Plazmidy ( anglicky plasmids ) jsou malé molekuly DNA fyzicky oddělené od chromozomů a schopné autonomní replikace . Plazmidy se nacházejí hlavně v bakteriích , ale také v některých archaeách a eukaryotech (houby a vyšší rostliny). Plazmidy jsou nejčastěji dvouvláknové kruhové molekuly. Navzdory schopnosti reprodukce nejsou plazmidy, stejně jako viry , považovány za živé organismy [1] .
Velikosti plazmidů se pohybují od méně než 1 000 do 400-600 000 párů bází (bp) [2] . Některé plazmidy jsou obsaženy v buňce v množství jedné nebo dvou kopií, jiné - v množství několika desítek. V buňce mohou koexistovat plazmidy různých tříd.
V přírodě plazmidy obvykle obsahují geny , které zvyšují adaptabilitu bakterií na prostředí (například zajišťují odolnost vůči antibiotikům ). Často mohou být přeneseny z jedné bakterie do druhé stejného druhu , rodu , čeledi a dokonce mezi bakteriálními a rostlinnými buňkami , čímž jsou prostředkem horizontálního přenosu genů . Přenos plazmidu do buňky lze provést dvěma způsoby: buď přímým kontaktem hostitelské buňky s jinou buňkou během konjugace , nebo transformací , tedy zachycením exogenní DNA z vnějšího prostředí.
Umělé plazmidy se používají jako vektory při klonování DNA a díky jejich schopnosti replikace je možné replikovat rekombinantní DNA v hostitelské buňce.
Velikost plazmidů je různá. Pokud nejmenší plazmidy obsahují méně než 2 tisíce párů bází, pak tzv. megaplasmidy zahrnují statisíce párů bází (obvykle až 600 tisíc). V tomto případě je již obtížné stanovit jasnou hranici mezi megaplasmidem a minichromozomem . Některé druhy bakterií mohou současně obsahovat mnoho různých plazmidů, takže jejich celkový genetický materiál je větší než u samotné bakterie. Například symbiotická půdní bakterie Sinorhizobium meliloti obsahuje 3 replikony o velikosti 3,65, 1,68 a 1,35 milionu bp. (megabáze), respektive navíc k jejímu vlastnímu chromozomu (6,69 megabází) [3] .
Malé plazmidy, obsažené v buňce ve velkém počtu kopií, se replikují nezávisle na bakteriálním chromozomu, i když existují systémy, které jejich počet řídí. Za určitých podmínek, například když je potlačena syntéza proteinů , se bakteriální chromozom již nemůže duplikovat a plazmidy se aktivně replikují a jejich počet se zvyšuje. Tento jev se využívá při izolaci plazmidové DNA. Megaplazmidy, mezi které patří například F-plazmid , jsou v buňce obsaženy ve formě jedné nebo dvou kopií. Jejich replikace je řízena stejně jako replikace bakteriálního chromozomu a při spuštění duplikace genomové DNA se začne replikovat i megaplazmid [4] .
I když jsou plazmidy ve většině případů autonomní, některé z nich mohou být integrovány do genomové DNA hostitelské bakterie a za určitých podmínek se opět oddělit, někdy i s sebou vzít fragmenty genomové DNA. Takové plazmidy se nazývají epizomy [2] .
Specifické mechanismy replikace plazmidu jsou diskutovány níže.
Většina plazmidů jsou kruhové molekuly, ale je známo mnoho příkladů bakterií s lineárními plazmidy. Vzhledem k tomu, že lineární plazmidy vyžadují mechanismus koncové replikace, který kruhové chromozomy nemají, tyto plazmidy se obvykle nacházejí v bakteriích, které také obsahují lineární chromozomy (i když jsou známy výjimky z tohoto pravidla) [5] [6] .
Kruhové plazmidy mohou mít více než jednu topologickou konfiguraci, což je zajištěno poměrem opačného působení DNA gyráz a topoizomeráz . Plazmidová DNA je obvykle ve formě kovalentně uzavřeného superšroubovicového kruhu. Pokud se jeden z řetězců DNA zlomí, pak se nadšroubovicový plazmid rozvine do jednoduchého prstence, který během elektroforézy prochází agarózovým gelem pomaleji než nadšroubovicová forma . Pokud dojde k přerušení obou řetězců DNA, vytvoří se lineární forma. Kromě toho se díky homologní rekombinaci mohou plazmidové monomery spojovat do dimerů , které díky své větší velikosti procházejí v agarózovém gelu během elektroforézy pomaleji než monomery. K jejich elektroforetické separaci se využívá fenoménu různé rychlosti průchodu různých forem plazmidů agarózovým gelem při elektroforéze. .
Následující tabulka uvádí některé plazmidy a jejich hlavní fyzikální vlastnosti [3] .
Plasmid | Mistr | Velikost plazmidu (tisíc párů bází) |
Plazmidová geometrie | Počet kopií plazmidu na buňku |
---|---|---|---|---|
pUB110 | Bacillus subtilis | 2.3 | Prsten | 20-50 |
ColEl | Escherichia coli | 6.6 | Prsten | 10-30 |
lp25 | burgdorferi | 24.2 | Lineární | 1-2 |
pNOB8 | Sulfolobus sp.a (archaea) |
41.2 | Prsten | 2-40 |
F | Escherichia coli | 99,2 | Prsten | 1-2 |
SCP1 | coelicolor | 350,0 | Lineární | čtyři |
pSymA | Sinorhizobium meliloti | 1354,2 | Prsten | 2-3 |
Aby byl plazmid replikovatelný, musí obsahovat následující prvky:
Počet míst ori se liší. Plasmid ColE1 má jeden a R6K tři. Zpravidla platí, že pokud je několik ori, jedno funguje převážně a zbytek je rezervován pro případ poškození hlavního. Většina plazmidů má v blízkosti ori repetitivní sekvence , které jsou nezbytně nutné pro fungování počátku [7] .
Geny rep kódují proteiny (Rep), které se podílejí na zahájení replikace plasmidu vazbou na ori. Hlavní část genů, jejichž produkty se podílejí na všech fázích replikace plazmidu, se však nachází v genomové DNA bakterie. Proteiny Rep různých plazmidů mají různé aminokyselinové sekvence a struktury, ale sekvence proteinů Rep malých plazmidů pPF1, pGL3, pPBS1, pBLX a pPB1 jsou z 98 % identické. Existují plazmidy zcela bez rep genů [7] .
Cop lokus obsahuje jeden nebo dva geny, které negativně ovlivňují počet kopií plazmidu v buňce. V tomto lokusu bylo nalezeno pět repetic, podobných těm poblíž počátku replikace. Protein repE se váže na tyto repetice, díky čemuž nemůže interagovat s ori, což brání zahájení replikace. Geny Par (z anglického partition ) jsou zodpovědné za distribuci kopií plazmidu mezi dceřinými buňkami během dělení mateřské buňky. V F-plazmidu se lokus skládá z přibližně 3 tisíc bp. a obsahuje dva geny: parA a parB a proteinový produkt genu parB hraje pomocnou roli. Determinanty ccd jsou v podstatě toxin-antitoxinový systém , který způsobuje, že buňky, které nedědí plazmid po dělení, odumírají. Různé plazmidy mohou kromě zmíněných [7] obsahovat i jiné strukturní geny .
Jak bylo uvedeno výše, důležitou vlastností plazmidů je jejich schopnost autonomní replikace, do určité míry pod kontrolou bakteriálního chromozomu. Mechanismy této kontroly jsou podrobněji diskutovány níže.
V replikaci plazmidu existují 3 fáze:
Vzhledem k tomu , že DNA polymeráza nemůže zahájit replikaci de novo , tedy od nuly, je k zahájení její práce zapotřebí primer . Tento problém se řeší následujícími způsoby:
Nejčastěji je iniciace katalyzována několika iniciačními proteiny kódovanými plazmidem, které rozpoznávají specifické místo na DNA plazmidu a tak určují počátek replikace ( ori ). V některých případech se tyto proteiny také přímo podílejí na tvorbě primeru. Mohou také hrát roli vodících proteinů při sestavování plazmidového replikomu [8] .
Prodlužování je obvykle prováděno holoenzymem DNA polymerázy III (v některých případech, v časném stadiu, DNA polymerázou I ) za účasti některých proteinů hostitelské buňky, které jsou součástí replikomu [8] .
Pokud je plazmid obsažen v buňce ve velkém počtu kopií, pravděpodobně se během dělení přenese do všech dceřiných buněk. Počet kopií plazmidů, které mohou být obsaženy v jedné buňce, je však stále omezený. Zdvojení plazmidu je pro buňku z metabolického hlediska velmi nákladné, takže pokud budou náklady obzvláště vysoké, přirozený výběr sníží počet plazmidů [9] .
Mechanismy řízení replikace fungují ve fázi zahájení replikace. Tyto mechanismy udržují určitou frekvenci replikačních cyklů na plazmid v dané buňce a jsou schopny snímat odchylky od této frekvence [8] . Kontrolní systémy zajišťují udržení určitého počtu plazmidů v bakteriální populaci. Molekuly, které jej přímo implementují, mohou být:
Iterony jsou krátké (17–22 bp) repetitivní sekvence DNA umístěné blízko počátku replikace plazmidu. Protein RepA se váže na iterony. Pokud je v buňce více než jedna kopie plazmidu, RepA se také váže na druhou kopii. V důsledku toho jsou dva plazmidy navázány na sebe, což zabraňuje jejich duplikaci [11] .
Antisense RNA regulují replikaci například plazmidu R100. Protein RepA v tomto případě působí jako pozitivní regulátor replikace, protože je nezbytný pro její iniciaci. Exprese RepA je pod kontrolou antisense RNA CopA, která se váže na mRNA RepA a potlačuje její translaci . Kromě toho je transkripce genu repA potlačena proteinem CopB. Když plazmid poprvé vstoupí do buňky, CopB tam není a začne exprese RepA a replikace plazmidu. Postupně se však začíná exprimovat CopB, což inhibuje další replikaci [12] [13] .
Některé proteiny, které iniciují replikaci plasmidu, tak mohou učinit pouze jednou. Po zahájení replikace plazmidu pT181 tedy iniciační proteiny Rep tvoří dimery RepC/RepC a po ukončení replikace jeden z monomerů podléhá posttranslačním modifikacím , které jej činí nefunkčním [14] .
Některé plazmidy, jako je ColE1, exprimují inhibitor své vlastní replikace. Koncentrace inhibičního proteinu v buňce přímo závisí na počtu kopií plazmidů, inhibuje tedy počet plazmidů v buňce [14] .
Tento mechanismus, který je doprovázen tvorbou tzv. theta struktury , je dobře znám u gramnegativních bakteriálních plazmidů , ačkoli takový mechanismus byl popsán také u grampozitivních bakteriálních plazmidů: plazmidy streptokoků / enterokoků z rodiny Inc18, některé laktokokové replikony a v alespoň jednom plazmidu Bacillus subtilis .
Replikace mechanismem theta zahrnuje následující kroky:
Theta replikace může začít současně z jednoho nebo více bodů a může být jednosměrná nebo obousměrná. V elektronovém mikroskopu vypadá replikační struktura jako řecké písmeno Θ ( theta ), proto se nazývá struktura theta. Pokud speciální enzymy naruší tuto strukturu v místě počátku replikace, získá se struktura ve tvaru Y („vidlička“). Replikační struktury lze také určit jedno- nebo dvourozměrnou elektroforézou . Tato analýza umožňuje stanovit povahu replikačních spojení, směr replikace, počáteční a koncové body replikace, úhel mezi vedoucím a opožděným řetězcem [8] .
Až na vzácné výjimky vyžadují plazmidy typu theta plazmidem kódovaný Rep iniciační protein. Některé replikony v raných fázích replikace také vyžadují DNA polymerázu I hostitelské buňky [8] .
Replikace mechanismem nahrazení řetězceNejznámějším příkladem plazmidů s replikací nahrazující vlákno je rodina plazmidů IncQ, jejímž prototypem je plazmid RSF1010. Členové této rodiny vyžadují pro replikaci 3 proteiny kódované plazmidem. Tyto proteiny spouštějí iniciaci replikace na každém ze dvou symetricky umístěných počátků replikace, jeden na každém řetězci DNA [8] .
Podstatou mechanismu výměny řetězce je, že nově syntetizovaný řetězec DNA, komplementární k jednomu z rodičovských řetězců, vytěsní jeden z nich. Výsledkem je vytvoření jednovláknové kruhové DNA (vytěsněné rodičovské vlákno) a nadšroubovicové dvouvláknové DNA (zbývající rodičovské vlákno a podřízené vlákno vzájemně komplementární). Následně je obnovena dvouvláknová struktura jednovláknové kruhové DNA [8] .
Rolling ring replikaceMnoho malých (méně než 10 tisíc bp) bakteriálních a archaálních plazmidů, stejně jako některé bakteriofágy (například M13 E. coli phage ) používají rotující kruhovou replikaci (unwinding roll, neboli replikaci typu σ [15] ) . Tento mechanismus je běžný zejména mezi plazmidy grampozitivních bakterií [16] .
Podstata tohoto mechanismu je následující. Zpočátku iniciátorový protein Rep způsobí jednovláknový zlom ve vláknu DNA. Výsledná volná 3'-OH skupina slouží jako primer pro syntézu DNA DNA polymerázou III hostitelské buňky. Na tomto procesu se podílejí i další proteiny hostitelské buňky, například helikáza a protein, který se váže na jednovláknovou DNA . Takto se syntetizuje vedoucí vlákno a obnoví se dvouvláknová struktura původní DNA. V tomto případě je řetězec DNA obsahující zlom odstraněn a je replikován DNA polymerázou III, doprovázenou vytvořením primeru RNA polymerázou . Po kompletní replikaci DNA polymeráza I nahradí primer DNA a DNA ligáza spojí konce, čímž vytvoří konečnou dvouvláknovou DNA [8] [17] .
Replikace lineárních plazmidůDNA polymerázy nemohou syntetizovat řetězec DNA bez krátkého primeru RNA - primeru. Pro syntézu vedoucího řetězce je potřeba pouze jedno semeno, kterým začíná zdvojení, pokračující až na samotný konec molekuly. Zaostávající řetězec je syntetizován diskontinuálně: pro syntézu krátkých fragmentů Okazaki je potřeba pokaždé nové semeno. Při zdvojování lineárních plazmidů dosáhne replikace vedoucího vlákna svého konce, ale zdvojení zaostávajícího vlákna není dokončeno: primer RNA nelze syntetizovat striktně na 3' konci vlákna. Stejný problém čelí lineárním bakteriálním chromozomům. Různé bakterie našly různé způsoby, jak tento problém vyřešit. U borelií jsou konce obou řetězců vzájemně kovalentně spojeny a tvoří malé vlásenky . Taková pseudokruhová struktura prochází typickou obousměrnou replikací. Výsledná kruhová struktura je speciálními enzymy rozřezána na dva lineární plazmidy a na jejich koncích se vytvoří vlásenky. U Streptomyces je speciální protein TP spojen s 5' konci DNA (z anglického terminální protein - terminální protein). Během replikace zaostávajícího řetězce tvoří TP speciální sekundární struktury v oblasti nezdvojených oblastí díky invertovaným repeticím v nich obsaženým [18] .
Mnoho plazmidů nezpůsobuje znatelné změny ve fenotypu svých hostitelů, v takovém případě se nazývají kryptické. Jiné jsou naopak zodpovědné za to, že se v hostitelské buňce projeví vlastnosti, které jí pomáhají přežít v určitých podmínkách prostředí a bez těchto plazmidů by bakterie zemřely nebo by se zpomalil jejich růst [19] .
Plazmidy mohou v bakteriální buňce vykonávat různé funkce. Nejvíce studované plazmidy obsahují geny antibiotické rezistence . Říká se jim R-plasmidy , nebo R-faktory (z anglického resist - resist) [20] . Samotné geny rezistence jsou velmi rozmanité, od plasmidem kódovaných β-laktamáz , které ničí penicilin , až po membránové proteiny , které brání hromadění tetracyklinu v buňkách. Kvůli rychlému šíření plazmidů rezistence v bakteriálních populacích se problém rezistence na antibiotika stává stále aktuálnější. Bakterie mohou získat rezistenci k několika antibiotikům současně díky několika plasmidům chránícím proti různým antibiotikům nebo díky jednomu plasmidu obsahujícímu geny pro rezistenci k různým antibiotikům. Důležitou roli při tvorbě plazmidů nesoucích geny antibiotické rezistence hrají transpozony , které usnadňují přenos genů z jednoho plazmidu do druhého nebo z bakteriálního chromozomu do plazmidu [21] . R-faktor se přenáší během transdukce a normálního buněčného dělení. Některé R plazmidy mohou být přeneseny bakteriální konjugací , tj. jsou konjugativní. Přenos R-plasmidů mezi bakteriemi různých druhů, rodů a dokonce i čeledí je možný . RP 1 , plazmid zodpovědný za rezistenci vůči ampicilinu , tetracyklinu a kanamycinu u bakterií rodu Pseudomonas z čeledi Pseudomonadaceae , lze tedy přenést do E. coli patřící do čeledi Enterobacteriaceae [22] .
Mnoho plazmidů obsahuje geny kódující proteiny s antimikrobiálními vlastnostmi, které jsou obvykle škodlivé pouze pro blízce příbuzné organismy. Například některé kmeny E. coli produkují proteiny, které zabíjejí buňky jiných kmenů E. coli . Tyto proteiny se nazývají koliciny a kmeny schopné jejich tvorby se nazývají kolicinogenní. Geny kolicinu jsou umístěny na plazmidech (Col-plazmidy) a tytéž plazmidy obsahují geny, které chrání buňky, které je produkují, před koliciny [23] . Některé bakterie kódují proteiny, které jsou toxické pro nebakteriální organismy. Enteropatogenní kmeny E. coli mají tzv. Ent plazmidy kódující enterotoxiny [24] . Řada grampozitivních ( Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes atd.) a gramnegativních ( Pseudomonas aeruginosa , P. morgani , E. coli atd.) bakterií má Hly-plazmidy, které se také nazývají plazmidy hemolytické aktivity. Nesou geny pro toxické hemolysinové proteiny schopné lyzovat membrány zvířecích a lidských erytrocytů [25] .
U některých patogenních bakterií jsou geny kódující toxiny , které působí na hostitelský organismus, umístěny na plasmidech. Kvůli takovým plasmidům mohou některé kmeny E. coli způsobit onemocnění podobné choleře . E. coli vylučují LT toxiny podobné toxinu cholery , ale u Vibrio cholerae je gen kódující toxin lokalizován v profágu a ne v plazmidu [26] . Plazmidy často kódují proteiny, které jsou nezbytné pro virulenci patogenních bakterií nebo ji zesilují. Takový plazmid existuje například u druhů rodu Yersinia , včetně Yersinia pestis , původce moru . Plazmid obsahuje geny, které kódují proteiny, které bakterii umožňují vstřikovat do imunitních buněk látky , které je narušují nebo dokonce zabíjejí [27] . Řada patogenních bakterií, jako jsou některé patogenní kmeny E. coli , má antigenní kolonizační plazmidy , které obsahují geny odpovědné za syntézu antigenu [28] .
Bakterie, které způsobují onemocnění rostlin , mají specifické plazmidy , jako je Agrobacterium tumefaciens , které způsobují nádorové útvary zvané hálky . Patogenní kmeny této bakterie nesou T-plazmid neboli Ti-plazmid (z anglického tumor inducing - „způsobující tumor“) a část tohoto plazmidu je přenesena do rostlinných buněk . U bakterií fixujících dusík, které způsobují kořenové uzliny luštěnin (např. Rhizobium ) , jsou geny potřebné pro nodulaci a fixaci dusíku na plasmidech [27] .
Plazmidy často poskytují svému majiteli nové metabolické cesty . Například schopnost fermentovat laktózu může být přenesena spolu s plasmidy. V tomto ohledu je laboratorní diagnostika bakterií na základě jejich specifických biochemických vlastností velmi obtížná. Například biochemicky patogenní zástupce rodu Salmonella z nepatogenních kmenů E. coli lze odlišit právě podle schopnosti fermentovat laktózu. Plazmidy mohou obsahovat geny zodpovědné za fermentaci jiných cukrů , jako je sacharóza , hydrolýza močoviny nebo tvorba sirovodíku [10] .
Geny obsažené v plazmidech mohou umožnit jejich vlastníkům zničit potenciálně toxické sloučeniny. Například Pseudomonas putida má plazmid pWWO obsahující geny pro řadu enzymů, které převádějí cyklické uhlovodíky toluen a xylen na benzoát . Obsahuje také operon zodpovědný za destrukci benzoátu na metabolity, které mohou být použity v biosyntetických procesech nebo pro energii . Proto může Pseudomonas putida růst za podmínek, kdy je toluen jediným zdrojem uhlíku . Schopnost bakterií degradovat sloučeniny škodlivé pro životní prostředí je základem bioremediace [29] .
V následující tabulce jsou uvedeny příklady jednotlivých přírodních plazmidů a funkcí, které plní [19] :
Plasmid | Mistr | Velikost plazmidu (tisíc párů bází) |
Známá funkce |
---|---|---|---|
pT181 | Staphylococcus aureus | 4.4 | Rezistence na tetracyklin |
ColEl | Escherichia coli | 6.6 | Tvorba kolicinu a odolnost vůči němu |
pMBl | Escherichia coli | 8.5 | Restrikčně-modifikační systém |
pAMpi | faecalis | 26.0 | Rezistence na erythromycin |
pSK41 | Staphylococcus aureus | 46.4 | Vícenásobná udržitelnost |
pBM4000 | Bacillus megaterium | 53,0 | rRNA operon |
pl258 | Staphylococcus aureus | 28,0 | Odolnost vůči iontům těžkých kovů |
pSLT | Salmonella enterica sv. Typhimurium | 93,9 | Determinant virulence |
pMT1 | Yersinia pestis | 101,0 | Determinant virulence |
pADP-1 | Pseudomonas sp. | 108,8 | Katabolismus atrazinu ( herbicid ) |
pWW0 | Pseudomonas putida | 117,0 | Degradace aromatických uhlovodíků |
pX01 | Bacillus anthracis | 181,7 | Syntéza enterotoxinů |
pSOL1 | Clostridium acetobutylicum | 192,0 | Tvorba rozpouštědla |
pSymB | Sinorhizobium meliloti | 1683,3 | Více funkcí |
Plazmidy mohou být získány bakteriální buňkou přímým kontaktem s jinou buňkou (konjugace) nebo zachyceny z prostředí (transformace) [30] .
Hlavní metodou získávání plazmidů z bakterií je konjugace. Tento proces popsali v roce 1946 E. Tatum a J. Lederberg u E. coli , později byla konjugace objevena u dalších bakterií, včetně Proteus , Klebsiella , Shigella , Salmonella a Pseudomonas [31] . Kontakt mezi dvěma buňkami je zprostředkován plazmidově specifickými pohlavními pili . Plazmidy, které zahajují konjugaci pro své vlastní šíření, se nazývají konjugativní. Při přesunu z jedné buňky do druhé si s sebou někdy vezmou nekonjugativní plazmidy nebo kopii genomové DNA. Obecné schéma procesu konjugace je následující. Mezi bakteriemi je navázán kontakt pomocí dutých proteinových pili. Řetězce DNA plazmidu v donorové buňce jsou odděleny, jeden z nich je přenesen do buňky příjemce, poté jsou komplementární řetězce dokončeny na obou jednoduchých řetězcích a plazmidy se opět stávají dvouvláknovými [32] .
Nejznámějším konjugativním plazmidem je F-plazmid nebo F-faktor. F plazmid je epizom dlouhý asi 100 kb. Má svůj vlastní počátek replikace ( oriV ) a bod přerušení ( oriT ) [33] . F-plazmid, stejně jako všechny konjugativní plazmidy, kóduje proteiny, které zabraňují připojení pili jiných bakterií na buněčnou stěnu tohoto. Kromě jiné genetické informace nese F-plazmid lokusy tra a trb organizované do jednoho operonu. Geny v nich obsažené jsou zodpovědné za různé aspekty procesu konjugace: syntézu pilinu a sestavení pohlavních pili, zahájení a regulaci procesu přenosu genetického materiálu, přerušení lokusu oriT a rozvázání řetězce DNA [ 34] [35] . Tra lokus je také přítomen v jiných konjugativních plazmidech podobných F; obsahuje počátek konjugačního přenosu a 20 genů kódujících proteiny nezbytné pro konjugaci [36] . Je zvláštní, že plazmidy podobné F, jako je R100, R6-5, R1 a ColV2, inhibují přenos plazmidu F [37] . Známá je i tzv. letální zygóza, která spočívá v tom, že počet životaschopných transkonjugátů se při smíchání početně převažujících dárcovských buněk ve srovnání s počtem buněk příjemce snižuje v důsledku tvorby četných můstků přenosu DNA k jednomu příjemci. buňka [38] .
Transformací se rozumí příjem plazmidové DNA buňkou z vnějšího prostředí (celkem všech plazmidů umístěných na určitém místě se nazývá plazmid ). Transformace byla popsána u grampozitivních i gramnegativních bakterií, zejména u zástupců rodů Streptococcus , Hemophilus , Neisseria , Bacillus , aktinomycetes , sinic a dalších. Aby DNA pronikla do bakteriální buňky, musí být buňka ve stavu kompetence , to znamená, že její obaly se musí stát propustnými pro velké molekuly DNA. V laboratoři se kompetentní buňky získávají ve stresu: působením chloridu vápenatého nebo pomocí elektroporace . U některých bakterií je ukázána transformace in vivo, například u Streptococcus pneumoniae v těle infikovaného zvířete. Některé bakterie přijímají DNA jakéhokoli původu, zatímco jiné, jako například Hemophillus , mohou přijímat pouze svou vlastní DNA. Po vstupu do bakteriální buňky je jeden z řetězců plazmidové DNA odštěpen a jednořetězcový fragment je fyzicky spojen s DNA příjemce [39] .
Plazmidy se vyznačují nestabilitou. Vlastnosti, které definují, mizí z populací mnohem častěji, než kdyby za tím byl normální proces akumulace mutací . Některé plazmidy jsou stabilnější než jiné a přirozené plazmidy jsou mnohem stabilnější než ty uměle vytvořené. Stabilita plazmidu je ovlivněna jeho integritou, schopností přenosu během dělení a rozdílnou rychlostí růstu. Plazmidy často ztrácejí některé ze svých genů, protože obsahují rekombinační aktivní body . Když dojde k rekombinaci mezi opakujícími se oblastmi, často dochází k inverzím a delecím [40] .
Pro udržení plazmidu v bakteriální populaci musí být během dělení předán dceřiným buňkám. Plazmidy s vysokým počtem kopií jsou obvykle náhodně distribuovány mezi dceřiné buňky. Identické plazmidy však často tvoří během replikace a rekombinace multimerní struktury. Protože dvouplazmidový dimer obsahuje dvě replikační ori, je jeho replikace účinnější než replikace monomeru a multimery se replikují ještě rychleji. Nakonec se může objevit tzv. „dimerová katastrofa“: téměř všechny plazmidy jsou součástí dimerů a multimerů, což brání jejich přenosu při buněčném dělení. Některé plazmidy se však mohou vrátit do svého normálního, monomerního stavu. Plazmid ColE1 tedy obsahuje místo cer , na které působí proteiny XerC a XerD. Dochází k místně specifické rekombinaci , která převádí dimer na dva monomery. Plazmidy s nízkým počtem kopií se nemohou spoléhat na náhodnou distribuci mezi sousedními buňkami, proto mnohé z nich obsahují toxin-antitoxinový systém , který zajišťuje destrukci buněk, které při dělení plazmid ztratily [41] .
Někdy se rychlost růstu buněk obsahujících plazmid a buněk, které jej neobsahují, liší. Rozdíl ve výšce může souviset s metabolickými rysy vyplývajícími z potřeby duplikovat plazmid a exprimovat jeho geny. U většiny přirozených plazmidů jsou tyto náklady malé a pravděpodobně nemají významný vliv na rychlost růstu. Umělé plazmidy jsou přitom v buňkách často přítomny v obrovském počtu kopií a jejich geny jsou aktivně exprimovány, proto je u buněk obsahujících umělé plazmidy obzvláště akutní problém jejich nestability [42] .
Plazmidy se vyznačují fenoménem nekompatibility: často dva specifické plazmidy nemohou koexistovat současně v jedné buňce. Nekompatibilní plazmidy zpravidla obsahují homologní sekvence. Nekompatibilita však může být způsobena také přítomností transposonů a dalších genetických prvků v plazmidu, které jej činí nestabilním. Všechny v současnosti známé plazmidy byly rozděleny do 30 skupin inkompatibility: plazmidy v rámci jedné skupiny jsou vzájemně nekompatibilní, ale kompatibilní s plazmidy z jiných skupin. Rozšířená je však tzv. atypická inkompatibilita, kdy jsou některé plazmidy nekompatibilní nejen s plazmidy z vlastní skupiny nekompatibility, ale i s některými plazmidy z jiných skupin [43] .
Existuje několik modelů nekompatibility plazmidů. Byla navržena hypotéza, že plasmidy soutěží o místa připojení na buněčné membráně . Vzhledem k tomu, že plazmidy ze stejné skupiny nekompatibility se připojují k membráně na stejných místech, budou se navzájem vytlačovat. Podle jiné hypotézy plazmidy kódují nějaký represorový protein, který inhibuje replikaci plazmidů ze stejné skupiny nekompatibility. Tato hypotéza získala určité experimentální potvrzení [43] .
Existují důkazy, že repetice umístěné v blízkosti počátku replikace se podílejí na vzniku nekompatibility. Navíc může jeden plazmid potlačit jiný pomocí nekódující RNA [43] .
Přestože replikace plazmidu je řízena jejich vlastními proteiny a RNA, hostitelská buňka také přispívá k regulaci počtu kopií plazmidu [14] . Žádný ze známých plazmidů neobsahuje kompletní sadu genů nezbytných pro jeho replikaci. Například replikace F-plazmidu vyžaduje DNA polymerázu III hostitelské buňky a genové produkty dnaB , dnaC a dnaA , které jsou lokalizovány v genomové DNA. Plazmid RK2 se zdvojnásobí, když se na jeho DNA naváže proteinový produkt genu dnaA a buněčná membrána [44] .
Podle schopnosti replikovat se v buňkách jiných bakterií se plazmidy dělí na plazmidy s úzkým hostitelským rozsahem (schopné replikace pouze v buňkách určitého druhu) nebo širokým hostitelským rozsahem (replikace mimo daný druh) [45] . Například plazmid NP1-1 se normálně replikuje v buňkách Pseudomonas aeruginosa , ale u jiných bakterií je tento proces obtížný. Některé plazmidy mohou existovat v buňkách mnoha typů bakterií; takové plazmidy zahrnují například pC194, pMV158, pM3 a pMT2. Důvody, proč se plazmid nemůže duplikovat v buňkách některých bakteriálních druhů, jsou strukturální vlastnosti promotoru , neefektivní interakce iniciačního proteinu RepA s proteinem DnaA kódovaným genomovou DNA a bakteriální chaperony . Kromě toho vlastnosti ori ovlivňují omezení rozsahu hostitelů. Počet plazmidů může také záviset na typu hostitelské bakterie. Plazmid pER2 tedy existuje ve více kopiích v E. coli než v buňkách Corynebacterium . Množství plazmidu je také určeno růstovou fází , ve které se bakteriální kultura nachází. Počet plazmidů v logaritmické fázi růstu je větší než ve stacionární fázi, pravděpodobně kvůli akumulaci inhibitoru replikace v buňkách. Počet kopií některých plazmidů může být ovlivněn složením živného média , ve kterém bakterie rostou [44] .
Když se hostitelská buňka dělí, vícekopiové plazmidy jsou náhodně distribuovány mezi dceřiné buňky a pravděpodobnost, že jedna z dceřiných buněk neobdrží jedinou kopii plazmidu, je velmi malá. U plazmidů s nízkým počtem kopií je však otázka regulace jejich distribuce během buněčného dělení velmi akutní. Jak bylo zmíněno výše, (par) plasmidový separační systém , který obsahují, zahrnuje sadu genů, které zajišťují přesnou distribuci plasmidových kopií mezi dceřinými buňkami. Tento systém je samostatný, není připojen k replikaci a nemá vliv na počet kopií. Distribuce kopií plazmidu pSN19035 mezi dceřinými buňkami je však řízena oblastí SegB, jejíž jeden gen také ovlivňuje počet kopií plazmidu. U plazmidů F a R1 se ukázalo, že proteiny, které regulují distribuci plazmidů během dělení, mohou potlačit svou vlastní transkripci mechanismem negativní zpětné vazby . Je možné, že nadměrná koncentrace těchto proteinů blokuje správnou distribuci plazmidů. Tyto proteiny mohou vytvářet struktury podobné vláknům , které „tlačí“ kopie plazmidů do různých dceřiných buněk bez účasti proteinů membránových receptorů hostitelské buňky [46] .
Toxinovo-antitoxinový systém se podílí na udržování plazmidů v buňce. V nejjednodušším případě je reprezentován dvěma geny v oblasti ccd, z nichž jeden buňku zabíjí a nazývá se toxin a druhý ji potlačuje a nazývá se antitoxin a toxin je mnohem stabilnější než antitoxin. Pokud během dělení jedna z dceřiných buněk nezdědí plazmidy se systémem toxin-antitoxin, pak antitoxin, který se do ní dostal, bude zcela zničen dříve než toxin, který v nepřítomnosti antitoxinu způsobí buněčnou smrt [47] .
Důležitou variantou toxin-antioxinového systému jsou restrikčně-modifikační systémy , které jsou zdrojem restrikčních enzymů používaných v genetickém inženýrství [48] [49] . Úlohu toxinu v systémech plní restrikční enzym , který rozpoznává určité sekvence DNA. Pokud sekvence neobsahuje methylové zbytky, které blokují působení restrikčního enzymu, zavádí dvouvláknový zlom, který vede k degradaci cílové DNA. Methyláza , která rozpoznává stejnou sekvenci jako restrikční enzym, působí jako antitoxin a blokuje aktivitu restrikčního enzymu. Kromě úlohy udržování plazmidu plní restrikční modifikační systémy ochrannou funkci proti cizí DNA, zejména bakteriofágům [50] .
Ve druhé dekádě 21. století existuje několik klasifikačních systémů pro plazmidy, které berou v úvahu jejich rozdíly v topologii, replikačních vlastnostech, schopnosti nebo neschopnosti vyvolat přenos genetického materiálu, přítomnosti nebo nepřítomnosti faktorů rezistence na antibiotika a jiné vlastnosti. Nejdůležitější vlastností plazmidu je jeho schopnost (nebo neschopnost) být přenesen z jedné bakteriální buňky do druhé během konjugace. Přenosné plazmidy se nazývají konjugativní. Plazmidy, které samy o sobě nemohou být přeneseny mezi buňkami, to někdy dělají, zachycovány konjugativními plazmidy. Mezi konjugativními plazmidy jsou plazmidy, které obsahují pouze přenosové replikační geny, a konjugativní kointegrační plazmidy, které kromě přenosových a replikačních genů obsahují geny odpovědné za některé fenotypové znaky. Kointegrativní plazmidy zahrnují plazmidy R, plazmidy Col, které dávají kmenům E. coli schopnost tvořit a sekretovat koliciny, plazmidy Hly obsahující geny pro hemolysin a plazmidy Ent zodpovědné za syntézu enterotoxinů [51] .
Kromě toho je rozšířená klasifikace založená na vlastnosti kompatibility/nekompatibility plazmidů. Známé plazmidy byly rozděleny do několika skupin, takže bakterie jedné skupiny jsou vzájemně nekompatibilní, ale kompatibilní s jakýmkoli plazmidem z jiné skupiny nekompatibility [52] .
Jak je uvedeno výše, podle počtu kopií na buňku se plazmidy dělí na plazmidy s nízkým počtem kopií a plazmidy s vysokým počtem kopií. Plazmidy jsou také klasifikovány podle toho, zda je jejich rozsah hostitelů úzký nebo široký [52] .
Mezi eukaryoty byly plazmidy nalezeny v houbách . Plísňové plazmidy jsou reprezentovány lineárními nebo kruhovými molekulami DNA, které mohou být lokalizovány v buněčném jádře , cytoplazmě, ale většina z nich se nachází v mitochondriích a nezpůsobují fenotypové změny. Mezi plísňové plazmidy patří:
Plazmidy posledních dvou skupin se objevují během procesu stárnutí . Plazmidy byly identifikovány v houbách, jako jsou kvasinky Saccharomyces cerevisiae , Neurospora , Aspergillus niger a Kluyveromyces lactis . Plísňové plazmidy mohou být přenášeny myceliálními anastomózami (horizontálně) a konidiemi (vertikálně) [53] .
V roce 1968 E. Meynell a spoluautoři předložili hypotézu, že první fází evoluce plazmidů byl vznik primitivního replikonu , který by mohl autonomně existovat mimo chromozom. Replikon mohl pocházet z nukleoidní DNA nebo se vyvíjet z extrachromozomální struktury, jako je centrosom , protože v té době bylo považováno za možné, že by mitóza mohla existovat u bakterií v raných fázích jejich evoluce (tato hypotéza je v současné době považována za nesprávnou). V roce 1976 S. Cohen navrhl, že počátek replikace mohl vzniknout de novo z deoxynukleotidů a později se k němu připojily geny spojené se sebereplikací a geny kódující vše potřebné pro genetický přenos. Byla vyslovena hypotéza, že plazmidy pocházejí z opakujících se sekvencí bakteriální genomové DNA, které skončily v cytoplazmě v důsledku vzájemného křížení . Všechny výše uvedené hypotézy však nezískaly experimentální podporu [54] .
Následně vznikl názor na společný původ plazmidů a mírných bakteriofágů kvůli podobnosti v jejich organizaci. Plazmidy byly považovány za fágy postrádající geny kódující kapsidové proteiny , ale mající geny odpovědné za jejich duplikaci a distribuci do dceřiných buněk po dělení. Bakteriofágy N15 , øKO2 a PY54, podobné fágu lambda , který se stal zdrojem prvních vektorů , se tedy neintegrují do bakteriálního genomu, ale existují jako lineární plazmidy během lyzogenního cyklu [55] .
Přesvědčivé experimentální potvrzení získala teorie evoluce R-plasmidů poskytujících rezistenci na antibiotika. Vznikly z extrachromozomálních elementů nesoucích geny rezistence nebo je získaly v důsledku mutací. Když se tyto prvky spojily s transferovými faktory, vznikly konjugativní R plazmidy. Významnou roli v evoluci plazmidů sehrály transpozony, které změnily expresi určitých plazmidových genů [54] .
Využití plazmidů ve výzkumných aktivitách je obrovské. Umělé plazmidy se aktivně používají v genetickém inženýrství jako vektory, do kterých se vkládají cílové kódující oblasti [56] . Namnožením takových plazmidů v bakteriálních buňkách je možné produkovat obrovské množství požadovaného proteinu. V současnosti se tak například získává inzulín [57] . Umělé plazmidy, které jsou určeny pro použití jako vektory, jsou komerčně dostupné a vždy obsahují počátek replikace, geny propůjčující rezistenci k některému antibiotiku (pro selekci na antibiotickém médiu bakteriálních buněk, které přijaly plazmid) a několik míst rozpoznávaných různými restrikčními endonukleázami . . Inzerce fragmentu se provádí restrikcí plazmidu a fragmentu a následnou ligací . Fragmenty dlouhé až 15 kilobází mohou být vloženy do konvenčních vektorů. Jiné vektory se používají ke klonování větších fragmentů, jako jsou kosmidy (plazmidy obsahující lokus bakteriofága λ cos ), phasmidy , známé také jako fagemidy (plazmidy obsahující fágový počátek replikace f1 [58] ), bakteriální a kvasinkové umělé chromozomy [59] .
Plazmidové sekvence vytvořené různými výzkumníky lze nalézt ve veřejných databázích , jako je Addgene , BCCM/LMBP a databáze NCBI . K vytvoření umělých plazmidů s požadovanými vlastnostmi bylo vytvořeno mnoho bioinformatických programů a nástrojů. Pomocí nich můžete najít restrikční místa a získat plasmidové sekvence s inzerty, to znamená provést "virtuální klonování". Příklady takových nástrojů zahrnují ApE, Clone Manager , GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler , LabGenius, Lasergene, MacVector , pDraw32, Serial Cloner, SnapGene, VectorFriends, Vector NTI a WebDSV [60 ] .
Plazmidy jsou považovány za slibný nástroj pro genovou terapii , protože mohou exprimovat proteiny, které jsou v buňkách pacienta deficitní. Na plasmidech je možné do buněk dodat geny kódující nástroje pro editaci genomu, jako jsou nukleázy obsahující domény zinkových prstů a komponenty systému CRISPR /Cas: protein Cas9 a vodící RNA [61] [62] . .
Plazmidy, které umožňují bakteriím degradovat obtížně rozložitelné substráty, mohou být použity v bioremediaci . Plazmidy jsou široce používány při výrobě vakcín a nových léků , stejně jako při zvyšování produktivity organismů syntetizujících biologicky aktivní látky [63] .
V roce 1952 byl v E. coli objeven faktor F (nyní známý jako F-plazmid) , který se přenáší z buňky do buňky konjugací. Poté, v roce 1952, navrhl Joshua Lederberg termín „plazmid“ k označení faktoru F, u kterého již bylo možné prokázat jeho extrachromozomální povahu [64] . Zpočátku se tento termín používal k označení jakéhokoli bakteriálního genetického materiálu, který existuje extrachromozomálně alespoň po část svého replikačního cyklu, ale protože tento popis zahrnuje bakteriální viry, koncept plazmidu byl zpřesněn - jedná se o genetické prvky, které se replikují autonomně. z chromozomu [65] .
Následně byly plazmidy nalezeny v jiných typech bakterií. Objevila se jejich extrémní rozmanitost ve fyzikálních a molekulárních charakteristikách. Někteří vědci navrhli považovat plazmidy za symbiotické nebo parazitické intracelulární organismy. Koncem 50. let byla prokázána skutečnost přenosu antibiotické rezistence z jedné bakterie na druhou bez účasti nukleoidu. Tak byly objeveny R-plazmidy. V roce 1963 byla prokázána možnost rekombinace mezi extrachromozomálními elementy a nukleoidní DNA. V 80. letech 20. století byly popsány lineární plazmidy. Postupně začaly plazmidy nacházet uplatnění v molekulárně biologických metodách [66] .
Slovníky a encyklopedie | |
---|---|
V bibliografických katalozích |
|
Mikrobiologie : Bakterie | |
---|---|
Patogenní bakterie |
|
Lidská mikroflóra |
|
Specifičnost substrátu | |
Dech | |
Genetika a reprodukce | |
odpočinkové formy |
|
viz také |
nukleových kyselin | Typy||||
---|---|---|---|---|
Dusíkaté báze | ||||
Nukleosidy | ||||
Nukleotidy | ||||
RNA | ||||
DNA | ||||
Analogy | ||||
Vektorové typy |
| |||
|