy, které pracují s ssRNA, takové požadavky nemají. Po počátečním endonukleolytickém útoku (rozbití cíle) Casem může dojít k další destrukci cíle působením jiných nukleáz [14] .

Různé systémy CRISPR-Cas

Všechny známé systémy CRISPR-Cas lze rozdělit do dvou hlavních tříd, 5 typů a 16 podtypů, na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určitých genů cas , struktury cas operonu , aminokyselinových sekvencí proteinů Cas a mechanismů, které zajistit fungování imunity zprostředkované CRISPR [27] [28] .

Kromě toho existuje systém CRISPR-Rx (CRISPR-CasRx), který se zaměřuje na RNA (na rozdíl od jiných CRISPR, zejména CRISPR-Cas9, který se zaměřuje na DNA). Díky tomu může CRISPR-Rx potlačit genovou expresi s nezměněným genetickým kódem [29] [30] .

Systémy první třídy jsou charakterizovány multiproteinovými efektorovými komplexy (Cascade, Cmr, Csm). Tato třída zahrnuje systémy typu I, III a IV. Systémy typu I jsou nejběžnější systémy CRISPR-Cas. Jejich cílem je dsDNA obsahující motiv PAM a destrukce je prováděna kaskádovým efektorovým multiproteinovým komplexem spojeným s proteinem Cas3. Systémy typu III jsou běžné u archaea a jsou charakterizovány multiproteinovými komplexy Csm a Cmr. Dokážou rozpoznat DNA i RNA a rozpoznání DNA nevyžaduje PAM. V systémech tohoto typu je zničení cílů prováděno proteinem Cas10 společně s efektorovými nukleázami, konkrétně Cmr4 v podtypu IIIA ( RNáza , která je součástí komplexu Cmr) a Csm3 v podtypu IIIB (RNáza, která je součástí komplexu Csm). Systémy IV. typu jsou poměrně vzácné, jejich distribuce a mechanismus účinku nejsou dobře známy [27] .

Systémy třídy II mají jeden efektorový protein. Tato třída zahrnuje typy II a V. Systémy typu II se aktivně používají v genetickém inženýrství; jsou charakterizovány přítomností endonukleázy Cas9 . V systémech tohoto typu není vodící RNA jedna crRNA, ale duplex crRNA a další RNA, tracrRNA. Duplex crRNA:tracrRNA řídí domény nikasy RuvC a HNH Cas9 tak, aby zavedly tupé konce v cílové DNA, která by měla mít PAM blízko 3' konce[ upřesnit ] . Systémy typu V jsou vzácné a jsou charakterizovány přítomností nukleázy Cpf1, která je směrována crRNA do cílové DNA. Tato nukleáza podobná RuvC provádí řez v místě distálně od 3' konce PAM. Na rozdíl od Cas9 tato nukleáza štěpí dsDNA za vytvoření lepivých, spíše než tupých konců dlouhých 5 nukleotidů [31] .

Níže uvedená tabulka uvádí signaturní geny studovaných systémů CRISPR-Cas a také funkce proteinů, které kódují. Přítomnost určitých podpisových genů slouží jako charakteristický rys typů a podtypů systémů CRISPR-Cas.

Signaturní geny subtypů systémů CRISPR-Cas
Podtyp podpisové geny Funkce proteinových produktů [14] [27] [28] [32]
IA Cas8a2, Csa5 Cas8a2 se účastní interference (váže crRNA a cíl). Csa5 - malá podjednotka efektorového komplexu
IB Cas8b Podílí se na rušení (rozpoznává RAM)
IC Cas8c Podílí se na rušení (rozpoznává RAM)
ID Cas10d Účastní se interference (váže crRNA a cíl a zavádí přerušení cíle)
TJ Cse1, Cse2 Cse1 možná interaguje s Cas3 a rekrutuje ho do efektorového komplexu [33] . Cse2 - malá podjednotka efektorového komplexu
LI Csy1, Csy2, Csy3, Cas6f Na tvorbě crRNA se podílí Csy2 a v menší míře Csy1 a Csy3 [34] . Cas6f je endoribonukleáza závislá na kovu , která se podílí na tvorbě crRNA
II-A Csn2 Podílí se na získávání spacerů, případně chránících chromozomální DNA před zavedením dvouřetězcových zlomů
II-B Cas9 Obsahuje dvě endonukleázové domény, které jednotlivě zavádějí jednořetězcové zlomy a působí společně - dvouřetězcový zlom. Podílí se na zpracování crRNA, její akumulaci, ale i destrukci cíle
II-C neznámý —
III-A cm2 Malá podjednotka efektorového komplexu
III-B cmr5 Malá podjednotka efektorového komplexu
IV Csf1 Podílí se na rušení (rozpoznává RAM)
PROTI Cpf1 Podílí se na interferenci (obsahuje nukleázovou doménu)

Systémy typu I a III

Jak bylo uvedeno výše, systémy typu I i typu III používají multiproteinové efektorové komplexy. Spojuje je také použití proteinu Cas6 pro zpracování pre-crRNA (někdy je nahrazen ortologem Cas5). Tyto a některé další podobnosti mezi systémy typu I a III hovoří ve prospěch jejich původu od společného předka [14] .

Píšu

Systémy typu I jsou rozděleny do šesti podtypů (IA, IB, IC, ID, IE, IF) na základě aminokyselinových sekvencí proteinů efektorového komplexu a vzájemného uspořádání jejich genů ( synthenia ) [35] . Systém subtypu IE E. coli [14] je nejvíce prozkoumaný .

V systémech typu I efektorový komplex – Cascade – zahrnuje Cas6 jako integrální podjednotku , takže zpracování crRNA probíhá v efektorovém komplexu a zralá crRNA s ním zůstává spojena. Komplex pak hledá svou cílovou sekvenci; současně pravděpodobně nejprve rozpozná svůj PAM a teprve poté zkontroluje klíčové pozice protospaceru na komplementaritu crRNA . Protože v repeticích CRISPR není žádný PAM, genom bakterie, která má systém CRISPR-Cas typu I, je tímto systémem spolehlivě chráněn před zničením. Když je navázán na Cascade, protospacer tvoří R-smyčku v cílové dsDNA , která vyžaduje negativní supercoiling ; to pravděpodobně usnadňuje odvíjení DNA nezávisle na nukleotidových trifosfátech (NTP). Komplex Cascade-protospacer je rozpoznán proteinem Cas3. Cas3 má HD nukleázovou doménu, stejně jako unwinding-translokační doménu, která pro svůj provoz vyžaduje NTP. Cas3 dokáže rozvinout duplexy DNA:DNA a DNA:RNA. HD doména se obvykle nachází na N-konci Cas3 [32] . HD doména zavádí nick do cíle v blízkosti PAM, načež se Cas3 odpojí od Cascade a využívá svou nukleosidtrifosfátovou hydrolyzační doménu k pohybu dále podél DNA, přičemž v průběhu cesty zavádí další zářezy [14] .

Kaskádová struktura (volná a vázaná na DNA) E. coli byla vizualizována v téměř atomovém rozlišení . Cíl je rozpoznán Watson-Crickovým párováním bází , ačkoli každý šestý protospacer nukleotid není komplementární k odpovídajícímu crRNA nukleotidu. V tomto ohledu obecná geometrie komplexu DNA-crRNA neodpovídá dvojité šroubovici : opakující se pološroubovicové závity duplexu jsou přerušovány nepárovými bázemi , což umožňuje DNA ohýbat se přes crRNA bez obalování. kolem toho. Kaskádová vazba na cíl a jeho související sekvenci má různé kinetiky a strukturní rysy, což umožňuje komplexu rozlišovat mezi cílem a sekvencemi v jeho blízkosti. V prvním případě následuje rušení a zničení cíle a ve druhém vložení nového spaceru. Takto řízená adaptace na rozdíl od primární, „naivní“ adaptace vyžaduje práci nejen Cas1 a Cas2 proteinů, ale také Cas3 [14] .

Kromě 6 podtypů systémů typu I (IA - IF) je znám ještě jeden podtyp, IU (U z anglického  uncharacterized  - uncharacterized, jelikož mechanismus řezání pre-crRNA a architektura efektorového komplexu jsou pro něj neznámé). Na rozdíl od většiny systémů typu I se HD doména proteinu Cas3 v IU nachází na C-konci [32] .

Typ III

Systémy typu III se dělí na dva podtypy: III-A a III-B. Vyznačují se přítomností proteinu Cas10, největší podjednotky efektorového komplexu Csm (v případě subtypu III-A) a Cmr (v případě subtypu III-B). Všechny systémy typu III navíc kódují jeden protein Cas5 a zpravidla několik paralogních proteinů Cas7 [32] . Oba subtypy se vyznačují použitím ortologu Cas6 pro zpracování pre-crRNA, i když zpracovatelský enzym není vždy stabilní složkou odpovídajícího efektorového komplexu (jako v systémech typu I). V roce 2008 se ukázalo, že systém III-A Staphylococcus epidermidis pracuje s cíli DNA a v roce 2009 systém III-B Pyrococcus furiosus  pracuje s RNA. Pro úspěšné rozpoznání cíle nevyžadují systémy III-A a III-B přítomnost motivu PAM [14] .

Další studium systémů typu III odhalilo nové záhady v substrátové specifitě podtypů III-A a III-B. Ukázalo se tedy, že systém III-A S. epidermidis může pracovat pouze s transkribovanými protospacery. Navíc se ukázalo, že Csm komplexy S. thermophilus a Thermus thermophilus mají latentní RNA-degradující aktivitu a zavádějí zlomy v RNA každých 6 nukleotidů. Stejná aktivita byla také prokázána pro Cmr komplexy. Systém III-A S. epidermidis nejen ničí syntetizované transkripty, ale také štěpí cílovou DNA způsobem závislým na transkripci na úkor specifických aminokyselinových zbytků Cas10 , které nejsou spojeny s rozpoznáním cíle. Hydrolýza RNA zprostředkovaná komplexy Csm a Cmr není katalyzována proteinem Cas10, ale podjednotkami Csm3 a Cmr4. Systém III-A tedy může degradovat DNA i RNA; předpokládá se, že dobře popsaná RNA degradující aktivita III-B systémů je doplněna schopností degradovat DNA [14] .

Protože systémy typu III nevyžadují přítomnost PAM v cílech, v jejich případě musí existovat mechanismus odlišný od mechanismu systémů typu I, aby se rozlišila vlastní a cizí dsDNA. V případě komplexu Csm je crRNA komplementární nejen k spaceru CRISPR, ale také k sousední repetici. Po navázání na cílovou molekulu se tedy crRNA naváže pouze na protospacer a po navázání na buněčnou DNA se naváže i na sousední repetici, na základě čehož systém III dokáže odlišit buněčnou DNA od cizí. Je zajímavé, že v systémech typu III je DNA štěpena velmi blízko míst, kde nejsou spárovány odpovídající báze crRNA a cílové DNA. O mechanismech získávání nových spacerů v systémech typu III není známo prakticky nic [14] .

Kromě běžně uznávaných podtypů III-A a III-B bylo v roce 2015 navrženo rozlišovat také podtypy III-C a III-D, které se vyskytují u některých archeí. V systémech typu III-C vykazuje Cas10 protein inaktivaci cyklázové domény; kromě toho se jeho aminokyselinová sekvence významně liší od sekvence Cas10 systémů III-A a III-B. V systémech III-D Cas10 postrádá HD doménu; navíc existuje jedinečný gen csx10 podobný genu cas5 . Oba systémy III-C i III-D postrádají geny cas1 a cas2 [32] .

V únoru 2016 se objevily informace, že u některých bakterií se systémy CRISPR-Cas typu III (například mořská bakterie Marinomonas mediterranea ) se namísto obvyklého proteinu Cas1 jedná o chimérický protein Cas1-RT zesíťovaný funkcemi reverzní transkriptázy . Díky přítomnosti takového proteinu se bakterie může integrovat do svého genomu spacery vytvořené z genomů patogenů s genomy RNA prostřednictvím reverzní transkripce [36] .

Bylo zjištěno, že systémy typu III, zejména Cas10, produkují cyklické oligoadenylátové druhé posly, převádějící ATP na cyklický produkt, který alostericky aktivuje Csm6, který pak pomáhá degradovat virovou RNA [37] .

Systémy typu II

Systémy CRISPR-Cas typu II se odlišují díky svému neobvyklému genetickému základu a molekulárním mechanismům. Konkrétně multiproteinové komplexy, které zpracovávají crRNA v systémech typu I a III, jsou v systémech typu II nahrazeny jediným proteinem, Cas9, který se podílí na všech třech základních krocích tohoto systému. Systémy typu II jsou tedy nejjednodušším typem systému CRISPR-Cas [32] . Kromě toho se v biogenezi crRNA podílejí další prvky jedinečné pro systémy typu II . Systémy typu II se vyskytují pouze u bakterií a mezi systémy typu I, II a III jsou nejméně běžné. Jsou to však systémy typu II, které našly uplatnění jako nástroj pro úpravu genomů [14] .

Systémy typu II jsou rozděleny do tří podtypů na základě přítomnosti a sekvencí asociovaných genů cas : II-A, II-B a II-C. Kromě genů cas1 a cas2 , které jsou společné všem systémům typu I–III, mají systémy typu II další gen cas9 , který kóduje endonukleázu Cas9. Cas9 se podílí na získávání nových spacerů, akumulaci crRNA a interferenci. Kromě toho systémy II-A obsahují gen csn2 , jehož proteinový produkt se podílí na získávání spacerů. V systémech II-B je tento gen nahrazen genem cas4 a systémy II-C nemají ani csn2 ani cas4 . Délka Cas9 se u různých podtypů liší a systémy II-C se zpravidla vyznačují nejkratšími ortology [14] . Jádrová část Cas9, která je tvořena nukleázovou doménou a shlukem bohatým na arginin , charakteristickým pro tento protein, je s největší pravděpodobností kódována geny odvozenými z mobilních genetických elementů, které nejsou v žádném případě spojeny s CRISPR. Vzhledem k významné podobnosti v aminokyselinových sekvencích mezi Cas9 a jeho homology, které nejsou spojeny se systémy CRISPR-Cas, nelze Cas9 považovat v plném smyslu za charakteristický protein systémů typu II. Lze to však považovat za charakteristický znak těchto systémů [32] .

Biogeneze crRNA v systémech typu II má řadu jedinečných rysů. Zejména vyžaduje zpracování RNázou III a vazbu specifických trans -kódovaných CRISPR RNA (tracrRNA) na pre-crRNA . TracrRNA obsahuje oblast komplementární k oblasti crRNA, která byla transkribována z repetice CRISPR. Během zpracování crRNA se tracrRNA váže na crRNA, které ještě nebyly vyříznuty v rámci pre-crRNA, což vede k tvorbě zralých crRNA. Výsledný komplex zralé crRNA-tracrRNA-Cas9 obsahuje krátkou crRNA, ve které je 20–24 nukleotidů komplementárních ke 3' konci spaceru a 20–24 nukleotidů je komplementárních k 5' konci repetice. První krok ve zpracování pre-crRNA nastává v oblastech komplementárních k repeticím CRISPR; v důsledku toho se vytvoří 3'-konec crRNA. Následné zkrácení 5'-konce neznámými nukleázami nastává v sekvencích odpovídajících spacerům CRISPR. Akumulace crRNA v buňkách vyžaduje protein Cas9, i když není známo, zda je to způsobeno zapojením Cas9 do zpracování crRNA, stabilizací crRNA po zpracování pomocí Cas9 nebo obojím [14] .

Komplex crRNA-tracrRNA-Cas9 rozpoznává cílové DNA, které jsou komplementární k crRNA a obsahují PAM. Stejně jako v systémech typu I brání nepřítomnost PAM v lokusech CRISPR štěpení buněčné DNA. Nejprve Cas9 rozpozná PAM a poté se sousední DNA zkontroluje na komplementaritu crRNA. Řezání cílové DNA se provádí zavedením dvou jednořetězcových zlomů s motivy RuvC a HNH proteinu Cas9, v důsledku čehož se na konci protospaceru v R vytvoří dvouřetězcový zlom s tupými konci. -smyčka nejblíže k PAM, tři nukleotidy před PAM [14] .

V systémech III-C (zejména v systému Neisseria meningitidis CRISPR-Cas ) byl popsán alternativní mechanismus pro biogenezi crRNA, který využívá promotory umístěné v repeticích CRISPR. Alternativní směr transkripce může nastat i bez účasti RNázy III [14] .

Funkce mimo imunitu prokaryot

Navzdory skutečnosti, že funkce systémů CRISPR-Cas jsou obvykle spojeny s adaptivní imunitou prokaryot , existuje mnoho důkazů pro účast těchto systémů ve zcela jiných procesech, které nesouvisejí s ochranou před cizími genetickými prvky (např. , v regulaci skupinového chování , virulence , opravy DNA a evoluce genomu ). Některé známé příklady zapojení CRISPR-Cas do neimunitních procesů jsou stručně uvedeny níže [38] .

Funkce CRISPR nesouvisející s adaptivní imunitou [38]
Funkce Typ systému Mechanismus Zapojení genů cas Zapojení CRISPR Pohled Experimentální potvrzení
Genová regulace III-B Komplementární destrukce mRNA Ano Ano Pyrococcus furiosus Ne
Geny regulující
skupinové chování		 IF

IC		 Na základě
částečné komplementarity
Neznámé		 Ano

Ano		 Ano

Neznámý		 Pseudomonas aeruginosa

Myxococcus xanthus		 Ano

Ano

Geny regulace virulence		 II-C

II-B


II-B
Typ CRISPR neznámý		 Cas9-dependentní modifikace
buněčného povrchu
Cas9-zprostředkovaná downregulace produkce
bakteriálních lipoproteinů
Neznámá regulace feoAB
operonu částečnou komplementaritou
 Ano

Ano

Ano
Ne		 Ne

Ne

Ne
Ano		 Campylobacter jejuni

Francisella novicida

Legionella pneumophila
Listeria monocytogenes 		Ano

Ano

Ano
Ano
Remodelace genomu LI Odstranění oblastí genomu
prostřednictvím samo-cílení		 Ano Ano Pectobacterium Ano
oprava DNA TJ Oprava DNA pomocí
Cas1		 Ano Ne Escherichia coli Ano
Konkurence mezi
mobilními genetickými prvky (MGE)		 LI Specifické zacílení
konkurentů SHM		 Ano Ano Fág ICP1
Vibrio cholerae		 Ano
Zbytek buněk Neurčeno Cas1 a Cas2 fungují podobně
jako toxin-antitoxinové systémy ,
spouštějí dormanci a následnou buněčnou smrt
během fágové infekce .		 Ano Ne Neurčeno Ne

Příkladem je systém CRISPR-Cas v predátorské delta-proteobakterii Myxococcus xanthus , která je všudypřítomná v půdě . Jeho životní cyklus zahrnuje fáze tvorby plodnic a sporulace, během kterých se jednotlivé buňky skládají do agregátů a diferencují se na myxospory , které tvoří plodnici. Oddělováním se myxospory mění na jednotlivé bakteriální buňky a tento proces je přísně regulován signály snímajícími kvorum a intracelulárními signálními kaskádami . Systém CRISPR-Cas této bakterie patří k typu IC a zahrnuje 7 genů Cas a lokus CRISPR obsahující 22 spacerů. Při nedostatku živin systém spouští v buňkách syntézu A-signálu, sestávajícího z aminokyselin a peptidů , čímž se aktivuje transkripce genu fruA (tento gen může aktivovat i cas operon prostřednictvím proteinu Cas8c). Když se buňky dostanou do vzájemného kontaktu, vytvoří C-signál kódovaný genem csgA , který také aktivuje fruA , který pak podporuje expresi genů cas . Geny cas jsou tedy spolu s genem fruA součástí pozitivní zpětné vazby a podílejí se na tvorbě plodnice a sporulaci bakterie [38] .

Systémy CRISPR-Cas se mohou podílet na regulaci virulence u patogenních bakterií. Například Francisella novicida má systém typu II sestávající ze čtyř genů cas a inverzně orientovaného lokusu CRISPR obsahujícího 13 spacerů. Negativně reguluje expresi bakteriálního lipoproteinu (BLP), faktoru povrchové virulence. Je to ten druhý, který je rozpoznán Toll-like receptory 2 imunitního systému hostitele , takže pro úspěšnou infekci je nutná downregulace BLP. Předpokládá se, že komplex Cas9, malé crRNA (scaRNA) a tracrRNA se váže na transkript blp a ničí jej neznámým mechanismem. Systémy CRISPR-Cas se podílejí na regulaci virulence u takových bakterií, jako je Campylobacter jejuni , Neisseria meningitidis , Legionella pneumophila (v případě této bakterie se na regulaci virulence podílí pouze cas2 ze všech genů cas ), Listeria monocytogenes ( viz tabulka) [38] .

V mnoha bakteriích se systémy CRISPR-Cas používají k regulaci jejich vlastních genů nesouvisejících s virulencí. Zejména u Pseudomonas aeruginosa se systém typu IF podílí na regulaci genů spojených s tvorbou biofilmu . Kromě toho existují návrhy, že proteiny Cas1 a Cas2 mohou poskytovat ochranu proti bakteriofágům, které působí podobně jako toxin-antitoxinové systémy, to znamená, že způsobují odpočinek a následnou smrt infikovaných buněk. Existují důkazy o zapojení systémů CRISPR-Cas do opravy DNA. Cas1, který je součástí systému typu E. coli IE , tedy může fyzicky interagovat s opravnými a rekombinačními enzymy . Delece genu cas1 nebo souvisejících lokusů CRISPR vedla ke zvýšené citlivosti k činidlům poškozujícím DNA ak poruchám segregace chromozomů během dělení [38] .

Systémy CRISPR-Cas zacílené na bakteriální chromozom mohou hrát důležitou roli při přeuspořádání genomu v bakteriích a poskytnout genetický základ pro evoluci  – navzdory skutečnosti, že ve většině případů samo-cílené proteiny Cas vedou k buněčné smrti. U bakterie Pectobacterium atrosepticum bylo prokázáno , že crRNA zacílené na chromozomální ostrovy získané horizontálním přenosem genů obvykle vedou k buněčné smrti, ale v některých přežívajících buňkách byly pozorovány velké chromozomální delece, včetně úplného odstranění cílového ostrova asi 100 páry bází. V těchto vzácných případech delece zvýšily celkovou zdatnost mutantů [38] .

Zajímavé je, že systémy CRISPR-Cas jsou přítomny nejen v prokaryotech, ale také v bakteriofágách a řadě dalších mobilních genetických elementů (MGE). Možná je tato okolnost spojena s šířením systémů CRISPR-Cas v bakteriích a archaea horizontálním přenosem genů. Systémy CRISPR-Cas takových prvků mohou být zaměřeny na jiné MKP, poskytující mechanismy pro konkurenci mezi MKP. MGE nesoucí systémy CRISPR-Cas mohou soutěžit s ostrůvky bakteriální patogenity , které jsou z genomu během infekce fágem a přeneseny na jiné bakterie ve fágových kapsidách . Pomocí fágových kapsid pro svůj vlastní přenos mohou ostrovy patogenity zcela zablokovat reprodukci fágů. Příkladem je systém CRISPR-Cas fága ICP1 Vibrio cholerae , který patří k typu IF a má 2 geny cas a 9 spacerů (zřejmě je homologní se systémem Yersinia pestis ). Jeden z spacerů je komplementární k ostrovu patogenity Vibrio cholerae , takže fág může soutěžit s ostrůvky patogenity o kapsidy. Systém CRISPR-Cas ICP1 navíc může získat nové spacery, což umožňuje fágovi společný vývoj s hostitelskou bakterií [38] [39] .

V roce 2016 se objevily informace, že velké viry obsahující jadernou cytoplazmatickou DNA mají ochranný systém podobný CRISPR a určený k ochraně proti virofágům (zejména virofágu Zamilon v Mimiviru ). Tento obranný systém dostal název MIMIVIRE [40] .

Opozice vůči CRISPR

Bylo zjištěno, že v reakci na rozšíření určitých spacerů CRISPR v bakteriální populaci (a následně na šíření rezistence vůči odpovídajícím bakteriofágům) bakteriofágy intenzivně mutují a dokonce ztrácejí ty části genomu, které nejčastěji slouží jako cíle. pro systémy CRISPR-Cas a integrují se do bakteriálního genomu jako spacery [21] .

Některé fágy kódují specifické proteiny (anti-CRISPR proteiny, Acr), které interferují se systémy CRISPR-Cas a podporují infekci. Analýza fágů Pseudomonas aeruginosa umožnila izolovat několik odrůd Acr proteinů. Zpočátku byly proteiny Acr popsány v kmenech P. aeruginosa , které ve svých chromozomech nesou profágy . Ačkoli většina z těchto kmenů měla systém aktivního typu IF CRISPR-Cas, u některých kmenů zůstal systém neaktivní i v přítomnosti spacerů cílených na fágy. Molekulární analýza kmenů s neaktivními systémy odhalila řadu malých fágem kódovaných proteinů, které byly zodpovědné za vývoj fenotypu citlivého na fágy . Acr proteiny mohou potlačovat činnost systémů CRISPR-Cas různými způsoby, zejména (v případě systémů typu IF) vazbou na komplex Cascade a blokováním jeho vazby na cílovou DNA nebo vazbou na proteiny Cas, což vede k ztráta jejich nukleázové aktivity [41] .

Je znám protein Acr, který zabraňuje vazbě helikázy -nukleázy Cas3 na komplex crRNA a dalších proteinů Cas, který se již navázal na svou cílovou DNA. Protože komplex Cas a crRNA spojený s DNA neumožňuje transkripčnímu aparátu vázat se na DNA, tento protein Acr přemění komplex crRNA a Cas na transkripční represor. K říjnu 2015 se jedná o první známý příklad regulace aktivity systému CRISPR-Cas pomocí proteinového faktoru [42] . Acr proteiny mohou vykazovat silnou specificitu pro systém CRISPR-Cas; konkrétně proteiny, které blokovaly P. aeruginosa IF systém , neměly žádný vliv na P. aeruginosa IE nebo E. coli IF systém . Některé fágy se supresorovými geny pro systém P. aeruginosa IF však také kódovaly malé supresorové proteiny, které potlačují systém IE P. aeruginosa , ale ne E. coli IE [41] .

Objevení se ochranných mechanismů proti interferenci CRISPR u fágů je považováno za výsledek dlouhé koevoluce fágů a jejich hostitelů [22] .

Evoluční význam

Podle E. V. Kunina lze provoz systémů CRISPR-Cas považovat za evoluční proces, který splňuje Lamarckův evoluční scénář , konkrétně tato kritéria:

  • Genomické změny v lokusech CRISPR (vkládání nových spacerů) jsou způsobeny vlivem prostředí (přesněji cizích genetických elementů).
  • Změny jsou omezeny na specifické genomové lokusy.
  • Změny poskytují adaptaci na konkrétní dopad (na konkrétní cizí genetický prvek) [43] [44] .

Nicméně, tento pohled na CRISPR byl kritizován. Podle A. Wysse je shoda CRISPR-Cas s lamarckovskými kritérii pouze povrchní [43] .

Systémy CRISPR-Cas vykazují některé vlastnosti darwinovské evoluce  – zejména výskyt náhodného získávání spacerů v celé populaci , po kterém následuje výběr přežívajících klonů s nejlepší kondicí [21] .

Identifikace

Systémy CRISPR-Cas jsou rozšířeny mezi bakteriemi a archaeami [45] a jejich charakteristickým znakem je střídání opakujících se sekvencí a spacerů. Díky této vlastnosti se lokusy CRIPSR celkem snadno nacházejí v dlouhých sekvencích DNA, protože s nárůstem počtu repetic v lokusu klesá pravděpodobnost falešně pozitivního nálezu. Mezi programy používané k vyhledávání CRISPR na základě nalezení repetic oddělených mezerami v dlouhých sekvencích patří CRT [46] , PILER-CR [47] a CRISPRfinder [48] .

Nalezení CRISPR v metagenomických datech je obtížnější: pomocí standardních algoritmů nelze lokusy CRISPR shromáždit kvůli přítomnosti mnoha repetic, stejně jako variací specifických pro kmen. Ke zvýšení počtu lokusů CRISPR a následné analýze obsahu spacerů lze použít polymerázovou řetězovou reakci, ale tato metoda poskytuje pouze informace o konkrétním lokusu CRISPR a je použitelná pouze pro organismy, jejichž genomy jsou dostupné v databázích (takže vhodné primery lze vytvořit ) [49] [ 50] [51] [52] [53] .

Aplikace v genetickém inženýrství

Před objevem funkcí a mechanismů působení systémů CRISPR-Cas jako metod pro editaci genomu specifického pro lokus, metody založené na použití nukleáz obsahujících zinkové prsty ( anglicky.  Zinc-finger nucleases, ZFNs ), as stejně jako TAL endonukleázy byly nejintenzivněji vyvinuty ( Transcription activator-like efektor nuclease, TALEN ) .  Tyto metody jsou poměrně pracné, málo účinné a drahé: pro každý nový cílový lokus je potřeba vývoj, exprese a verifikace zcela nového páru polypeptidů , což výrazně omezuje rozsah těchto metod [14] [54] .

V letech 2012–2013 se však v genetickém inženýrství objevily zásadně nové metody manipulace s genetickým materiálem založené na využití systémů CRISPR-Cas. Tyto metody jsou vhodné pro cílenou editaci genomů prokaryot i eukaryot (ta sice nemají vlastní systémy CRISPR-Cas, nicméně se ukázalo, že prvky systému CRISPR-Cas bakteriálního původu uměle vnesené do eukaryot buňky jsou schopny fungovat v novém prostředí). Moderní technologie CRISPR-Cas přitom využívají protein Cas9, který je stejný pro všechny cílové lokusy a specificitu účinku neurčuje protein, ale crRNA. Metody založené na ZFN a TALEN se dodnes používají a dokonce jsou preferovány pro klinický výzkum, ale jednoduchost, účinnost a nákladová efektivita metod využívajících systém CRISPR-Cas9 z nich udělala první volbu mezi metodami pro přímou editaci a vazbu genomu. s DNA [14] [54] .

Metody založené na CRISPR-Cas9 jsou blízké přirozeným mechanismům působení těchto systémů: RNA se používá k rozpoznání cílové sekvence, která se nachází v blízkosti PAM, a jí řízená nukleáza Cas9 vytváří dvouvláknový zlom v cílovém místě. Při editaci eukaryotického genomu však výsledkem práce CRISPR-Cas9 není zničení celé molekuly DNA, ale oprava dvouvláknového zlomu produkovaného Cas9. Oprava může být provedena jak nehomologním spojením konců ( NHEJ ), tak homologní  rekombinací . Nehomologní oprava spojování konců často vede k malým inzercím nebo delecím , které mohou narušit čtecí rámec genů kódujících protein, což vede ke ztrátě funkce cílového genu. Způsobením mnoha dvouřetězcových zlomů lze dosáhnout velkých delecí a dokonce i inverzí [14] .

Naproti tomu oprava homologní rekombinací zahrnuje nahrazení odstraněné sekvence novou sekvencí, která je komplementární k opravnému templátu, který výzkumník sám vytvoří. Homologní rekombinace tedy může být použita k odstranění nežádoucích mutací , vytvoření nových alel, vložení nebo sloučení funkčních domén. Navíc mutační inaktivace domén RuvC nebo HNH Cas9 převádí tento protein na RNA-řízenou nikázu produkující jednovláknové zlomy spíše než dvouvláknové zlomy. Inaktivace obou domén převádí Cas9 na RNA-řízený DNA-vazebný protein , který neřeže cíl. V tomto případě může být doména s jinými funkcemi připojena k doméně vázající DNA, což zase může způsobit různé změny v cílovém lokusu: aktivaci nebo represi transkripce, modifikaci chromatinu , zvýšenou tvorbu smyčky a mnoho dalších. Inaktivovaná forma Cas9 (dCas9, „mrtvý“ Cas9) navíc slouží jako základ pro nové výzkumné techniky, jako je zobrazování pomocí fluorescence nebo vytváření značek pro následnou fyzikální izolaci lokusů [14] .

Navzdory efektivitě použití systémů CRISPR-Cas ukládá původ Cas9 určitá omezení pro výběr DNA cílů: například při použití Streptococcus pyogenes Cas9 , pouze sekvence následované PAM, konkrétně 5'-NGG (kde N je jakýkoli nukleotid). Potřeba PAM však nepředstavuje vážná omezení pro použití systémů CRISPR-Cas9: v lidském genomu se takové sekvence vyskytují téměř každých 8–12 nukleotidů. Gen Cas9 by měl být před použitím v genetických konstruktech předběžně optimalizován pro použité kodony v souladu s organismem, jehož genom má být modifikován [55] : gen cas9 S. pyogenes má nízký obsah GC (35 %), a pro organismy, jejichž genomy mají vysoké složení GC, může být nezbytná optimalizace kodonů Cas9 [56] .

V současnosti se pro editaci genomu používá systém typu CRISPR-Cas II a nejčastěji se používá protein SpyCas9 (Cas9 nukleáza bakterie S. pyogenes ); jsou však vyvíjeny alternativní proteiny Cas9, které rozšíří rozsah CRISPR-Cas. Například zkrácené formy Cas9 mohou rozpoznat různé sekvence PAM. Ačkoli editaci genomu lze efektivně provádět s crRNA a tracrRNA transkribovanými odděleně, vývoj technologie single guide RNA (sgRNA) tento systém zjednodušil. V tomto případě je čtyřsložkový systém RNáza III:crRNA:tracrRNA:Cas9 nahrazen dvousložkovým systémem sgRNA:Cas9. V současné době se sgRNA používá mnohem častěji než samostatné crRNA a tracrRNA. Konečně se pracuje na zlepšení specifičnosti Cas9 a snížení vedlejších účinků [14] [54] . Začátkem roku 2016 byly zveřejněny výsledky práce amerických výzkumníků, kterým se podařilo snížit počet chyb téměř na nulu [17] .

Doručení sgRNA a Cas9 do cílových buněk je zajištěno různými metodami. K tomu mohou být použity například plazmidy kódující sgRNA a Cas9 a buňky jimi mohou být transfekovány (nebo transformovány v případě prokaryot). Takové plazmidy mohou být dopraveny do buněk elektroporací [57] . V některých případech se ukazuje jako výhodnější použít plazmidy kódující Cas9 a dodat RNA ve formě amplikonů generovaných PCR [55] .

V roce 2015 byla navržena nová metoda pro dodávání sgRNA a Cas9 do buňky uvnitř speciálních nanocívek. Taková nanocívka se skládá z jednoho hustě propleteného řetězce DNA, jehož jeden z úseků je komplementární k přenesené sgRNA; komplex sgRNA:Cas9 je tedy fixován uvnitř cívky. Navíc je nanocívka schopná samosestavení. K jedné nanocívce lze připojit mnoho různých komplexů sgRNA:Cas9. Při kontaktu s buňkou nanocoil vstupuje do endozomu , nicméně speciální polymer pokrývající nanocoil zajišťuje destrukci endozomu a umožňuje sgRNA:Cas9 dosáhnout jádra [58] .

Modifikace metod

Pro přímou editaci genomu eukaryotických buněk se používá nejen Cas9 S. pyogenes , ale také Cas9 Streptococcus thermophilus , Neisseria meningitidis [59] [60] , stejně jako Cas9 ze Staphylococcus aureus (SaCas9), což je 25 % menší než SpyCas9, což umožňuje jeho zabalení do adeno-asociovaného viru (AAV) pro dodání vektoru do buněk živého organismu jako terapeutické činidlo [61] .

Forma Cas9 (dCas9) neschopná štěpit DNA našla široké uplatnění. Použití dCas9 zesíťovaného na fluorescenční protein je základem nové metody CASFISH ( CRISPR-Cas9 mediated fluorescence in situ hybridization ) , která umožňuje fluorescenční značení cílových lokusů [62] . Pomocí tohoto dCas9 lze sledovat délku telomer a také pozorovat dynamiku určitých lokusů během buněčného cyklu [63] .

Forma dCas9 může být použita k potlačení transkripce cílového genu (když se na něj váže v promotorové oblasti , regulačních oblastech nebo na začátku kódující oblasti); kromě toho může být represorový peptid ligován k dCas9, aby se potlačila transkripce . Naopak dCas9 zesíťovaný s proteiny aktivujícími transkripci (transkripční faktory a efektory [64] ) může aktivovat transkripci cílového genu. Kromě toho mohou být k dCas9 připojeny umělé restrikční endonukleázy a také enzymy, které modifikují epigenom ( DNA metyltransferázy , histon acetyltransferázy ) a tím regulují aktivitu cílových genů [65] [66] [67] . V roce 2016 byly myší embryonální kmenové buňky přeprogramovány na dvě extraembryonální linie ( trofoblast a extraembryonální endodermální buňky ) aktivací genů Cdx2 a Gata6 pomocí aktivátorů zprostředkovaných CRISPR [68] .

Dále může být dCas9 zesíťován s monomerem endonukleázy FokI , který funguje jako dimery . FokI dimery mohou zavádět dvouřetězcové zlomy v cílových sekvencích. Dvě sgRNA se používají k nasměrování dCas9 zesíťovaného na monomer FokI, což výrazně zvyšuje přesnost systému. Když jsou dva monomery, z nichž každý je řízen svou vlastní sgRNA, umístěny ve vzdálenosti asi 30 párů bází od sebe, FokI dimerizuje a zavádí dvouvláknový zlom [69] .

K vyčištění lokusů spojených s sgRNA lze použít dCas9 nesoucí určité epitopy . Ve skutečnosti je tato metoda speciální variantou imunoprecipitace chromatinu [70] .

Byly nalezeny analogy Cas9, které mohou štěpit molekuly RNA místo DNA. Použití těchto proteinů umožní editaci nebo selektivní potlačení aktivity miRNA [71] [72] . Francisella novicida Cas9 (FnCas9) může být přeprogramován tak, aby cílil na genom RNA viru hepatitidy C , což vede k potlačení životního cyklu viru v eukaryotických buňkách. Na základě tohoto systému je možné vytvořit stovky agentů proti různým virům [73] .

Na podzim roku 2015 byla navržena nová metoda, alternativa k CRISPR-Cas9 - CRISPR-Cpf1 . Cpf1 je endonukleáza, která je efektorovým proteinem systémů CRISPR-Cas typu V. Je menší než Cas9 a ke svému fungování vyžaduje pouze crRNA, nikoli tracrRNA. V tomto ohledu je možné, že v některých případech bude metoda CRISPR-Cpf1 pohodlnější než metoda CRISPR-Cas9 [74] .

V roce 2015 byla také navržena nová samoklonovací metoda CRISPR .  V tomto případě je do buněk zaveden plazmid obsahující samoklonující se palindromickou sgRNA a také krátká dvouvláknová DNA, která obsahuje sekvenci kódující požadovanou sgRNA. Když je plazmid transkribován, výsledná sgRNA v komplexu s Cas9 se komplementárně váže na sekvenci v plazmidu kódující sgRNA. Cas9 zavádí dvouvláknový zlom, který je opraven homologní rekombinací s použitím zavedené dvouvláknové DNA jako templátu; v důsledku toho plazmid opět obsahuje sekvenci kódující požadovanou sgRNA. Na rozdíl od standardní metody CRISPR, která vyžaduje dlouhou a pracnou produkci speciálních plasmidů pro každý nový cílový lokus, může metoda samoklonování CRISPR zkrátit dobu experimentu ze šesti dnů na tři hodiny a snížit jeho náklady šestkrát [75] .

V současné době se intenzivně vyvíjejí chemické metody pro kontrolu činnosti CRISPR-Cas: dávka, trvání účinku, specificita a další parametry [76] [77] .

Biotechnologické a lékařské důsledky

V současné době se metody CRISPR-Cas úspěšně používají v genetickém inženýrství různých organismů: mnohobuněčných i jednobuněčných ( kvasinkových ) eukaryot a prokaryot [56] [78] . Použití CRISPR-Cas v mikroorganismech umožňuje modifikovat jejich metabolické dráhy , což otevírá možnosti pro vývoj nových biotechnologických strategií [79] . Kromě toho má pro biotechnologii velký význam vytváření kmenů technologicky významných bakterií odolných vůči různým fágům díky CRISPR-Cas [21] .

Pro modelové organismy (například myši [80] , ovocná muška Drosophila melanogaster [81] , háďátko Caenorhabditis elegans [82] , zebrafish [83] a další) byly vyvinuty metody úpravy genomů pomocí CRISPR-Cas . Takové metody byly použity k úpravě genomu hub [84] , zejména vláknité houby Aspergillus oryzae , která se používá v průmyslu pro fermentaci sóji [85] a žampionů [86] . Velký význam mají práce na editaci pomocí CRISPR-Cas buněčných kultur savců včetně člověka [87] . V roce 2017 byl touto metodou upraven genom lidských embryí [88] .

Probíhají práce na úpravě genomů pomocí CRISPR-Cas u skotu [89] , prasat [90] a dalších zvířat velkého ekonomického významu, jako jsou včely [91] . V listopadu 2015 byly zveřejněny výsledky experimentu, ve kterém bylo pomocí technologie CRISPR-Cas inaktivováno 62 endogenních retrovirů v genomu prasete . Autoři studie doufají, že díky těmto výsledkům bude v budoucnu možná xenotransplantace orgánů z prasete na člověka [92] . Konečně, mutageneze CRISPR-Cas může být použita pro kontrolu invazivních druhů (např .)[93].

Technologie CRISPR-Cas byla úspěšně aplikována v genetickém inženýrství rostlin [94] , včetně okrasných rostlin (například petúnie [95] ) a mnoha důležitých plodin: rýže [96] , sójové boby [97] , pšenice , čirok , kukuřice , rajče [98] a pomeranč [99] . Zkoumá se možnost zavedení systémů CRISPR-Cas do pěstovaných rostlin za účelem vytvoření antivirové imunity [100] [101] . Systém CRISPR-Cpf1 [102] lze také použít pro genetické inženýrství rostlin .

Metody založené na CRISPR-Cas lze také použít v medicíně [103] k léčbě široké škály onemocnění: virových (včetně infekce HIV [104] [105] a herpesvirových infekcí [106] ), alergií a imunologických onemocnění ( včetně autoimunitních [107] ) [108] , onkologických [109] [110] [111] , kardiovaskulárních onemocnění [112] a dokonce i revmatismu [113] a také dědičných poruch [114]  , jako je Downův syndrom , srpkovitá anémie [ 115] , retinitis pigmentosa [116] a β-thalassemia [117] . V roce 2013 se objevila publikace [118] , která uvádí, že vědci byli schopni upravit abnormální gen v kmenových buňkách pacienta s cystickou fibrózou . Je možné, že systém CRISPR-Cas může pomoci při léčbě Duchennovy svalové dystrofie (DMD): bylo prokázáno, že CRISPR-Cas může obnovit dystrofinový gen v buněčné kultuře DMD [119] . Předpokládá se, že takové buňky s „opraveným“ genomem lze transplantovat do těla pacienta, kde mohou nahradit nemocné buňky a plnit potřebné funkce [54] . V říjnu 2016 byl v Číně upraven genom dospělého člověka pomocí CRISPR/Cas: pacientovi s rakovinou plic byly injekčně podány T-lymfocyty modifikované CRISPR-Cas [120] . Vědci se domnívají, že úprava genomu malarického komára pomocí CRISPR-Cas může pomoci v boji proti malárii [121] [122] . Byla prokázána možnost editace genomu dalšího významného patogenního prvoka, Toxoplasma gondii , pomocí CRISPR-Cas [123] .

Systém CRISPR-Cas lze použít k získání tkání odolných vůči zánětu z lidských pluripotentních buněk [124] .

Metody CRISPR-Cas se ukázaly jako účinné při manipulaci s lokusem PRPN , který kóduje prionový protein odpovědný za řadu neurodegenerativních onemocnění u lidí a jiných savců [125] .

Buněčné linie modifikované pomocí CRISPR-Cas mohou být použity jako modely pro různá lidská onemocnění. Například buňky s mutacemi odpovídajícími dvěma onemocněním ledvin ( polycystické onemocnění ledvin a fokální segmentální glomeruloskleróza ) byly získány z lidské pluripotentní buněčné linie pomocí CRISPR-Cas . Později byly z těchto buněk vypěstovány miniorgány odpovídající ledvinám osoby s těmito nemocemi [126] . Stejná metoda byla použita k modelování syndromu dlouhého QT na kardiomyocytech . Takové modely mohou pomoci při studiu nemocí a vývoji nových léků [127] .

Úprava DNA pro boj s infekcí HIV

V listopadu 2018 vyšlo najevo, že týmu čínských vědců pod vedením He Jiankui se podařilo vytvořit první lidi na světě s uměle upravenými geny ( CCR5 postižené ) – dvě dvojčata , která mají být imunní vůči viru lidské imunodeficience [128] [129] . Tento experiment byl kritizován za porušení četných vědeckých a etických pravidel [130] .

Reakce veřejnosti

V roce 2015 nejméně čtyři laboratoře v USA, laboratoře v Číně a Spojeném království a také americká biotechnologická společnost Ovascience oznámily své plány na úpravu genomů lidských embryí pomocí CRISPR-Cas [131] . Ve světle těchto událostí mnoho vědců obhajovalo zavedení mezinárodního moratoria na používání technologie CRISPR-Cas v lidských embryích a zárodečných buňkách , a to i pro lékařské účely [132] [133] . Tito vědci podpořili další základní výzkum CRISPR, nicméně podle jejich názoru není technologie CRISPR-Cas dosud dostatečně vyvinuta, aby zaručila absenci nepříznivých mutací a dědičných defektů u pacientů při aplikaci v klinické praxi [134] .

V dubnu 2015 skupina čínských vědců publikovala článek v časopise Protein & Cell , který informoval o výsledcích svého pokusu změnit DNA neživotaschopných lidských embryí pomocí CRISPR-Cas. Snažili se opravit mutaci vedoucí k beta talasémii [15] . Podle vedoucího výzkumníka Nature and Science tento článek odmítly z etických důvodů [135] . Výsledky experimentu nebyly příliš optimistické kvůli četným mutacím, které se vyskytly mimo cílový gen. Autoři studie uvedli, že v současné době není technologie CRISPR-Cas ještě připravena pro použití v reprodukční medicíně [15] .

V prosinci 2015 se ve Washingtonu konal Mezinárodní summit o editaci lidských genů pod vedením Davida Baltimora . Během tohoto summitu diskutovali zástupci národních akademií věd ve Spojených státech, Velké Británii a Číně o etických otázkách modifikace genů v lidských zárodečných buňkách. Během jednání bylo rozhodnuto pokračovat v dalším základním a klinickém výzkumu na vhodných právních a etických základech. Zvláštní pozornost byla věnována rozdílu mezi klinickým použitím somatických buněk , ve kterých je šíření produkovaných mutací omezeno na jednoho jedince, a zárodečnými buňkami , jejichž genomové abnormality mohou být zděděny další generací. To může mít nepředvídané a dalekosáhlé důsledky pro lidskou evoluci  , jak genetickou, tak kulturní [136] .  

V únoru 2016 dostala skupina britských vědců povolení ke genetické modifikaci lidských embryí pomocí CRISPR-Cas a souvisejících metod [137] [138] .

V letech 2012 a 2013, na začátku průlomu s CRISPR v genetickém inženýrství, byla metoda CRISPR-Cas nominována na cenu Průlom roku televizní show Science Magazine . V roce 2015 toto ocenění získal [139] .

Viz také

Poznámky

  1. ↑ Biomolekula. Systémy CRISPR: imunizace prokaryot .
  2. ↑ Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J., Wolf Y. I., Yakunin A. F., van der Oost J., Koonin E. V. Evoluce a klasifikace CRISPR- Cas systems  // Recenze přírody. mikrobiologie. - 2011. - Sv. 9, č. 6. - S. 467-477. - doi : 10.1038/nrmicro2577 . — PMID 21552286 .
  3. ↑ Panchin, Alexander. Homo sapiens: práce na chybách // Popular Mechanics  : journal. - 2016. - Květen. - S. 38-41.
  4. ↑ Angličtina, Max A. Programovatelné inteligentní materiály reagující na CRISPR: [ eng. ]  / Max A. English, Luis R. Soenksen, Raphael V. Gayet … [ et al. ] // Věda : J. - 2019. - Sv. 365, č.p. 6455 (23. srpna). - S. 780-785. - doi : 10.1126/science.aaw5122 . — PMID 31439791 .
  5. ↑ Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M., Nakata A.  Nukleotidová sekvence genu iap , zodpovědná za konverzi izozymu alkalické fosfatázy v Escherichia coli a identifikace produktu genu  // Journal of Bacteriology. - 1987. - Sv. 169, č.p. 12. - S. 5429-5433. — PMID 3316184 .
  6. ↑ 1 2 3 Lander E. S. The Heroes of CRISPR  // Cell. - 2016. - Sv. 164, č.p. 1-2. - S. 18-28. - doi : 10.1016/j.cell.2015.12.041 . — PMID 26771483 .
  7. ↑ Jansen R., Embden J. D., Gaastra W., Schouls L. M.  Identifikace genů, které jsou spojeny s repeticemi DNA u prokaryot  // Molecular Microbiology. - 2002. - Sv. 43, č.p. 6. - S. 1565-1575. — PMID 11952905 .
  8. ↑ Mojica F. J., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E.  Intervenující sekvence pravidelně rozmístěných prokaryotických repetic pocházejí z cizích genetických elementů  // Journal of Molecular Evolution. - 2005. - Sv. 60, č. 2. - S. 174-182. - doi : 10.1007/s00239-004-0046-3 . — PMID 15791728 .
  9. ↑ Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G.  Prvky CRISPR v Yersinia pestis získávají nové repetice preferenčním vychytáváním bakteriofágové DNA a poskytují další nástroje pro evoluční studie  // Mikrobiologie. - 2005. - Sv. 151, pt. 3. - S. 653-663. - doi : 10,1099/mic.0,27437-0 . — PMID 15758212 .
  10. ↑ Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S. D.  Clustered regular interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) mají spacery extrachromozomálního původu  // Microbiology. - 2005. - Sv. 151, pt. 8. - S. 2551-2561. - doi : 10,1099/mic.0,28048-0 . — PMID 16079334 .
  11. ↑ Makarova K. S., Grishin N. V., Shabalina S. A., Wolf Y. I., Koonin E. V.  Předpokládaný imunitní systém založený na RNA u prokaryot: výpočetní analýza předpokládaného enzymatického aparátu, funkční analogie s eukaryotickou RNAi a hypotetické mechanismy  přímého působení // Biologie . - 2006. - Sv. 1, č. 1. - S. 7. - doi : 10.1186/1745-6150-1-7 . — PMID 16545108 .
  12. ↑ Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D. A., Horvath P.  CRISPR poskytuje získanou rezistenci proti virům u prokaryot  // Science. - 2007. - Sv. 315, č.p. 5819. - S. 1709-1712. - doi : 10.1126/science.1138140 . — PMID 17379808 .
  13. ↑ Vědec společnosti DuPont Philippe Horvath oceněn Massryho cenou 2015 .
  14. Related _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  _  _ Genová terapie. - 2015. - Sv. 26, č. 7. - S. 413-424. - doi : 10.1089/hum.2015.091 . — PMID 26078042 .
  15. ↑ 1 2 3 4 Liang Puping, Xu Yanwen, Zhang Xiya, Ding Chenhui, Huang Rui, Zhang Zhen, Lv Jie, Xie Xiaowei, Chen Yuxi, Li Yujing, Sun Ying, Bai Yaofu, Songyang Zhou, Ma Wenbin, Zhou Canquan, Huang Junjiu.  Editace genů zprostředkovaná CRISPR/Cas9 u lidských tripronukleárních zygot  // Protein & Cell. - 2015. - Sv. 6, č. 5. - S. 363-372. - doi : 10.1007/s13238-015-0153-5 . — PMID 25894090 .
  16. ↑ Reardon Sara. Summit pro úpravu genů podporuje určitý výzkum lidských embryí  // Příroda. - 2015. - 3. prosince. — ISSN 1476-4687 . - doi : 10.1038/příroda.2015.18947 .
  17. ↑ 1 2 Slaymaker I. M., Gao Linyi, Zetsche B., Scott D. A., Yan W. X., Zhang Feng.  Racionálně navržené Cas9 nukleázy se zlepšenou specificitou  // Science. - 2016. - Sv. 351, č.p. 6268, str. 84-88. - doi : 10.1126/science.aad5227 . — PMID 26628643 .
  18. ↑ Severinov, K. Gene Editing for Dummies  : Jak objev Jennifer Doudnové a Emmanuelle Charpentier změnil biologii a získal jim Nobelovu cenu: [ arch. 10. října 2020 ] // Forbes. - 2020. - 7. října.
  19. ↑ 12 Naimark , 2021 .
  20. ↑ Kapitonov et al., 2016 .
  21. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Barrangou R.  Role systémů CRISPR-Cas v adaptivní imunitě a mimo ni  // Current Opinion in Immunology. - 2015. - Sv. 32. - S. 36-41. - doi : 10.1016/j.coi.2014.12.008 . — PMID 25574773 .
  22. ↑ 1 2 Nemudry A. A., Valetdinova K. R., Medveděv S. P., Zakian S. M.  TALEN a systémy pro úpravu genomu CRISPR/Cas jsou nástroje pro objevování  // Acta Naturae . - 2014. - č. 3 (22) . - S. 20-42 .
  23. ↑ Jiang Wenyan, Maniv I., Arain F., Wang Yaying, Levin B. R., Marraffini L. A.  Dealing with the Evolutionary Downside of CRISPR Immunity: Bacteria and Beneficial Plasmids  // PLoS Genetics. - 2013. - Sv. 9, č. 9. - P. e1003844. - doi : 10.1371/journal.pgen.1003844 . — PMID 24086164 .
  24. ↑ 1 2 Samson J. E., Magadan A. H., Moineau S. . Imunitní systém CRISPR-Cas a genetické přenosy: dosažení rovnováhy // Plasmidy: Biologie a dopad v biotechnologii a objevech / Ed. od M. E. Tolmasky, J. C. Alonso. - Washington: ASM Press, 2015. - 718 s. - ISBN 978-1-5558-1897-5 .  - S. 209-218. - doi : 10.1128/microbiolspec.PLAS-0034-2014 . — PMID 26104549 .
  25. ↑ Marraffini L. A.  CRISPR-Cas imunita u prokaryot  // Příroda . - 2015. - Sv. 526, č.p. 7571. - S. 55-61. - doi : 10.1038/příroda15386 . — PMID 26432244 .
  26. ^ van Houte S. , Ekroth AK , Broniewski JM , Chabas H. , Ben Ashby , Bondy-Denomy J. , Gandon S. , Boots M. , Paterson S. , Buckling A. , Westra ER Výhody generující rozmanitost prokaryotický adaptivní imunitní systém.  (anglicky)  // Nature. - 2016. - doi : 10.1038/příroda17436 . — PMID 27074511 .
  27. ↑ 1 2 3 Barrangou R.  Diverzita imunitních systémů a molekulárních strojů CRISPR-Cas  // Genome Biology. - 2015. - Sv. 16. - S. 247-257. - doi : 10.1186/s13059-015-0816-9 . — PMID 26549499 .
  28. ↑ 1 2 Makarova K. S., Koonin E. V.  Anotace a klasifikace systémů CRISPR-Cas  // Methods in Molecular Biology. - 2015. - Sv. 1311. - S. 47-75. - doi : 10.1007/978-1-4939-2687-9_4 . — PMID 25981466 .
  29. ↑ Minina E. Jak přeměnit glii na neurony v živém organismu  : [ arch. 18. května 2020 ] / Elizaveta Minina // Neuronovity. - 2020. - 15. května.
  30. ↑ Zhou, H. Konverze glia na neurony pomocí CRISPR-CasRx zmírňuje příznaky neurologického onemocnění u myší: [ eng. ]  / H. Zhou, J. Su, X. Hu … [ et al. ] // Buňka : log. - 2020. - Sv. 181, č.p. 3 (30. dubna). — S. 590–603.e16. - doi : 10.1016/j.cell.2020.03.024 . — PMID 32272060 .
  31. ↑ Zetsche B. a kol. Cpf1 je jediná endonukleáza řízená RNA  systému CRISPR-Cas 2. třídy  // Cell . - Cell Press , 2015. - Vol. 163 , č.p. 3 . - str. 759-771 .
  32. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Makarova K. S., Wolf Y. I., Alkhnbashi O. S., Costa F., Shah S. A., Saunders S. J., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Haft D. H., Horvath S., Moineau F. J., Terns R. M., Terns M. P., White M. F., Yakunin A. F., Garrett R. A., van der Oost J., Backofen R., Koonin E. V.  Aktualizovaná evoluční klasifikace systémů CRISPR-Cas  // Recenze přírody. mikrobiologie. - 2015. - Sv. 13, č. 11. - S. 722-736. - doi : 10.1038/nrmicro3569 . — PMID 26411297 .
  33. ↑ UniProtKB - Q53VY1 (CSE1_THET8) .
  34. ↑ Cady K. C., O'Toole G. A.  Interakce CRISPR-bakteriofága zprostředkovaná bez identity zprostředkovaná proteiny Csy a Cas3  // Journal of Bacteriology. - 2011. - Sv. 193, č.p. 14. - S. 3433-3445. - doi : 10.1128/JB.01411-10 . — PMID 21398535 .
  35. ↑ Cass S. D., Haas K. A., Stoll B., Alkhnbashi O. S., Sharma K., Urlaub H., Backofen R., Marchfelder A., ​​​​Bolt E. L.  Role Cas8 v interferenci CRISPR typu I  // Bioscience Reports. - 2015. - Sv. 35, č. 3. - P. e00197. - doi : 10.1042/BSR20150043 . — PMID 26182359 .
  36. ↑ Silas S., Mohr G., Sidote D. J., Markham L. M., Sanchez-Amat A., Bhaya D., Lambowitz A. M., Fire A. Z.  Přímá akvizice CRISPR spaceru z RNA pomocí přirozeného fúzního proteinu reverzní transkriptázy-Cas1  // Science . - 2016. - Sv. 351, č.p. 6276. - S. 4234. - doi : 10.1126/science.aad4234 . — PMID 26917774 .
  37. ↑ Niewoehner O. et al., & Jinek M/ (2017). Systémy typu III CRISPR-Cas produkují cyklické oligoadenylátové druhé posly . Příroda doi : 10.1038/příroda23467
  38. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Westra E. R., Buckling A., Fineran P. C.  Systémy CRISPR-Cas: za adaptivní imunitou  // Nature Reviews. mikrobiologie. - 2014. - Sv. 12, č. 5. - S. 317-326. - doi : 10.1038/nrmicro3241 . — PMID 24704746 .
  39. ↑ Seed K. D., Lazinski D. W., Calderwood S. B., Camilli A.  Abakteriofág kóduje svou vlastní adaptivní odpověď CRISPR/Cas, aby se vyhnul vrozené imunitě hostitele  // Nature . - 2013. - Sv. 494, č.p. 7438, str. 489-491. - doi : 10.1038/příroda11927 . — PMID 23446421 .
  40. ↑ Levasseur A. , ​​Bekliz M. , Chabrière E. , Pontarotti P. , La Scola B. , Raoult D.  MIMIVIRE je obranný systém v mimiviru, který propůjčuje odolnost vůči virofágům  // Nature. - 2016. - Sv. 531, č.p. 7593. - S. 249-252. - doi : 10.1038/příroda17146 . — PMID 26934229 .
  41. ↑ 1 2 van der Oost J., Brouns S. J.  CRISPR sabotáž  // Genome Biology. - 2015. - Sv. 16. - S. 248. - doi : 10.1186/s13059-015-0820-0 . — PMID 26553202 .
  42. ↑ Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S., Du Mingjian, Rollins M. F., Hidalgo-Reyes Y., Wiedenheft B., Maxwell K. L., Davidson A. R.  Mnohočetné mechanismy inhibice CRISPR-Cas proteiny anti-CRISPR  // příroda . - 2015. - Sv. 526, č.p. 7571. - S. 136-139. - doi : 10.1038/příroda15254 . — PMID 26416740 .
  43. ↑ 1 2 Weiss A.  Lamarckian Illusions  // Trends in Ecology & Evolution. - 2015. - Sv. 30, č. 10. - S. 566-568. - doi : 10.1016/j.tree.2015.08.003 . — PMID 26411613 .
  44. ↑ Kunin E. V. . logika případu. O podstatě a původu biologické evoluce. - M. : Tsentrpoligraf, 2014. - 527 s. - ISBN 978-5-227-04982-7 .  - S. 311.
  45. ↑ Chylinski K., Makarova K. S., Charpentier E., Koonin E. V.  Klasifikace a evoluce systémů CRISPR-Cas typu II  // Nucleic Acids Research. - 2014. - Sv. 42, č. 10. - S. 6091-6105. - doi : 10.1093/nar/gku241 . — PMID 24728998 .
  46. ↑ Bland C., Ramsey T. L., Sabree F., Lowe M., Brown K., Kyrpides N. C., Hugenholtz P.  Nástroj pro rozpoznávání CRISPR (CRT): nástroj pro automatickou detekci seskupených pravidelně interspaced palindromických repetic  // BMC Bioinformatics. - 2007. - Sv. 8. - S. 209. - doi : 10.1186/1471-2105-8-209 . — PMID 17577412 .
  47. ↑ Edgar R. C.  PILER-CR: rychlá a přesná identifikace opakování CRISPR  // BMC Bioinformatics. - 2007. - Sv. 8. - S. 18. - doi : 10.1186/1471-2105-8-18 . — PMID 17239253 .
  48. ↑ Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C.  CRISPRFinder: webový nástroj k identifikaci seskupených pravidelně rozložených krátkých palindromických repetic  // Výzkum nukleových kyselin. - 2007. - Sv. 35. - S. 52-57. - doi : 10,1093/nar/gkm360 . — PMID 17537822 .
  49. ↑ Horvath P., Romero D. A., Coûté-Monvoisin A. C., Richards M., Deveau H., Moineau S., Boyaval P., Fremaux C., Barrangou R.  Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus  // Journal of Bacteriology. - 2008. - Sv. 190, č.p. 4. - S. 1401-1412. - doi : 10.1128/JB.01415-07 . — PMID 18065539 .
  50. ↑ Pride D. T., Sun C. L., Salzman J., Rao N., Loomer P., Armitage G. C., Banfield J. F., Relman D. A.  Analýza streptokokových CRISPR z lidských slin odhaluje podstatnou sekvenční rozmanitost v rámci a mezi subjekty v průběhu času  // Genome Research. - 2011. - Sv. 21, č. 1. - S. 126-136. - doi : 10.1101/gr.111732.110 . — PMID 21149389 .
  51. ↑ Pride D. T., Salzman J., Relman D. A.  Porovnání seskupených pravidelně rozložených krátkých palindromických repetic a viromů v lidských slinách odhaluje bakteriální adaptace na slinné viry  // Environmental Microbiology. - 2012. - Sv. 14, č. 9. - S. 2564-2576. - doi : 10.1111/j.1462-2920.2012.02775.x . — PMID 22583485 .
  52. ↑ Held N. L., Herrera A., Whitaker R. J.  Reasortment of CRISPR repeat-spacer loci in Sulfolobus islandicus  // Environmental Microbiology. - 2013. - Sv. 15, č. 11. - S. 3065-3076. - doi : 10.1111/1462-2920.12146 . — PMID 23701169 .
  53. ↑ Held N. L., Herrera A., Cadillo-Quiroz H., Whitaker R. J.  CRISPR asociovaná diverzita v rámci populace Sulfolobus islandicus  // PLoS One . - 2010. - Sv. 5, č. 9. - P. e12988. - doi : 10.1371/journal.pone.0012988 . — PMID 20927396 .
  54. ↑ 1 2 3 4 Vlasov V. V. , Medveděv S. P., Zakian S. M.  „Editoři“ genomů. Od zinkových prstů po CRISPR  // Věda z první ruky. - 2014. - č. 2 (56) . - S. 44-53 .
  55. ↑ 1 2 Ran F. A., Hsu P. D., Wright J., Agarwala V., Scott D. A., Zhang F.  Genomové inženýrství pomocí systému CRISPR-Cas9  // Nature Protocols. - 2013. - Sv. 8, č. 11. - S. 2281-2308. - doi : 10.1038/nprot.2013.143 . — PMID 24157548 .
  56. ↑ 1 2 Peters J. M., Silvis M. R., Zhao Dehua, Hawkins J. S., Gross C. A., Qi L. S.  Bakteriální CRISPR: úspěchy a vyhlídky  // Aktuální názor v mikrobiologii. - 2015. - Sv. 27. - S. 121-126. - doi : 10.1016/j.mib.2015.08.007 . — PMID 26363124 .
  57. ↑ Shinmyo Y., Tanaka S., Tsunoda S., Hosomichi K., Tajima A., Kawasaki H.  CRISPR/Cas9-zprostředkovaný genový knockout v mozku myši pomocí elektroporace in utero  // Vědecké zprávy. - 2016. - Sv. 6. - S. 20611. - doi : 10.1038/srep20611 . — PMID 26857612 .
  58. ↑ Sun W. , Ji W. , Hall JM , Hu Q. , Wang C. , Beisel CL , Gu Z. Samostatně sestavené nanoclews DNA pro efektivní dodání CRISPR-Cas9 pro editaci genomu.  (anglicky)  // Angewandte Chemie (mezinárodní vyd. v angličtině). - 2015. - Sv. 54, č.p. 41 . - S. 12029-12033. - doi : 10.1002/anie.201506030 . — PMID 26310292 .
  59. ↑ Hou Zhonggang, Zhang Yan, Propson N. E., Howden S. E., Chu Li-Fang, Sontheimer E. J., Thomson J. A.  Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis  // Proc. Nat. Akad. sci. USA . - 2013. - Sv. 110, č.p. 39. - S. 15644-15649. - doi : 10.1073/pnas.1313587110 . — PMID 23940360 .
  60. ↑ Fonfara I., Le Rhun A., Chylinski K., Makarova K. S., Lécrivain A. L., Bzdrenga J., Koonin E. V., Charpentier E.  Phylogeny of Cas9 určuje funkční zaměnitelnost dual-RNA a Cas9 mezi ortologními systémy CRISPR-Cas typu II  // Výzkum nukleových kyselin. - 2014. - Sv. 42, č. 4. - S. 2577-2590. - doi : 10.1093/nar/gkt1074 . — PMID 24270795 .
  61. ↑ Ran F. A., Cong Le, Yan W. X., Scott D. A., Gootenberg J. S., Kriz A. J., Zetsche B., Shalem O., Wu Xuebing, Makarova K. S., Koonin E. V., Sharp P. A., Zhang Feng.  Úprava genomu in vivo pomocí Staphylococcus aureus Cas9  // Nature . - 2015. - Sv. 520, č.p. 7546. - S. 186-191. - doi : 10.1038/příroda14299 . — PMID 25830891 .
  62. ↑ Deng Wulan, Shi Xinghua, Tjian R., Lionnet T., Singer R. H.  CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells  // Proc. Nat. Akad. sci. USA . - 2015. - Sv. 112, č.p. 38. - S. 11870-11875. - doi : 10.1073/pnas.1515692112 . — PMID 26324940 .
  63. ↑ Chen Baohui, Gilbert L. A., Cimini B. A., Schnitzbauer J., Zhang Wei, Li Gene-Wei., Park J., Blackburn E. H., Weissman J. S., Qi L. S., Huang Bo.  Dynamické zobrazování genomových lokusů v živých lidských buňkách optimalizovaným systémem CRISPR/Cas  // Cell. - 2013. - Sv. 155, č.p. 7. - S. 1479-1491. - doi : 10.1016/j.cell.2013.12.001 . — PMID 24360272 .
  64. ↑ Kearns N. A., Genga R. M. J., Enuameh M. S., Garber M., Wolfe S. A., Maehr R.  Cas9 efektorem zprostředkovaná regulace transkripce a diferenciace v lidských pluripotentních kmenových buňkách  // Vývoj (Cambridge, Anglie). - 2014. - Sv. 141, č.p. 1. - S. 219-223. - doi : 10.1242/dev.103341 . — PMID 24346702 .
  65. ↑ Gilbert L. A., Larson M. H., Morsut L., Liu Zairan, Brar G. A., Torres S. E., Stern-Ginossar N., Brandman O., Whitehead E. H., Doudna J. A., Lim W. A., Weissman J. S., modul CRISPR  - L. S. řízená regulace transkripce u eukaryot  // Buň. - 2013. - Sv. 154, č.p. 2. - S. 442-451. - doi : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . — PMID 23849981 .
  66. ↑ Perez-Pinera P., Kocak D. D., Vockley C. M., Adler A. F., Kabadi A. M., Polstein L. R., Thakore P. I., Glass K. A., Ousterout D. G., Leong K. W., Guilak F., Crawford G. E. E., Gene Reddy  T. aktivace transkripčními faktory na bázi CRISPR-Cas9  // Nature Methods. - 2013. - Sv. 10, č. 10. - S. 973-976. - doi : 10,1038/nmeth.2600 . — PMID 23892895 .
  67. ↑ Hilton I. B., D'Ippolito A. M., Vockley C. M., Thakore P. I., Crawford G. E., Reddy T. E., Gersbach C. A.  Editace epigenomu acetyltransferázou na bázi CRISPR-Cas9 aktivuje geny z promotorů a zesilovačů  // Nature Biotechnology. - 2015. - Sv. 33, č. 5. - S. 510-517. - doi : 10.1038/nbt.3199 . — PMID 25849900 .
  68. ↑ Wei Shu, Zou Qingjian, Lai Sisi, Zhang Quanjun, Li Li, Yan Quanmei, Zhou Xiaoqing, Zhong Huilin, Lai Liangxue. Přeměna embryonálních kmenových buněk na extraembryonální linie aktivátory zprostředkovanými CRISPR  // Scientific Reports. - 2016. - Sv. 6. - S. 19648. - doi : 10.1038/srep19648 . — PMID 26782778 .
  69. ↑ Tsai S. Q., Wyvekens N., Khayter C., Foden J. A., Thapar V., Reyon D., Goodwin M. J., Aryee M. J., Joung J. K. Dimeric CRISPR  RNA-guided FokI nucleases for vysoce specifickou editaci genomu  // Nature Biotechnology. - 2014. - Sv. 32, č. 6. - S. 569-576. - doi : 10.1038/nbt.2908 . — PMID 24770325 .
  70. ↑ Fujita T., Fujii H.  Efektivní izolace specifických genomových oblastí a identifikace asociovaných proteinů inženýrskou DNA-vazebnou molekulou zprostředkovanou imunoprecipitací chromatinu (enChIP) pomocí CRISPR  // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2013. - Sv. 439, č.p. 1. - S. 132-136. - doi : 10.1016/j.bbrc.2013.08.013 . — PMID 23942116 .
  71. ↑ O'Connell M. R., Oakes B. L., Sternberg S. H., East-Seletsky A., Kaplan M., Doudna J. A.  Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9  // Nature . - 2014. - Sv. 516, č.p. 7530. - S. 263-266. - doi : 10.1038/příroda13769 . — PMID 25274302 .
  72. ↑ Hale C. R., Zhao Peng, Olson S., Duff M. O., Graveley B. R., Wells L., Terns R. M., Terns M. P.  RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex  // Cell. - 2009. - Sv. 139, č.p. 5. - S. 945-956. - doi : 10.1016/j.cell.2009.07.040 . — PMID 19945378 .
  73. ↑ Price A. A., Sampson T. R., Ratner H. K., Grakoui A., Weiss D. S.  Cas9-mediated targeting of viral RNA in eukaryotic cells  // Proc. Nat. Akad. sci. USA . - 2015. - Sv. 112, č.p. 19. - S. 6164-6169. - doi : 10.1073/pnas.1422340112 . — PMID 25918406 .
  74. ↑ Fagerlund R. D., Staals R. H. J., Fineran P. C.  Protein Cpf1 CRISPR-Cas rozšiřuje nástroje pro úpravu  genomu // Genome Biology. - 2015. - Sv. 16. - S. 251. - doi : 10.1186/s13059-015-0824-9 . — PMID 26578176 .
  75. ↑ Arbab M., Srinivasan S., Hashimoto T., Geijsen N., Sherwood R. I. CRISPR  bez klonování  // Stem Cell Reports. - 2015. - Sv. 5, č. 5. - S. 908-917. - doi : 10.1016/j.stemcr.2015.09.022 . — PMID 26527385 .
  76. ↑ Maji B. , Moore CL , Zetsche B. , Volz SE , Zhang F. , Shoulders MD , Choudhary A. Vícerozměrná chemická kontrola CRISPR-Cas9.  (anglicky)  // Chemická biologie přírody. - 2016. - doi : 10.1038/nchembio.2224 . — PMID 27820801 .
  77. ↑ Hilton IB , Gersbach CA Genetické inženýrství: Chemická kontrola pro úpravy CRISPR.  (anglicky)  // Chemická biologie přírody. - 2016. - doi : 10.1038/nchembio.2243 . — PMID 27820804 .
  78. ↑ Wilkinson R., Wiedenheft B.  Metoda CRISPR pro genomové inženýrství  // F1000 Prime Reports. - 2014. - Sv. 6. - S. 3. - doi : 10.12703/P6-3 . — PMID 24592315 .
  79. ↑ Jakočiūnas T., Jensen M. K., Keasling J. D.  CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factory  // Metabolic Engineering. - 2016. - Sv. 34. - S. 44-59. - doi : 10.1016/j.ymben.2015.12.003 . — PMID 26707540 .
  80. ↑ Williams A., Henao-Mejia J., Flavell R. A.  Úprava myšího genomu pomocí systému CRISPR-Cas9  // Cold Spring Harbor Protocols. - 2016. - Sv. 2016, č. 2. - S. 087536. - doi : 10.1101/pdb.top087536 . — PMID 26832693 .
  81. ↑ Ghosh S., Tibbit C., Liu Ji-Long.  Efektivní knockdown dlouhých nekódujících RNA Drosophila pomocí CRISPR interference  // Nucleic Acids Research. - 2016. - doi : 10.1093/nar/gkw063 . — PMID 26850642 .
  82. ↑ Schwartz M. L., Jorgensen E. M.  SapTrap, sada nástrojů pro vysoce výkonnou modifikaci genu CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans  // Genetika. - 2016. - Sv. 202, č.p. 4. - S. 1277-1288. - doi : 10.1534/genetika.115.184275 . — PMID 26837755 .
  83. ↑ Li M. , Zhao L. , Page-McCaw PS , Chen W. Genomové inženýrství zebrafish pomocí systému CRISPR-Cas9.  (angl.)  // Trendy v genetice : TIG. - 2016. - doi : 10.1016/j.tig.2016.10.005 . — PMID 27836208 .
  84. ↑ Krappmann S. CRISPR -Cas9, nový kluk na bloku molekulární biologie hub.  (anglicky)  // Lékařská mykologie. - 2016. - doi : 10.1093/mmy/myw097 . — PMID 27811178 .
  85. ↑ Katayama T., Tanaka Y., Okabe T., Nakamura H., Fujii W., Kitamoto K., Maruyama J. I.  Vývoj techniky úpravy genomu pomocí systému CRISPR/Cas9 u průmyslové vláknité houby Aspergillus oryzae  // Biotechnology Letters . - 2015. - Sv. 38, č.p. 4. - S. 637-642. - doi : 10.1007/s10529-015-2015-x . — PMID 26687199 .
  86. ↑ Steven Hall Editing the Mushroom // In the World of Science . - 2016. - č. 12. - S. 85-93.
  87. ↑ Gaj T. , Schaffer DV Adeno-Associated Virus-mediated Delivery of CRISPR-Cas Systems for Genome Engineering in savčích buněk.  (anglicky)  // Protokoly Cold Spring Harbor. - 2016. - Sv. 2016, č. 11 . - S. 086868. - doi : 10.1101/pdb.prot086868 . — PMID 27803249 .
  88. ↑ Kirill Stasevich. Od genetického inženýrství k lásce: co biologové dokázali v roce 2017  // Věda a život . - 2018. - č. 1 . - S. 2-7 .
  89. ↑ Wang Zhongde.  Genomové inženýrství u skotu: nedávné technologické pokroky  // Chromosome Research: mezinárodní časopis o molekulárních, supramolekulárních a evolučních aspektech biologie chromozomů. - 2015. - Sv. 23, č. 1. - S. 17-29. - doi : 10.1007/s10577-014-9452-6 . — PMID 25596824 .
  90. ↑ Niemann H., Petersen B.  Produkce multitransgenních prasat: aktualizace a perspektivy xenotransplantace  // Transgenní výzkum. - 2016. - S. 1-14. - doi : 10.1007/s11248-016-9934-8 . — PMID 26820415 .
  91. ↑ Kohno H. , Suenami S. , Takeuchi H. , Sasaki T. , Kubo T. Produkce knockout mutantů pomocí CRISPR/Cas9 v evropské včele medonosné, Apis mellifera L.  //  Zoologická věda. - 2016. - Sv. 33, č. 5 . - S. 505-512. - doi : 10.2108/zs160043 . — PMID 27715425 .
  92. ↑ Yang Luhan, Güell M., Niu Dong, George H., Lesha E., Grishin D., Aach J., Shrock E., Xu Weihong, Poci J., Cortazio R., Wilkinson R. A., Fishman J. A., Church G .Celogenomová  inaktivace prasečích endogenních retrovirů (PERV)  // Science . - 2015. - Sv. 350, č.p. 6264. - S. 1101-1104. - doi : 10.1126/science.aad1191 . — PMID 26456528 .
  93. ↑ Li Fang, Scott M. J.  CRISPR/Cas9-zprostředkovaná mutageneze bílých a pohlavně letálních lokusů u invazivního škůdce Drosophila suzukii  // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2016. - Sv. 469, č.p. 4. - S. 911-916. - doi : 10.1016/j.bbrc.2015.12.081 . — PMID 26721433 .
  94. ↑ Schiml S., Puchta H.  Revoluční rostlinná biologie: více způsobů genomového inženýrství pomocí CRISPR/Cas  // Plant Methods. - 2016. - Sv. 12. - S. 8. - doi : 10.1186/s13007-016-0103-0 . — PMID 26823677 .
  95. ↑ Zhang Bin, Yang Xia, Yang Chunping, Li Mingyang, Guo Yulong.  Využití systému CRISPR/Cas9 pro cílenou genomovou mutagenezi u Petúnie  // Vědecké zprávy. - 2016. - Sv. 6. - S. 20315. - doi : 10.1038/srep20315 . — PMID 26837606 .
  96. ↑ Ikeda T., Tanaka W., Mikami M., Endo M., Hirano H.-Y.  Generování umělých mutantů visících listů technologií CRISPR-Cas9 v rýži  // Genes & Genetic Systems. - 2016. - Sv. 90, č. 4. - S. 231-235. - doi : 10.1266/ggs.15-00030 . — PMID 26617267 .
  97. ↑ Du Hongyang, Zeng Xuanrui, Zhao Meng, Cui Xiaopei, Wang Qing, Yang Hui, Cheng Hao, Yu Deyue.  Účinná cílená mutageneze v sójových bobech pomocí TALEN a CRISPR/Cas9  // Journal of Biotechnology. - 2016. - Sv. 217. - S. 90-97. - doi : 10.1016/j.jbiotec.2015.11.005 . — PMID 26603121 .
  98. ↑ Ito Y., Nishizawa-Yokoi A., Endo M., Mikami M., Toki S.  CRISPR/Cas9-zprostředkovaná mutageneze lokusu RIN , která omezuje dozrávání plodů rajčat  // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2015. - Sv. 467, č.p. 1. - S. 76-82. - doi : 10.1016/j.bbrc.2015.09.117 . — PMID 26408904 .
  99. ↑ Belhaj K., Chaparro-Garcia A., Kamoun S., Patron N. J., Nekrasov V.  Editace rostlinných genomů pomocí CRISPR/Cas9  // Current Opinion in Biotechnology. - 2015. - Sv. 32. - S. 76-84. - doi : 10.1016/j.copbio.2014.11.007 . — PMID 25437637 .
  100. ↑ Ali Z., Abulfaraj A., Idris A., Ali S., Tashkandi M., Mahfouz M. M.  CRISPR/Cas9-zprostředkovaná virová interference v rostlinách  // Genome Biology. - 2015. - Sv. 16. - S. 238. - doi : 10.1186/s13059-015-0799-6 . — PMID 26556628 .
  101. ↑ Zaidi SS , Tashkandi M. , Mansoor S. , Mahfouz MM Engineering Plant Immunity: Použití CRISPR/Cas9 ke generování virové rezistence.  (anglicky)  // Hranice ve vědě o rostlinách. - 2016. - Sv. 7. - S. 1673. - doi : 10.3389/fpls.2016.01673 . — PMID 27877187 .
  102. ↑ Xu R. , Qin R. , Li H. , Li D. , Li L. , Wei P. , Yang J. Generování cílené mutantní rýže pomocí systému CRISPR-Cpf1.  (anglicky)  // Plant biotechnology journal. - 2016. - doi : 10.1111/pbi.12669 . — PMID 27875019 .
  103. ↑ Watters KE , Kirkpatrick J. , Palmer MJ , Koblentz GD Revoluce CRISPR a její potenciální dopad na globální zdravotní bezpečnost.  (anglicky)  // Patogeny a globální zdraví. - 2021. - 16. února. - str. 1-13 . - doi : 10.1080/20477724.2021.1880202 . — PMID 33590814 .
  104. ↑ Han Yinglun, Li Qingwei.  Postup aplikace technologie úpravy genomu CRISPR/Cas9 při léčbě infekce HIV-1  // Yi Chuan. - 2016. - Sv. 38, č.p. 1. - S. 9-16. - doi : 10.16288/j.yczz.15-284 . — PMID 26787519 .
  105. ↑ Harper KN Nový výzkum o použití CRISPR/Cas9 k léčbě HIV.  (anglicky)  // AIDS (Londýn, Anglie). - 2016. - doi : 10.1097/QAD.0000000000001294 . — PMID 27755113 .
  106. ↑ van Diemen FR , Lebbink RJ CRISPR/Cas9, výkonný nástroj pro cílení na lidské herpesviry.  (anglicky)  // Buněčná mikrobiologie. - 2016. - doi : 10.1111/cmi.12694 . — PMID 27860066 .
  107. ↑ Borges TJ , Murakami N. , Riella LV Aktuální stav aloimunity.  (anglicky)  // Současný názor v nefrologii a hypertenzi. - 2016. - Sv. 25, č. 6 . - S. 556-562. - doi : 10.1097/MNH.0000000000000267 . — PMID 27584931 .
  108. ↑ Goodman MA , Moradi Manesh D. , Malik P. , Rothenberg ME CRISPR/Cas9 u alergických a imunologických onemocnění.  (anglicky)  // Odborný posudek klinické imunologie. - 2016. - S. 1-5. - doi : 10.1080/1744666X.2017.1241711 . — PMID 27687572 .
  109. ↑ Chen Sidi, Sanjana N. E., Zheng Kaijie, Shalem O., Lee Kyungheon, Shi Xi, Scott D. A., Song Jun, Pan J. Q., Weissleder R., Lee Hakho, Zhang Feng, Sharp P. A.  Genomová obrazovka CRISPR v modelu myši nádorového růstu a metastáz  // Buň. - 2015. - Sv. 160, č.p. 6. - S. 1246-1260. - doi : 10.1016/j.cell.2015.02.038 . — PMID 25748654 .
  110. ↑ Liu Tang, Shen J. K., Li Zhihong, Choy E., Hornicek F. J., Duan Zhenfeng.  Vývoj a potenciální aplikace technologie úpravy genomu CRISPR-Cas9 u sarkomu  // Cancer Letters. - 2016. - Sv. 373, č.p. 1. - S. 109-118. - doi : 10.1016/j.canlet.2016.01.030 . — PMID 26806808 .
  111. ↑ Wang Dayong, Ma Ning, Hui Yang, Gao Xu.  Aplikace technologie úpravy genomu CRISPR/Cas9 ve výzkumu rakoviny  // Yi Chuan. - 2016. - Sv. 38, č.p. 1. - S. 1-8. - doi : 10.16288/j.yczz.15-252 . — PMID 26787518 .
  112. ↑ Li Y. , Song YH , Liu B. , Yu XY Potenciální aplikace a výzva výkonného systému CRISPR/Cas9 v kardiovaskulárním výzkumu.  (anglicky)  // International journal of cardiology. - 2016. - doi : 10.1016/j.ijcard.2016.11.177 . — PMID 27847153 .
  113. ↑ Duroux-Richard I. , Giovannangeli C. , Apparailly F. CRISPR-Cas9: Revoluce v editaci genomu u revmatických onemocnění.  (anglicky)  // Klouby, kosti, páteř: revue du rhumatisme. - 2016. - doi : 10.1016/j.jbspin.2016.09.012 . — PMID 27825565 .
  114. ↑ Wojtal D., Kemaladewi D. U., Malam Z., Abdullah S., Wong T. W. Y., Hyatt E., Baghestani Z., Pereira S., Stavropoulos J., Mouly V., Mamchaoui K., Muntoni F., Voit T. , Gonorazky H. D., Dowling J. J., Wilson M. D., Mendoza-Londono R., Ivakine E. A., Cohn R. D. Spell Checking Nature: Versatility of CRISPR/Cas9 pro vývoj léčby dědičných poruch  // American Journal of Human Genetics. - 2016. - Sv. 98, č.p. 1. - S. 90-101. - doi : 10.1016/j.ajhg.2015.11.012 . — PMID 26686765 .
  115. ↑ Yin Hao, Xue Wen, Chen Sidi, Bogorad R. L., Benedetti E., Grompe M., Koteliansky V., Sharp P. A., Jacks T., Anderson D. G.  Úprava genomu pomocí Cas9 u dospělých myší opravuje mutaci a fenotyp onemocnění  // Příroda biotechnologie. - 2014. - Sv. 32, č. 6. - S. 551-553. - doi : 10.1038/nbt.2884 . — PMID 24681508 .
  116. ↑ Bassuk A. G., Zheng A., Li Yao, Tsang S. H., Mahajan V. B.  Precision Medicine: Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in Patient-Derived Stem Cells  // Vědecké zprávy. - 2016. - Sv. 6. - S. 19969. - doi : 10.1038/srep19969 . — PMID 26814166 .
  117. ↑ Yang Y. , Zhang X. , Yi L. , Hou Z. , Chen J. , Kou X. , Zhao Y. , Wang H. , Sun XF , Jiang C. , Wang Y. , Gao S. Naïve Induced Pluripotent Kmenové buňky generované z β-thalasemických fibroblastů umožňují účinnou genovou korekci pomocí CRISPR/Cas9.  (anglicky)  // Translační medicína kmenových buněk. - 2016. - Sv. 5, č. 1 . - S. 8-19. - doi : 10.5966/sctm.2015-0157 . — PMID 26676643 .
  118. ↑ Schwank G., Koo Bon-Kyoung, Sasselli V., Dekkers J. F., Heo I., Demircan T., Sasaki N., Boymans S., Cuppen E., van der Ent C. K., Nieuwenhuis E. E. S., Beekman J. M., Clevers, H.  Funkční oprava CFTR pomocí CRISPR/Cas9 v organoidech střevních kmenových buněk pacientů s cystickou fibrózou  // Cell Stem Cell. - 2013. - Sv. 13, č. 6. - S. 653-658. - doi : 10.1016/j.stem.2013.11.002 . — PMID 24315439 .
  119. ↑ Maggio I. , Liu J. , Janssen JM , Chen X. , Gonçalves MA Adenovirové vektory kódující multiplexy CRISPR/Cas9 zachraňují syntézu dystrofinu v neselektovaných populacích svalových buněk DMD.  (anglicky)  // Vědecké zprávy. - 2016. - Sv. 6. - S. 37051. - doi : 10.1038/srep37051 . — PMID 27845387 .
  120. ↑ Cyranoski David. Editace genu CRISPR poprvé testována u člověka  // Příroda. - 2016. - 15. listopadu ( roč. 539 , č. 7630 ). - S. 479-479 . — ISSN 0028-0836 . - doi : 10.1038/příroda.2016.20988 .
  121. ↑ McLean K. J., Jacobs-Lorena M.  Genetic Control of Malaria Mosquitoes  // Trends in Parasitology. - 2016. - Sv. 32, č. 3. - S. 174-176. - doi : 10.1016/j.pt.2016.01.002 . — PMID 26809567 .
  122. ↑ Carrasquilla M. , Owusu CK Výhled CRISPR pro apikomplexany.  (anglicky)  // Recenze přírody. mikrobiologie. - 2016. - Sv. 14, č. 11 . - S. 668. - doi : 10.1038/nrmicro.2016.153 . — PMID 27795546 .
  123. ↑ Shen B. , Brown K. , Long S. , Sibley LD Vývoj CRISPR/Cas9 pro efektivní editaci genomu v Toxoplasma gondii.  (anglicky)  // Metody v molekulární biologii (Clifton, NJ). - 2017. - Sv. 1498. - S. 79-103. - doi : 10.1007/978-1-4939-6472-7_6 . — PMID 27709570 .
  124. ↑ Brunger JM , Zutshi A. , Willard VP , Gersbach CA , Guilak F. CRISPR/Cas9 editace indukovaných pluripotentních kmenových buněk pro inženýrství tkání odolných vůči zánětu.  (anglicky)  // Artritida a revmatologie (Hoboken, NJ). - 2016. - doi : 10.1002/art.39982 . — PMID 27813286 .
  125. ↑ Kaczmarczyk L. , Mende Y. , Zevnik B. , Jackson W.S. Manipulace s genovou sekvencí prionového proteinu a úrovněmi exprese pomocí CRISPR/Cas9.  (anglicky)  // Public Library of Science ONE. - 2016. - Sv. 11, č. 4 . — P.e0154604. - doi : 10.1371/journal.pone.0154604 . — PMID 27128441 .
  126. ↑ Freedman B. S., Brooks C. R., Lam A. Q., Fu Hongxia, Morizane R., Agrawal V., Saad A. F., Li M. K., Hughes M. R., Werff R. V., Peters D. T., Lu Junjie, Baccei A., Mnu Vallucki, Mnu Valerki A. Musius. K., McNagny K. M., Steinman T. I., Zhou Jing, Lerou P. H., Bonventre J. V.  Modelování onemocnění ledvin pomocí CRISPR-mutantních ledvinových organoidů odvozených z lidských pluripotentních epiblastových sféroidů  // Nature Communications. - 2015. - Sv. 6. - S. 8715. - doi : 10.1038/ncomms9715 . — PMID 26493500 .
  127. ↑ Bellin M., Casini S., Davis R. P., D'Aniello C., Haas J., Ward-van Oostwaard D., Tertoolen L. G. J., Jung C. B., Elliott D. A., Welling A., Laugwitz K.-L., Moretti A., Mummery C. L.  Isogenní páry lidských pluripotentních kmenových buněk odhalují roli mutace KCNH2 v syndromu dlouhého QT  // The EMBO Journal. - 2013. - Sv. 32, č. 24. - S. 3161-3175. - doi : 10.1038/emboj.2013.240 . — PMID 24213244 .
  128. ↑ Antonio Regalado. EXKLUZIVNĚ: Čínští vědci vytvářejí  děti CRISPR . MIT Technology Review. Staženo: 1. února 2019.
  129. ↑ Čínské úřady potvrzují narození geneticky upravených dětí a další těhotenství . Interfax (21. ledna 2019). Staženo: 31. ledna 2019.
  130. ↑ Kolata, Gina . Proč jsou vědci tak rozrušení z prvních miminek Crispr?  (anglicky) , The New York Times  (5. prosince 2018). Staženo 1. února 2019.
  131. ↑ Antonio Regalado. Vytváření dokonalého dítěte . MIT Technology Review (5. března 2015). Staženo: 23. února 2016.
  132. ↑ Baltimore D., Berg P., Botchan M., Carroll D., Charo R. A., Church G., Corn J. E., Daley G. Q., Doudna J. A., Fenner M., Greely H. T., Jinek M., Martin G. S., Penhoet E. , Puck J., Sternberg S. H., Weissman J. S., Yamamoto K. R.  Biotechnology. Prozíravá cesta vpřed pro genomové inženýrství a modifikaci zárodečných genů  // Science . - 2015. - Sv. 348, č.p. 6230. - S. 36-38. - doi : 10.1126/science.aab1028 . — PMID 25791083 .
  133. ↑ Lanphier E. , Urnov F. , Haecker SE , Werner M. , Smolenski J. Neupravujte lidskou zárodečnou linii.  (anglicky)  // Nature. - 2015. - Sv. 519, č.p. 7544 . - S. 410-411. - doi : 10.1038/519410a . — PMID 25810189 .
  134. ↑ Nicholas Wade . Vědci hledají zákaz způsobu úpravy lidského genomu , The New York Times  (19. března 2015). Získáno 20. března 2015.  "Biologové píšící ve Science podporují pokračující laboratorní výzkum s touto technikou a jen málo vědců, pokud vůbec nějací, věří, že je připravena pro klinické použití.".
  135. ↑ Čínští vědci geneticky upravují lidská embrya . Příroda (22. 4. 2015).
  136. ↑ Mezinárodní summit o editaci genů . Národní akademie věd, inženýrství a lékařství (3. prosince 2015). Staženo: 3. prosince 2015.
  137. ↑ James Gallagher . Vědci se pustili do „úpravy genů“ , BBC News , BBC (1. února 2016). Staženo 1. února 2016.
  138. ↑ Maria Cheng . Británie schválila kontroverzní techniku ​​úpravy genů , AP News  (1. února 2016). Staženo 1. února 2016.
  139. ↑ Science News Staff. A průlom roku ve vědě je … . news.sciencemag.org (17. prosince 2015). Staženo: 21. prosince 2015.

Literatura

Odkazy

  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie
V bibliografických katalozích
 Bioinženýrství
Oblasti bioinženýrství
Související články
Vědci
Popularizátory